全 文 ：第 37卷 第 11期 东　北　林　业　大　学　学　报 Vol.37 No.11
2009年 11月 JOURNALOFNORTHEASTFORESTRYUNIVERSITY Nov.2009
应用均匀设计法优化钻天柳嫩叶柄植株再生体系 1)
　　　　　　　　 顾地周　　　　高捍东　　顾美影　姜云天
(通化师范学院 ,通化 , 134002)　　　(南京林业大学)　　　　　(通化师范学院)　　　
　　摘　要　应用均匀设计法筛选钻天柳最适合的培养基。结果表明 ,钻天柳组织培养的不同阶段需要不同的培
养基。最适合的嫩叶柄愈伤组织诱导培养基为:MS+KT2.00mg/L+NAA0.05mg/L,诱导率为 95.5%;嫩叶柄愈
伤组织不定芽的分化培养基为:MS+6-BA3.90mg/L+NAA0.01mg/L, 分化率为 98%;生根培养基为:1/2MS+IBA0.07mg/L, 生根率达 99%以上。成功建立了钻天柳嫩叶柄再生体系。
关键词　钻天柳;离体培养;均匀设计
分类号　Q945.5OptimizationofPlantRegenerationSysteminTenderLeafstalksofChoseniaarbutifoliabyUniform Design/GuDizhou(DepartmentofBiology, TonghuaNormalUniversity, Tonghua134002, P.R.China);GaoHandong(NanjingForestryUniversity);GuMeiying, JiangYuntian(TonghuaNormalUniversity)//JournalofNortheastForestryUniversity.-2009, 37(11).-21 ～ 23AnexperimentwasconductedtostudytheoptimalculturemediumforChoseniaarbutifoliabyuniformdesignusingtenderleafstalksasexplants.ResultsshowedthatC.arbutifoliarequireddiferentkindsofculturemediaindiferentculti-vationphases.ThemostsuitableculturemediumswereobtainedasMSsupplementedwithKT2.00mg/LandNAA0.05mg/Lforcallusinductionwithaninductionrateof95.5%, MSwith6-BA3.90mg/LandNAA0.01mg/Lforcalusmul-tiplicationwithamultiplicationrateof98%, and1/2MSwithIBA0.07mg/Lforrootingwitharootingrateofmorethan
99%.PlantregenerationsystemintenderleafstalksofC.arbutifoliawassuccessfullyestablished.Keywords　Choseniaarbutifolia;invitroculture;Uniformdesign
　　钻天柳(Choseniaarbutifolia(Pall.)A.Skv.)又称上天
柳 、顺河柳 、朝鲜柳 , 是杨柳科钻天柳属的落叶乔木。国家三
级重点保护植物。 《中国珍稀濒危保护植物名录》中定为渐
危种 [ 1] 。 《吉林省野生动植物保护管理暂行条例》中定其为
省级一类重点保护植物。钻天柳为单种属植物 ,由柳属内分
出 , 其雄花序下垂 ,雌 、雄花都无腺体 ,与杨属相似 , 是介于杨
属与柳属之间的过渡类型 , 对研究杨柳科系统发育有科学价
值;钻天柳生长速度快 ,树形优美 ,可做绿化树种 , 具有很强的
生态效益 , 多生于河岸和溪流旁 , 是最佳的护岸树种;钻天柳
的根系特别发达 , 是地上部分的 3 ～ 5倍以上 , 极具吸水性 , 有
很强的固沙 、固土能力 [ 2] 。钻天柳零星分布于我国东北部分
地区。由于森林过度砍伐 , 林地环境条件发生变化 , 加之个别
地区的河流遭到污染 , 影响了钻天柳种子的萌发与幼苗 、幼树
的生长 , 有的地区已经绝迹 ,有些地区仅有大树而无幼苗与幼
树 , 其分布区正日益缩减。钻天柳的天然更新能力非常弱 , 又
因其种子小 、寿命短 ,成熟后须应马上播种 ,可操作性极差 , 插
条繁殖生根率和移栽成活率也极低 , 使其开发及利用受到极
