全 文 ：[ 文章编号] 1000-8861(2007)05-0571-04
双抗体夹心生物素-亲和素 ELISA法检测相思子毒素
穆 惠 ,童朝阳＊ ,郝兰群 ,许秀玲 ,刘　冰 ,田艳慧(北京防化研究院 ,北京 102205)
[收稿日期] 2006-07-27;[ 修回日期] 2006-11-27
[作者简介] 穆 惠(1978-), 女, 黑龙江鸡西市人 ,研究实习员 ,学
士 ,主要从事生物检测技术方面的研究。(Tel)010-
66758322;(E-mail)zhaoyangtong@sohu.com
＊通讯作者
[ 摘　要] 　目的　建立相思子毒素(abrin)的酶联免疫检测方法 ,为 abrin 临床诊断 、中毒治疗 、法医学鉴定等应用领域提供
技术基础和参考依据。 方法　采用双抗体夹心生物素-亲和素 ELISA 法来检测微量 abrin。结果　该法检测 abrin 线性范围为
0.125～ 31.25μg L , 线性回归方程为 Y=0.52369X +0.51632(r=0.9816 , P<0.0001 , n=9),检测限为 0.125μg L。不同浓度蓖
麻毒素(ricin)、葡萄球菌肠毒素(SEB)对检测结果基本无干扰 , 表明该法检测 abrin 具有很好的特异性。该法能用于 abrin 毒素
污染水样 、土样 、食品 、血液等模拟样品的分析 , 相对标准差为 2.35%～ 4.14%, 具有较好的重现性。结论　成功建立了夹心
BA-ELISA法检测 abrin ,巧妙地将多克隆抗体的强富集能力 、单克隆抗体的特异性以及生物素-亲和素系统的放大作用结合起
来 ,达到了提高检测的灵敏度和特异性的目的 , 可适用于各种微量 abrin 样品的分析。
[ 关键词] 　相思子毒素;双抗体夹心法;生物素-亲和素;酶联免疫吸附试验
[ 中图分类号] 　R122.1+2　　　　[ 文献标识码] 　A
Assay of abrin by double antibody sandwich biotin-streptavidin ELISA
MUXi-hui , TONG Zhao-yang , HAO Lan-qun , XU Xiu-ling , LIU Bing , TIAN Yan-hui (Beijing Research Institute of
Chemical Defense , Beijing 102205 , China)
[ Abstract] 　Objective　To develop an ELISA for abrin determination and provide a technique reference for clinical diagnosis , toxicosis
treatment, and medical jurisprudence identification.Methods　A double antibody sandwich biotin-streptavidin ELISA (S-BA-ELISA)
procedure was used for abrin assay.Results　The detecting linear range for abrin was 0.125～ 31.25 μg L.The linear regression equation was
Y=0.52369X +0.51632(r = 0.9816 , P <0.0001 , n=9)with the detection limit of 0.125μg L.Ricin and staphylococcal enterotoxin B
(SEB)in different concentrations did not interfere the abrin assay by S-BA-ELISA , which demonstrated that the method had a good specificity.
This approach showed good reproducibility with relative standard deviation ranged from 2.35% to 4.14%, which could be used for analyzing
abrin-contaminated specimens such as water , soil , food , and blood , etc.Conclusion　 S-BA-ELISA was successfully developed to detect abrin.
This method combined the high affinity of polyclonal antibodies(PcAb), good specificity of monoclonal antibodies(McAb), and the amplification
effect of BAS (Biotin-avidin system), which greatly improved the sensitivity and specificity and could be suitable for trace abrin assay.
