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D101型大孔吸附树脂分离纯化红蓼总黄酮工艺研究



全 文 :nal,1992,7:313-321.
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[收稿日期]2013-09-29
[基金项目]国家自然科学基金项目(编号:30870249,81173509) [作者简介]丁伟杰,学士,主任药师,电话:13659882968 E-mail:463645968
@qq.com [通讯作者]楼一层,博士,教授,主任药师,电话:027-87859019,E-mail:louyiceng@163.com
D101型大孔吸附树脂分离纯化红蓼总黄酮工艺研究
丁伟杰1,胡盈1,陈娈1,印凯文1,赵祥2,楼一层2  (1.武汉市普仁医院,湖北 武汉430081;2.武汉理工大学,湖北 武
汉430070)
[摘要] 目的:筛选出适宜红蓼总黄酮纯化的大孔树脂,研究影响分离纯化的主要因素,确定最佳工艺参数。方法:采用分光
光度法测定红蓼总黄酮含量,通过静态及动态吸附-解吸方法筛选最佳树脂,以总黄酮回收率为主要指标,优化工艺条件。结
果:回收率和解吸率最佳为D101大孔树脂,最佳工艺条件为:样品浓度2.213 mg·mL-1、pH=4、用量103.3 mg·g-1;3 BV水
洗、4 BV50%乙醇洗脱,总黄酮回收率为56.2%,纯度为72.3%。结论:D101大孔树脂用于红蓼中总黄酮的提取纯化,回收率
较高,纯度好。
[关键词] D101大孔树脂;红蓼;总黄酮;分离纯化;工艺研究
[中图分类号]R943 [文献标识码]A [文章编号]1001-5213(2014)15-1259-04 DOI:10.13286/j.cnki.chinhosppharmacyj.2014.15.05
Study on the separation and purification technics of total flavonoids fromPolygonum orientle L
by D101 macroporous adsorptive resin
DING Wei-jie1,HU Ying1,CHEN Luan1,YING Kai-wen1,ZHAO Xiang2,LOU Yi-ceng2(1.Wuhan Puren
hospital,Hubei Wuhan 430081,China;2.Colege of Chemistry and Engineering,Wuhan University of Technology,Hubei Wu-
han 430070,China)
ABSTRACT:OBJECTIVE To purify the total flavonoids fromPolygonum orientle L with macroporous adsorptive resin and es-
tablish optimum process for separating and purifying total flavonoids.METHODS The optimal techniques of separation and
purification of flavonoid were obtained by static adsorption and elution tests,and separation techniques were evaluated by meas-
uring the concentration of total flavonoids fromPolygonum orientle L with ultraviolet spectrophotometer.RESULTS The type
D101 macroporous adsorptive resin was the best for the separation and purification of total flavonoids of Polygonum orientle L.
The optimum process condition was sample amount 103.3 mg·g-1,and sample concentration2.213 mg·mL-1 at pH4;and elu-
ting reagent was 50%alcohol with 4 BV,and water elution volume was 3 BV.The recovery rate of total flavonoids reached
56.2% with the purity of 72.3%.CONCLUSION To utilize the D101 macroporous adsorptive resin for the separation and pur-
ification of the total flavonoids Polygonum orientle L is feasible,shows high recovery rate and purity.
