全 文 ：基于生物素 -亲和素系统的
压电免疫传感器检测相思子毒素研究
穆晞惠 1, 2　周志强 1　童朝阳＊ 2　刘冰 2　郝兰群 2
1(中国农业大学应用化学系 ,北京 100094)　　2(北京防化研究院 , 北京 102205)
摘　要　利用生物素-亲和素系统的放大作用和纳米金质量扩增效应 , 建立了压电免疫传感器检测相思子毒
素的新方法。首先在石英晶体的金电极上依次组装二巯基丙酸 、EDC和 NHS进行表面修饰 , 然后通过亲和素
固定生物素标记相思子毒素多抗来制备敏感膜 ,利用纳米金的质量扩增效应设计了一种 “毒素-纳米金标记单
抗”复合物 ,成功实现了对相思子毒素的检测 , 提高了传感器灵敏度和重现性。本传感器对相思子毒素响应
的线性范围为 0.05 ～ 5 mg/L;回归方程为 Δf=50.81CAbrin+67.11(r=0.9903, n=10, P<0.0001);检测灵敏
度为 50.81Hz·L/mg。
关键词　压电免疫传感器 , 生物素-亲和素 , 相思子毒素
　 2009-01-19收稿;2009-04-27接受
本文系国家高新技术研究发展计划(No.2006AA04Z358)和国家自然基金(No.10774159)资助项目
＊ E-mail:zhaoyangtong@sohu.com
1　引　言
相思子毒素(Abrin)是从豆科植物相思子种子中分离的一种细胞毒蛋白 ,毒性超过蓖麻毒素 。其结
构 、作用机理与蓖麻毒素(Rcin)类似 ,中毒早期无特殊症状和病变 ,待发现症状后 ,已难以治疗[ 1 ～ 5] 。因
此 ,建立一种响应快速 、灵敏的检测方法极为必要。曾有人采用放射免疫 、酶联免疫检测等方法实现了
对相思子毒素的检测 ,但检测过程繁琐 、耗时。生物素-亲和素系统(Botin-avidinsystem, BAS)是一种生
物放大系统 ,具有灵敏度高 、特异性强以及简便 、经济 、快速等特点。本研究利用 BAS系统的放大作用
和高稳定结合性 、多克隆抗体的强富集力以及纳米金标记单克隆抗体的高度特异性 、质量扩增效应与压
电传感器芯片技术相结合 ,建立了一种可实时监控 、操作简单 、响应快速 、灵敏度高的检测方法 ,为临床
诊断 、环境监测 、食品卫生检验 、法医学鉴定及生物反恐等应用领域提供技术基础和参考依据。
2　实验部分
2.1　仪器与试剂
压电免疫传感器装置(自制)。Abrin标准品 、Abrin单抗和多抗 、生物素标记 Abrin多抗 、金标 Abrin
单抗 、纳米金溶胶均由本实验室制备;生物素化 N-羟基琥珀酰亚胺酯(BNHS)、聚乙二醇(PEG20000)、
3, 3′-二巯基丙酸(DDPA)、N-琥珀酰亚胺(NHS)、亲和素(Avidin)、1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)-碳二亚胺
(EDC)、乙醇胺均购自 Sigma公司;Piranha液(V(H2SO4)∶V(H2O)=3∶1);实验用水为二次蒸馏水。
2.2　实验方法
2.2.1　多抗的生物素化标记 、金标单抗制备及效价测定　参照文献 [ 6, 7] 制备生物素标记 Abrin多抗
和金标 Abrin单抗 ,用间接 ELISA法测定效价。
2.2.2　固定生物素标记 Abrin多抗　加入 100μL5 mmol/LDDPA于检测池中反应 0.5h;用水清洗后
加入 100μL100mg/LEDC和 100μL100mg/LNHS,反应 20min;清洗后加入 100μL100mg/L亲和素
反应 1h;清洗后加入 100μL1 mol/L乙醇胺反应 0.5h;清洗后加入 90μL0.01 mol/LTris-HCl缓冲液
(pH7.9),稳定后加入 10 μL生物素标记 Abrin多抗 ,至频率稳定 。
2.2.3　Abrin-金标 Abrin单抗复合物的制备 　将 10 μL250 mg/L金标 Abrin单抗加到 13.4 μL
70 mg/LAbrin溶液中(使 Abrin终浓度为40 mg/L),混匀 , 37 ℃反应 0.5 h, 4 ℃保存备用。
2.2.4　压电免疫传感器检测 Abrin方法的建立　用二次蒸馏水清洗固定多抗后的电极 ,加入 90 μL
第 37卷
2009年 10月　　　　　　 　　　　　
分析化学 (FENXIHUAXUE)　研究简报
ChineseJournalofAnalyticalChemistry 　　　　　　 　　　　　
第 10期
1499 ～ 1502
0.01mol/LPBS缓冲液(pH7.4);频率稳定后加入 10μL不同稀释度的 Abrin-金标 Abrin单抗复合物 ,
记录 10 min的频移值 ,此过程如图 1所示 。
　图 1　压电免疫传感器检测相思子毒素原理示意图
Fig.1　ModelofAbrindetectionbypiezoelectricimmunosensor
2.2.5　芯片再生　检测结束后 ,用热 Piranha液浸泡金电极 5min,用水反复清洗 ,晾干后即可重复使用。