[ Key words] 　Abrin;Double antibody sandwich assay;Biotin-streptavidin;ELISA
　　相思子毒素是从豆科植物种子中分离的一种细
胞毒性蛋白 ,其毒性超过了蓖麻毒素 , 可以作为一
种潜在的生物毒素战剂被一些不法(恐怖)分子使
用 ,包括在食物 、水源进行投毒和发动恐怖袭击。相
思子毒素结构 、作用机理与蓖麻毒素类似 ,均由A ,B
两条链组成 ,由一个二硫键相连 , B链具有半乳糖凝
集活性 ,可与细胞膜上受体结合 ,帮助A链进入细胞
内 ,A链进入细胞催化 60S大亚基的 28S rRNA 的第
4324位脱去腺嘌呤而使 60S 核糖体亚基失活 ,从而
使细胞蛋白合成被抑制[ 1-10] 。相思子毒素没有特异
的化学基团和元素 ,一般的物理 、化学和生化方法很
难给予鉴别 ,中毒早期无特殊中毒症状和病变 ,待发
现中毒症状后 ,已难以治疗 ,侦检极为困难 ,对这类
毒素的检测只能依赖于抗原-抗体特异反应的免疫
学检测方法 ,但国内至今未有这方面的报道。因此 ,
建立一种灵敏度高 、特异性强的免疫检测方法 ,对于
应对有关相思子毒素的不法活动 、恐怖袭击及中毒
治疗极为必要。本研究利用多克隆抗体的强富集能
力 、单克隆抗体的高度特异性以及生物素-亲和素系
统的放大作用 ,巧妙设计了一种灵敏度高 、特异性强
的检测方法 ,为毒素临床诊断 、中毒治疗 、法医学鉴
定等应用领域提供技术基础和参考依据 。
1　材料与方法
1.1　试剂仪器　相思子毒素(abrin)标准品 、abrin单
克隆抗体和多克隆抗体 、生物素标记的 abrin单抗均
由本实验室制备 , 生物素化 N-羟基琥珀酰亚胺酯
·571·　免 疫 学 杂 志　第 23卷　第 5 期　2007年 9 月　　IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol.23 No.5 Sep.2007
DOI :10.13431/j.cnki.immunol.j.20070156
(BNHS)、辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(SA-
HRP)、底物 N-四甲基联苯胺(TMB)、牛血清白蛋白
(BSA)购自华美生物技术有限公司 , 680型酶标仪
(BioRad ,美国)。
1.2　单克隆抗体的生物素化标记方法　参照常规
方法[ 11-13] 。
1.3　生物素标记的 abrin单抗的效价测定方法　用
常规间接 ELISA法[ 14] ,并判断生物素化标记是否影
响抗体的活性。
1.4　夹心 BA-ELISA法
1.4.1　抗体包被　用 pH 9.6的 0.05 mol L碳酸盐
缓冲液将 abrin多抗稀释成浓度为 10 mg L包被酶标
板 ,每孔 0.1 mL。42 ℃孵育 5 h ,倒去包被液 , 用
PBS-T洗 3次 ,甩干。其中一孔不加包被抗体 ,作为
试剂空白 。
1.4.2　封闭　用 10 g L BSA-PBST 封闭板上的空白
位点 ,每孔 0.2 mL , 37℃孵育 1 h ,甩干 。
1.4.3　加待检样品　除试剂空白及另留 1排孔作
为阴性对照外 ,其余各孔加待测样品或倍比稀释的
标准品各 0.1 mL , 阴性对照孔加 0.1 mL 的 10 g L
BSA-PBS ,37 ℃孵育 1 h ,用 PBS-T洗 3次 ,甩干 。
1.4.4　加生物素化抗体　除试剂空白孔外 ,其余各
孔加生物素化抗体 0.1 mL , 37℃孵育 1 h ,用 PBS-T
洗6次 ,甩干 。
1.4.5 　加酶标亲合素 　所有各孔加 SA-HRP 液
0.1 mL , 37℃孵育 10 min , 用洗涤液 Tris-HCl-T 洗
6次 ,甩干 。
1.4.6　加底物显色　每孔加 10 g L TMB 0.1 mL ,
37 ℃孵育 15 min ,再加 2 mol L H2SO4 0.05 mL ,使反
应终止。
1.4.7　读数　在伯乐 680型酶标仪上 450 nm 波长
处 ,测量吸光度(OD450 nm)值 ,用试剂空白孔调零。
1.5　检测限 、线性范围与特异性　根据上述步骤建
立S-BA-ELISA法的标准曲线 ,判断该法的检测限 、
线性范围等指标 ,并用此法检测不同浓度 abrin 、蓖
麻毒素(ricin)和金黄色葡萄球菌肠毒素 B(SEB)来
考察其特异性。
1.6　abrin模拟样品的测定　称取土壤 、奶粉 、饼干
各1 g , 血液 5μL ,加稀释液搅匀至 5 mL ,自来水 、鲜
牛奶直接取 5 mL , 每个样品中加入 abrin 至最终浓