KEY WORDS:D101 macroporous adsorptive resin;Polygonum orientle L;total flavonoids;separation and purification;techni-
cal study
  红蓼为蓼科植物荭草Polygonum orientle L全
草,别名天蓼、大蓼、石龙等,其性味凉辛有毒,具有
祛风除湿、清热解毒、活血、截疟的功效[1]。研究表
明,红蓼的黄酮类成分具有良好的抗肿瘤活性,该药
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对于扩张血管、降血压、抗菌等亦有广泛的药理活
性[2]。大孔吸附树脂在中药提取分离中的应用日益
广泛,已成为纯化中药有效成分或有效部位的一种
有效方法[3-8]。运用大孔吸附树脂技术富集纯化总
黄酮成分,并对提取纯化工艺进行优化。
1 仪器与试药
1.1  仪器 752型紫外分光光度仪(南京麒麟分
析仪器有限公司);电子天平(德国赛多利斯公司);
旋转蒸发仪Re-52A(上海亚荣科技有限公司);渗漉
器(自制)。
1.2  试剂 芦丁标准品(中国药品生物制品检定
所,批号0080-0815);亚硝酸钠,硝酸铝,氢氧化钠,
盐酸;无水乙醇均为分析纯;纯化水。大孔吸附树脂
D101、AB-8(天津市海光化工有限公司),D201、
D301、D202(安徽皖东化工有限公司)。
1.3  药材 红蓼药材采自湖北武汉,由武汉理工
大学化学工程学院楼一层教授鉴定为蓼科植物荭草
Polygonum orientle L.全草。
2 方法与结果
2.1 提取液的制备 取药材粗粉1.5 kg,于渗漉器
中用80%乙醇浸泡24 h后,8倍量的80%乙醇连续
渗漉,控制流速约5 ml·min-1,回收乙醇至相对密
度为1.2 g·mL-1得流浸膏。流浸膏用纯化水溶解,
静置,抽滤得提取液。
2.2 总黄酮含量测定 采用硝酸铝-亚硝酸钠比色
法[9],以芦丁为标准品在508 nm 处测定吸光度,芦
丁浓度为纵坐标,吸光值为横坐标,得标准曲线回归
方程:Y=0.086 8 X+0.000 9(r=0.998 6),在
0.008~0.072 mg·mL-1范围内线性关系良好。
2.3 树脂的筛选
2.3.1 树脂预处理 树脂于95%乙醇中充分溶
胀后装柱,依次用下列溶液冲洗:95%乙醇洗至流
出液澄清;水洗尽乙醇(无醇味);5%盐酸溶液冲
洗,水洗至中性;4%氢氧化钠溶液冲洗,水洗至中
性,备用。
2.3.2 静态吸附-解吸 称取5种树脂各6 g于锥
形瓶中,各加入160 ml上样液(已知质量浓度2.213
mg·ml-1),于振荡器中振摇10 min后静止24 h,过
滤,按方法测定吸附后滤液浓度。将滤出的树脂用
160 ml纯化水洗净,另置250 ml锥形瓶中,加入
50%乙醇160 ml,振摇后静止24 h,测定解吸后滤
液浓度。按照下式计算各树脂对红蓼总黄酮的静态
饱和吸附量、解吸率[10-11],结果见表1。
饱和吸附量(mg·g-1)=(样液浓度-吸附后滤
液浓度)×上样液体积/干树脂量;
解吸量(mg·g-1)=解吸后滤液浓度×解吸液
体积/干树脂量;
解吸率(%)=解吸量/饱和吸附量×100%
表1 5种树脂静态吸附-解吸测定结果(n=3)
Tab 1 The static adsorption and desorption with five types
of macroporous resins(n=3)
树脂型号
饱和吸附量
/mg·g-1
解吸量
/mg·g-1
解吸率
/%
D101  53.40  46.40  86.89
D201  119.80  7.81  6.52
D202  19.80  6.40  32.32
D301  135.80  4.72  3.58
AB-8  108.87  43.60  40.05
2.3.3 动态吸附-解吸 称取5种树脂各6 g,湿法
装柱,各加入160 mL上样液(已知质量浓度2.213
mg·ml-1),上样吸附,过柱液重吸附一次,控制流速
适宜;160 ml纯化水冲洗后,用50%乙醇洗脱,将各
吸附后残液、水洗液、醇洗脱液按方法测定总黄酮含
量。按下列公式计算比吸附量、比洗脱量、总黄酮回
收率,结果见表2。
表2 5种树脂动态吸附-解吸测定结果(n=3)
Tab 2 The dynamic adsorption and desorption with five
types of macroporous resins(n=3)
树脂
型号
50%乙醇
洗脱量/mg
比吸附量
/mg·g-1
比洗脱量
/mg·g-1
总黄酮
回收率/%
D101  192.00  54.67  32.00  54.23
D201  21.28  53.95  3.55  6.01