2.2.6　Abrin模拟样品的测定　取土壤 、奶粉 、饼干样品各 1 g, 血液 5 μL,加稀释液 5 mL,搅匀;取自
来水和鲜牛奶样品 5mL,加入 13 μL1000 mg/LAbrin,制成模拟样品 。将以上样品以 3000 r/min离心
10 min,取上清液 45.8 μL, 加入 1μL250mg/L金标单抗溶液(Abrin终浓度为 2 mg/L)混匀 , 37 ℃反
应 0.5h,计算检测回收率及相对标准差等指标 。
3　结果与讨论
3.1　多抗与金标单抗的效价测定
制备的生物素标记 Abrin多抗与金标 Abrin单抗的效价分别约为 1∶2.5×106和 1∶6.3×105 , 与标
记前 Abrin多抗 、单抗效价基本相当 ,表明生物素 、纳米金标记抗体的方法对抗体活性无明显影响 。
3.2　生物素标记 Abrin多抗最适固定浓度的确定
通常 , 石英晶振金电极表面单位面积抗体固定量越大 ,能结合抗原的位点越多 ,越有利于提高传感
　图 2　生物素标记 Abrin多抗浓度与频移值的关系
Fig.2　Relationshipbetweenfrequencydecreaseand
concentrationofbiotin-labeledAbrinpolyclonalanti-
bodies(PcAb)
器的灵敏度 。结果(图 2)表明 ,随着生物素标记 Abrin
多抗浓度的增加 ,固定抗体引起的频移值逐渐增加 ,当
浓度为 10mg/L时频移值最高 ,继续增加抗体浓度 ,频
移值不再增加。可能是由于单位面积固定的抗体趋于
饱和所致。因此本实验中生物素标记 Abrin多抗最适固
定浓度选择 10mg/L。
3.3　不同粒径纳米金的质量扩增效应
为考察不同粒径纳米金的质量扩增效应 ,测定了不
同粒径纳米金标记的 Abrin单抗-Abrin复合物(Abrin终
浓度为 2 mg/L)引起的频移 。结果(图 3)表明 ,当粒径
在 10 ～ 40 nm时 ,粒径越大 ,频移越大 ,扩增效应越明
显;粒径大于 40 nm时 ,扩增效应逐渐减弱 。可能是由
于粒径大的纳米金质量大 ,引起的质量扩增效应明显;随着粒径进一步增大 ,空间位阻效应逐渐增强 ,阻
碍了后序复合物的结合 ,导致结合到电极表面的复合物数量相对减少 ,从而减弱其扩增效应。故选择
40 nm的纳米金制备复合物 。
1500　　 分 析 化 学 第 37卷
　图 3　纳米金粒径与检测频移值的关系
Fig.3　Relationshipbetweenfrequencydecreaseanddiame-
terofnanogold
3.4　传感器对 Abrin的响应
用本传感器测定不同浓度 Abrin-金标 Abrin
单抗复合物(浓度以 Abrin计),得相应的频移值
(Δf, 以 10 min内的频移为准 , n=6)。在 0.05 ～
5 mg/L范围内 , Abrin浓度与频移值呈良好的线性
关系(图 4),回归方程为 Δf=50.81CAbrin+67.11
(r=0.9903, n=10, P <0.0001), 灵 敏度为
50.81Hz·L/mg。
刘冰等[ 8]用自组装-纳米金-蛋白 A法固定抗
体检测与 Abrin结构类似的 Ricin灵敏度为
45.81Hz·L/mg,与之相比 ,本方法灵敏度略高。
　图 4　压电免疫传感器检测相思子毒素标准曲线
Fig.4　StandardcurveofAbrindeterminedbypiezoelectric
immunosensor
由于 1个亲和素分子可结合 4个生物素标记抗
体 。因此 ,本法有利于提高抗体的固定量和生物
活性 ,从而提高检测的灵敏度。
3.5　检出限 、重现性和稳定性
以 S/N>3作为判定阳性的标准 ,检出限为
0.05mg/L。选取浓度分别为 5.0, 2.0, 0.5和
0.25mg/L的 Abrin测定传感器检测的重现性 ,各
浓度重复测定 6次得到的响应频移值分别为
(315±5.5)Hz, (169±3.8)Hz, (103±3.3)Hz和
(88.3±4.1)Hz, RSD分别为 1.76%, 2.23%,
3.20%和 4.66%,具有较好的重现性 [ 9] ,可能与
生物素-亲和素具有较强的亲和力 (Ka =1 ×
10
15 L/mol)有关 ,反应平衡时间短 ,检测信号更稳
定 。固定多抗的传感芯片在 -20℃密封保存3个月 ,其活性未见明显降低 ,表明本芯片具有较好的储存
稳定性 。
3.6　响应特异性
以金标 Abrin单抗作为阴性对照 ,分别对 Abrin-金标 Abrin单抗复合物 、Ricin-金标 Abrin单抗复合
物和 SEB-金标 Abrin单抗复合物进行检测(毒素终浓度均为 2 mg/L),结果见表 1。可见 ,本传感器不
仅能将 Abrin与其它毒素区分开 ,而且能够有效识别结构上与之类似的 Ricin,表明本传感器具有很好
的响应特异性。
表 1　传感器的响应特异性
Table1　Responsespecificityofthesensor
检测目标Object
频移值Frequencydecrease(n=5)
相对标准差(%)Relativestandarddeviation