度为 15.6μg L的 abrin模拟样品。对不同模拟样品
3000 r min ,10 min离心 ,取上清液测定 abrin浓度 ,并
计算检测的回收率 、相对标准差等指标 。
2　结果
2.1　生物素标记抗体的效价测定结果　生物素标
记抗体的效价约为 1∶2.5×105 ,与 abrin 单抗腹水效
价基本相当 ,表明生物素标记抗体的方法对抗体活
性没有明显的影响。
2.2　最适抗体包被浓度的确定　分别用质量浓度
为 0.5 , 1 ,2.5 , 5 , 10 , 15和 20 mg L 的 abrin 多抗包
被酶标板 ,加入浓度为 15.6 μg L 的 abrin 标准品及
1∶200稀释的生物素标记 abrin单抗 , 同等条件下进行
S-BA-ELISA ,根据吸光度(OD450 nm)值的变化选择适合
的包被浓度。结果如图 1所示:在质量浓度 0.5 ～
10 mg L时OD450 nm值呈递增趋势 ,当>10 mg L 时趋于
饱和 ,则本试验确定 abrin多抗包被浓度为 10 mg L。
在抗体包被方式研究中我们已经发现 42 ℃包
被 5 h法优于通常采用的 4 ℃过夜法 ,此种包被方
法不仅缩短了包被时间 ,而且提高了检测的灵敏度 。
在此基础上 ,我们进一步比较了包被不同浓度 abrin
单抗 、多抗检测效果(图 2),研究结果发现包被 abrin
多抗检测不同浓度的毒素时 OD450 nm值呈现出线性
递增 ,并逐渐达到饱和的趋势 ,而包被单抗没有这种
关系 ,表明包被 abrin多抗明显优于单抗 。
图 1　不同包被浓度的 abrin 多抗与吸光度
(OD450 nm)值的关系
Fig 1　Relationship between absorbance and different
coated abrin polyclonal antibodies concentrations
图 2　abrin 单抗 、多抗包板与吸光度(OD450 nm)值间的关系
Fig 2　Relationship of absorbance with different coated
abrin polyclonal antibodies and monoclonal antibody concentrations
2.3　生物素标记的 abrin 单抗最适稀释倍数的确
定　用10 mg L 的 abrin 多抗包板 ,封板后加入质量
·572· 　　　　　　　免 疫 学 杂 志　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 23卷
浓度为 15.6 μg L 的 abrin 标准品 ,洗板后加入不同
稀释倍数的生物素标记 abrin单抗 ,同等条件下进行
S-BA-ELISA ,根据吸光度(OD450 nm)值的变化选择适
合稀释倍数的生物素标记的 abrin单抗 。结果如图 3
所示:当生物素标记 abrin 单抗的稀释倍数为 1∶
500 ～ 1∶200时 ,OD450 nm值呈上升趋势 ,当稀释倍数>
200时 ,曲线趋于平台。为兼顾检测灵敏度和节约
生物素标记的 abrin单抗用量 ,故认为生物素标记的
abrin单抗的最适稀释倍数为 1∶200。
图 3　不同稀释倍数的生物素标记 abrin单抗与
吸光度值的关系
Fig 3　Relationship between absorbance and different
biotinylated abrin monoclonal antibody dilutions
2.4　S-BA-ELISA法检测相思子毒素工作曲线的建
立　以制备的 abrin标准品浓度为横坐标 ,以吸光度
值为纵坐标作图(图 4),当 abrin 浓度为 0.125 ～
31.25μg L之间时 ,检测毒素的对数浓度与其吸光
度值之间呈良好的线性关系 ,对此进行直线回归分
析 ,建立S-BA-ELISA法检测相思子毒素的标准曲线
如图 5 所示:当待测相思子毒素浓度在 0.125 ～
31.25μg L 时 ,浓度和吸光度值呈显著直线相关 ,线
性回归方程为 Y =0.52369X +0.51632(r=0.9816 ,
P <0.0001 , n=9)。
图 4　相思子毒素浓度与吸光度值的关系
Fig 4　Relationship between absorbance and
different abrin concentration
图 5　S-BA-ELISA法检测相思子毒素工作曲线
Fig 5　Standard curve of abrin determined by S-BA-ELISA method