D202  35.84  44.08  5.97  10.12
D301  31.60  42.01  5.27  8.92
AB-8  187.20  54.35  31.20  52.87
  比吸附量(mg·g-1)=(上柱黄酮量-残液中黄
酮量-水洗液中黄酮量)/干树脂量;
比洗脱量(mg·g-1)=醇洗脱液中黄酮量/干树
脂量;
总黄酮回收率(%)=醇洗脱液中黄酮量/上柱
黄酮量×100%
由于树脂的极性、孔径、比表面积等性质的不
同,对黄酮的吸附-解吸的能力亦各不相同。结合两
组吸附-解吸试验,5种树脂中D101型具有最佳的
解吸率和总黄酮回收率,故选用D101型树脂分离
纯化红蓼总黄酮。
2.4 分离纯化红蓼总黄酮工艺参数考察
2.4.1 上样量 8份干树脂各3 g,湿法装柱,分别
加入上样液(已知质量浓度2.213 mg·ml-1)50,80,
110,140,180,220,320,375 ml,吸附完全后依次用
4 BV的纯化水、4 BV50%乙醇洗脱,按方法测定各
吸附后残液、醇洗脱液黄酮含量并计算回收率,结果
见图1。当上样液140 ml即上柱量与干树脂之比
为103.3 mg·g-1时,黄酮回收率达到最大值,随后
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逐渐降低。这是由于上样量过大,导致吸附不完全,
造成泄露,而且过大的上样量会造成上层树脂局部
过饱和吸附,影响树脂的重复使用;但上样量过少则
吸附剂用量偏多,总黄酮回收率虽保持较高水平,但
成本也会增高。综合考察选用上样量约103.3 mg·
g-1为宜。
图1 上样量的影响
Fig 1 Effects of sample amount
2.4.2 上样浓度 6份干树脂各3 g,湿法装柱,不
同浓度(0.900、1.600、2.213、4.515、7.000、9.280
mg·ml-1)上样液4 BV上柱。吸附完全后依次用4
BV的纯化水、4 BV50%乙醇洗脱,按方法测定各
吸附后残液、醇洗脱液黄酮含量并计算回收率,见图
2。在树脂吸附量不变的条件下,采用低浓度上样液
会使工作量加大。考虑回收率及经济因素,宜选择
红蓼上样液(质量浓度2.213 mg·ml-1)直接上样。
图2 上样浓度的影响
Fig 2 Effects of sample concentration
2.4.3 上样液pH值 干树脂8份各3 g,湿法装
柱,用1 mol·L-1的盐酸溶液或氢氧化钠溶液调上
样液pH值为2、3、4、5、6、7、8、9,各取100 ml上柱
吸附完全后,依次用4 BV的纯化水、4 BV50%乙
醇洗脱,按方法测定各原液、吸附后残液、醇洗脱液
黄酮含量并计算回收率,结果见图3和表3。
图3 上样溶液pH的影响
Fig 3 Effects of sample pH value
表3 不同pH上样液测定结果(n=3)
Tab 3 Results of sample with different pH values(n=3)
pH  2  3  4  5  6  7  8  9
现象 澄清 澄清 澄清 澄清 少量沉淀 少量沉淀 沉淀较多 沉淀较多
黄酮回收率/%73.96 72.81 92.91 72.19  61.13  54.80  54.12  29.32
2.4.4 洗脱剂乙醇的体积分数 5份干树脂各3
g,湿法装柱,160 ml上样液上柱吸附完全,用4 BV
纯化水洗柱后,分别10%,30%,50%,70%,95%乙
醇洗脱,每种洗脱液收集4 BV,按方法测定各吸附
后残液、醇洗脱液黄酮含量并计算回收率,见图4。
随着乙醇的体积分数的增加,总黄酮回收率随之增
加,增大到50%后,曲线呈平缓趋势,同时考虑到工
业生产成本问题,采用50%乙醇即可达到较好解吸
效果。
图4 乙醇的体积分数的影响
Fig 4 Effects of ethanol concentration
2.4.5 洗脱剂体积 8 g干树脂,湿法装柱,160 ml
上样液吸附完全后,用4 BV的纯化水、4 BV50%
乙醇洗脱,依次收集醇洗脱液8个柱床体积,测定吸
附后残液、每个收集体积的黄酮含量并计算回收率,
见图5。当洗脱液用量为4 BV时,总黄酮的回收率
接近100%,基本上将总黄酮洗脱完全,继续增大洗
脱体积效果并不明显,故洗脱4BV 确定为洗脱终
点。
图5 洗脱体积的影响
Fig 5 Effects of ethanol elution volume
2.4.6 水洗体积 4份干树脂各3 g,湿法装柱,
160 ml上样液吸附完全后,分别用1,3,5,7 BV的
纯化水洗脱,再用180 ml 50%的乙醇洗脱,测定各
部分的黄酮含量;各醇洗脱液浓缩干燥得固体样品,
称重,计算总黄酮纯度。结果见图6。采用大孔树
脂时,会同时吸附色素、糖类、蛋白质类等杂质,醇洗