检测目标Object
频移值Frequencydecrease(n=5)
相对标准差(%)Relativestandarddeviation
相思子毒素Abrin 170±4.92＊＊, ■■ 2.9 蓖麻毒素Ricin 12±2.54＊＊ 21.2
葡萄球菌肠毒素BStaphylococalentero-toxinB(SEB) 8±1.14 14.2
阴性对照Negitivecontrol 7±0.84 12.0
注(note):与阴性对照比较(Comparetonegativecontrol), ＊＊ (P<0.01);与 Ricin比较(ComparetoRicin), ■■:(P<0.01)。
3.7　Abrin模拟样品的测定
采用本方法对水样 、土样 、食品 、血液等人工模拟样品进行了分析(见表 2 )。结果表明 ,本方法具
有较好的回收率和重现性 。
1501第 10期 穆晞惠等:基于生物素-亲和素系统的压电免疫传感器检测相思子毒素研究 　　
表 2　Abrin模拟样品的测定
Table2　DeterminationofthesimulatedAbrinspecimens
样品Specimens
实际值Practical(mg/L)
测定值Determined(mg/L)
回收率Recoveryratio(%)
相对标准差Relativestandarddeviation(%)
水样 Water 2 1.95±0.08 97.5 4.10
土壤 Soil 2 1.90±0.11 95.0 5.79
奶粉 Milkpowder 2 1.85±0.09 92.5 4.86
鲜牛奶 Freshmilk 2 1.86±0.11 93.0 5.91
饼干 Biscuit 2 1.80±0.08 90.0 4.44
血液 Blood 2 1.82±0.07 91.0 3.85
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DetectionofAbrinbyPiezoelectricImmunosensor
BasedonBiotin-AvidinSystem
MUXi-Hui1 , 2 , ZHOUZhi-Qiang1 , TONGZhao-Yang＊2 , LIUBing2 , HAOLan-Qun2
1(DepartmentofAppliedChemistry, AgriculturalUniversityofChina, Beijing100094)
2(BeijingResearchInstituteofChemicalDefence, Beijing102205)
Abstract　AnovelapproachforAbrindetectionbypiezoelectricimmunosensorhasbeendevelopedbasedon
theamplificationefectofbiotin-avidinsystem(BAS)andthemassmultipliedefectofnano-goldparticles.
TheAuelectrodeofthepiezoelectricquartzcrystalwasfirstlymodifiedwith3 , 3-dithiodipropionicacid
(DDPA), activatedby1-ethyl-3(3-dimethyl-aminopropyl)-carbodimidehydrochloride/N-hydroxy-succini-
mide(EDC/NHS), andtheavidincovalentlyatachedtothebiotinlabeledAbrinpolyclonalantibodies(PcAb)
wassuccesfulyimmobilizedtothesurface.Dependingonthemassmultipliedefectofnano-goldparticles,
the“Abrin-nano-goldlabeledmonoclonalantibody(McAb)” wasdesignedtoenhancetheresponsesignalsof
theimmunosensor, whichimprovedthesensitivityandrecurenceofthesensor.Thedetectinglinearrangeof
thepiezoelectricimmunosensorforAbrinis0.05-5mg/L.ThelinearregressionequationisΔf=50.81CAbrin+
67.11(r=0.9903, n=10, P<0.0001)withthesensitivityof50.81 Hz·L/mg.
Keywords　Piezoelectricimmunosensor, biotin-avidinsystem, Abrin
(Received19January2009;accepted27 April2009)
1502　　 分 析 化 学 第 37卷