2.5　检测限和重现性　在 0.125 ～ 31.25 μg L 浓度
范围内 , 以P N>2.1作为判定阳性的标准 , 则检测
限为 0.125μg L。选择 4个 abrin浓度(31.25 , 15.6 ,
7.8和 3.9μg L),每个浓度反复测定 4次 。相对标
准差分别为2.35%, 3.59%, 4.06%和4.14%,平均
相对标准差为 3.54%。
2.6　特异性　用建立的相思子毒素 S-BA-ELISA 法
检测 abrin 时 ,随着 abrin浓度增加 ,OD450 nm值呈线性
递增趋势。而选用 abrin抗体 ,采用该法检测不同浓
度 ricin和SEB时 ,其所得吸光度值与阴性值接近 ,
表明该法检测相思子毒素具有很好的特异性 。
2.7　Abrin模拟样品的测定　从表 1可见 ,该法能
满足水样 、土样 、食品 、血液等人工模拟样品的分析
要求 ,具有较好的回收率和重现性。
　表 1　Abrin 模拟样品的测定
　Table 1　Determination of the simulated abrin specimens
Specimens
Practical
(μg·L-1)
Determined
(μg·L-1)
Recovery ratio
(%)
Relative standard
deviation (%)
Water 15.6 15.34±0.36 98.3 2.35
Soil 15.6 15.11±0.48 96.9 3.18
Milk powder 15.6 14.91±0.51 95.6 3.42
Fresh milk 15.6 14.74±0.61 94.5 4.14
Biscuit 15.6 14.78±0.31 94.7 2.10
Blood 15.6 14.15±0.45 90.7 3.18
3　讨论
酶联免疫吸附试验(ELISA)包括间接法 、竞争
法 、夹心法 、生物素-亲和素法等 ,其中以生物素-亲
和素法的灵敏度最高 ,相思子毒素(abrin)由于毒素
纯化 、抗体制备较困难 ,国内至今未有建立 ELISA 检
测 abrin 的报道。我们在长期从事 abrin纯化 、抗体
制备的基础上 ,成功建立夹心 BA-ELISA法检测 abrin
及水源 、土壤和食品等模拟样品 ,其特点是将生物素
·573·第 5 期　　　　　　　　　穆 惠 , 等.双抗体夹心生物素-亲和素 ELISA法检测相思子毒素
(B)-亲和素(A)系统的高度放大作用和抗原-抗体识
别的特异性结合起来 ,具有较高的灵敏度 、特异性和
重现性。在建立该法的过程中 ,我们发现洗脱液的
pH值 、离子强度是影响检测结果的一个重要因素 ,
通常采用的近中性的洗脱缓冲液(例如 pH 7.4 PBS)
进行洗脱时 ,本底值非常高 ,不能用于免疫检测。这
可能因为亲和素在pH中性环境中是带正电荷的 ,可
通过静电作用非特异性地吸附到固相载体上 ,引起
试验非特异性显色 ,导致本底值升高 ,因此 ,在操作
过程中应尽可能地减少非特异性吸附。根据这一设
想 ,我们在试验中选择高离子强度 、偏碱性的 pH9的
0.5 mol L Tris-HCl缓冲液(含 10 g L BSA)稀释 SA-
HRP ,同时用 pH 9 的 1 mol L Tris-HCl 缓冲液(含
1mL L Tween-20)洗去未结合的 SA-HRP ,显著降低了
测定的本底值 ,灵敏度大大提高 。另外 ,在夹心法抗
体的选择试验中 ,我们发现包被多抗的效果明显优
于单抗 ,这可能与多克隆抗体对抗原有更大的亲和
力(本试验中相思子毒素单抗 、多抗的亲和常数分别
为2.87×107 L mol 、4.21×108 L mol),包被多抗更容
易富集溶液中的相思子毒素 ,并将其牢牢“抓住” ,而
单抗由于亲和力较弱 ,不易富集溶液中的相思子毒
素并将其“抓牢” ,在洗脱的过程中容易脱落 ,导致了
包被单抗测定时结果非常不理想。本实验建立的 S-
BA-ELISA法 ,其特色是用多抗进行包被 、单抗进行
识别 ,将多克隆抗体的强富集能力 、单克隆抗体的特
异性以及生物素-亲和素系统的放大作用结合起来 ,
达到了提高检测的灵敏度和特异性的目的 。该法可
应用于食品卫生检验 、中毒治疗 、环境水源监测及不
法活动(或生物恐怖事件)的处置中 abrin的检测 ,具
有重要的意义。
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(编辑　李海鸥)
·574· 　　　　　　　免 疫 学 杂 志　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 23卷