脱前应用水尽量除去。采用3 BV水洗体积时,回
收率和纯度可达56.2%、72.3%,同时还可保证较低
工作量。
2.5 工艺验证 按照优化工艺,将1.5 kg药材粗
粉所得浸膏制备成提取液,通过2 kg D101树脂(柱
子规格:6 cm×120 cm)全部进行纯化,按方法测定
样品纯化前后总黄酮含量,计算纯度。纯化前总黄
酮纯度仅为18.21%,纯化后纯度达到71.03%
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(n=3,RSD=2.32%)。经D101大孔树脂纯化后纯
度提高约3倍,优化的工艺稳定可行,具有良好效
果。
图6 水洗体积的影响
Fig 6 Effects of water elution volume
3 讨论
本文对红蓼进行渗漉提取,通过对上样液浓度、
上样液pH、上样液体积、水洗体积、洗脱浓度等因
素的考察,建立了D101型大孔吸附树脂分离纯化
红蓼总黄酮的工艺优化方法,最佳工艺为采用质量
浓度为2.213 mg·ml-1的红蓼提取液4 BV上柱,调
节pH=4.0左右,先以3 BV 纯化水淋洗,再用
4 BV50%乙醇洗脱。所得红蓼精制提取物中总黄
酮纯度为72.3%,回收率为56.2%,为进一步应用研
究打下坚实基础。
pH值对于D101树脂吸附总黄酮有较大影响,
在酸性条件下吸附性能较好,碱性时样品易形成沉
淀,吸附效果差,这可能与黄酮类成分分子结构有
关,酸性环境下黄酮处于分子形式易于吸附,而在碱
性环境中,黄酮分子上的酚羟基形成酸根离子,易于
与其他离子形成络合物而产生沉淀。
大孔树脂本身具有较好的重复使用性,故文中
未考察其重复使用次数,在工业化生产当中可根据
实际情况进行重复使用处理。大孔树脂应用于中药
提取物纯化具有良好应用前景,但实际运用还需考
察众多指标,后期研究中还应充分考虑。
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[收稿日期]2013-11-20
[基金项目]河南省科技厅课题(编号:092102310203) [作者简介]杨秀丽,女,主治医师、讲师,研究方向:冠心病、心力衰竭的诊治。电话:
0373-3029641,E-mail:yangxiuli01@sina.com [通讯作者]赵国安,男,博士,主任医师、教授,研究方向:冠心病的介入治疗,E-mail:guo-
anzhao@yeah.net
不同剂量辛伐他汀对慢性心力衰竭兔左室重塑及心功能的影响
杨秀丽1,王显良1,冯现君2,孙海燕1,刘迎春3,武惠敏1,赵国安1  (1.新乡医学院第三附属医院心内科,河南 新乡
453003;2.新乡市第一人民医院心内科,河南 新乡453003,;3.新乡医学院护理学院,河南 新乡453003)
[摘要] 目的:通过观察不同剂量辛伐他汀对慢性心力衰竭(CHF)左室重塑及心功能的影响,探讨辛伐他汀对慢性心力衰竭
兔心肌细胞发挥保护作用的机制。方法:雄性大耳白兔60只,随机分成5组,正常对照(CON)组,慢性心力衰竭(CHF)组,低
剂量辛伐他汀(SD-SIM组),中剂量辛伐他汀(MD-SIM)组,高剂量辛伐他汀(HD-SIM)组。耳缘静脉注射阿霉素 (ADR),制
作CHF模型。行心脏彩超检查,测量左室结构、功能,测定血流动力学指标。处死动物后,留取左心室室壁多聚甲醛固定,染
色后进行免疫组化检测热休克蛋白22(HSP22)表达水平。结果:心功能检查显示,与CON组相比SD-SIM、MD-SIM、HD-
SIM、CHF组左心室射血分数(LVEF)明显下降(P<0.05),与 MD-SIM组相比,SD-SIM组、HD-SIM组明显下降(P<0.05);
与CON组相比SD-SIM、MD-SIM、HD-SIM、CHF组左室舒张末内径(LVEDD)、左室收缩末内径(LVESD)显著增加(P<
0.05),与 MD-SIM组相比,SD-SIM组和 HD-SIM组明显增大(P<0.05);血流动力学检测显示:与CON组相比,SD-SIM组、
MD-SIM组、HD-SIM组、CHF组的+dp/dtmax、-dp/dtmax及LVSP明显下降(P<0.05),SD-SIM组、HD-SIM组与 MD-SIM
组相比明显下降(P<0.05)。HSP22的表达:与CON组相比SD-SIM组、MD-SIM组、HD-SIM组、CHF组HSP22蛋白的表达
明显增多(P<0.01),SD-SIM组、MD-SIM组、HD-SIM组与CHF组相比表达明显减少(P<0.05),其中MD-SIM组表达最少
(P<0.05)。结论:辛伐他汀可明显改善慢性心力衰竭兔左室重塑,改善心功能,其中 MD-SIM组效果最好,其机制可能与辛伐
·2621· 中国医院药学杂志2014年8月第34卷第15期Chin Hosp Pharm J,Aug 2014,Vol 34,No.15