大限制。目前 , 关于钻天柳离体培养的研究已有报道 [ 3-4] , 但
有关钻天柳嫩叶柄植株再生体系建立的研究迄今未见。因
此 , 在保护好现有野生资源的同时 ,本研究以钻天柳新生嫩叶
柄为外植体 , 利用植物组织培养方法 , 采用均匀设计法 ,以期
筛选出钻天柳嫩叶柄离体培养各阶段的培养基 , 为钻天柳的
开发利用和工厂化育苗奠定基础。
1　材料与方法
外植体材料的处理:2006年 2月份于吉林省通化县富江
乡采钻天柳休眠枝条 , 在实验室内水培促其休眠芽萌发。待
1)吉林省教育厅自然科学基金项目((2003)-65)资助。
第一作者简介:顾地周 ,男 , 1973年 11月生 ,通化师范学院生物
系 ,讲师。
通信作者:高捍东 ,教授 ,博士生导师。
收稿日期:2009年 3月 4日。
责任编辑:程　红。
休眠芽萌发并长出嫩叶后 , 将嫩叶和叶柄一同剪下 ,在超净工
作台上用体积分数 70%酒精涮洗 30s, 用含质量浓度为 3%
青霉素的次氯酸钠(质量浓度为 0.5%)溶液浸泡 6min,无菌
水冲洗 8次 ,无菌滤纸吸干表面水分 ,切除叶片和灭菌剂损伤
的部分叶柄后作为外植体备用。
钻天柳嫩叶柄愈伤组织诱导培养基的筛选:以 MS为基
本培养基 , 内含蔗糖 30g/L, 琼脂粉 7.5g/L, 再附加不同质量
浓度的激动素 KT(由单因子预试验确定为 0.50 ～ 2.50 mg/
L)和生长素 NAA(由单因子试验确定为 0.10 ～ 0.50 mg/L),
调节 pH值为 6.0,外植体在温度(24±2)℃、光照强度 1 200
lx、光照周期 13h/d条件下培养 , 为了提高钻天柳嫩叶柄愈伤
组织的诱导速度和诱导率 , 采用均匀设计法 ,每个处理接种外
植体 10个 , 重复 3次 , 选用 U9(92)均匀表 , 考察 KT和 NAA不同质量浓度交叉配比对愈伤组织诱导率的影响。嫩叶柄培
养 45d统计诱导率 , 筛选最适合钻天柳嫩叶柄愈伤组织的诱
导培养基。
钻天柳嫩叶柄愈伤组织不定芽分化培养基的筛选:以 MS
为基本培养基 , 内含蔗糖 30g/L, 琼脂粉 7.0g/L, 再附加不同
质量浓度的细胞分裂素 6-BA(由预试验确定为 2.00 ～ 4.25
mg/L)和生长素 NAA(由预试验确定为 0.01 ～ 0.05 mg/L),
调节 pH值为 5.8,外植体在温度(24±2)℃、光照强度 1 400
lx、光照周期 12h/d条件下培养 , 为了提高钻天柳不定芽的诱
导速度和分化率 , 采用均匀设计法 , 每个处理接种愈伤组织
10块 ,重复 3次 , 选用 U10(102)均匀表 ,考察 6-BA和 NAA不同质量浓度交叉配比对分化率的影响。 愈伤组织培养 50 d
统计分化率 ,筛选最适合钻天柳嫩叶柄愈伤组织不定芽分化
的培养基。
钻天柳组培苗生根培养基的筛选:以 1/2MS为培养基 ,
加入蔗糖 15g/L, 琼脂 7.0 g/L, 并附加不同质量浓度的 IAA
(由预试验确定为 0.10 ～ 1.00mg/L)、IBA(由预试验确定为
0.10 ～ 0.50mg/L)和 NAA(由预试验确定为 0.05 ～ 0.10mg/
L), 调节 pH值为 6.0, 将不定芽切割成 1 ～ 3叶 1段 , 茎段在
温度(23±2)℃、光照强度 1 000lx、光照周期 8h/d条件下培
养。为了提高钻天柳的生根率 ,采用均匀设计法 , 每个处理接
种茎段 10个 ,重复 3次 , 选用 U10(103)均匀表 , 考察生长素IAA、IBA和 NAA不同质量浓度交叉配比对生根率的影响。
不定芽茎段培养 35d统计生根率 ,筛选最适合钻天柳组培苗
生根的培养基。
数据处理:采用均匀设计法进行初步规律设计性试验 , 数
据分析处理应用均匀设计软件(UniformDesign3.0V)。
2　结果与分析
2.1　MS培养基中不同质量浓度 KT和 NAA配比对钻天柳
嫩叶柄愈伤组织诱导的影响
由表 1试验结果可得回归方程Y=72.7 +7.3 3X1 -
31.7X2 ,经计算 ,复相关系数R=0.942 9,剩余标准差 s=2.71,检
验值 Ft=24.05,临界值 F(0.01, 2 , 6)=10.92, Ft>F(0.01, 2, 6), 表明回归方程有意义。对各方程项进行显著性检验可知:各方程
项对 Y影响均显著。根据回归方程求出 Y的最优组合为:X1 =
2.50, X
2
=0.10, 在此组合基础上求得最优解:y=87.8,此解
为回归方程的解析解 , 需按公式 Y=y±uα· s(其中 uα为正
态分布的双侧分位数 , s为剩余标准差)计算出优化值区间估
计为 Y=87.8±10.0, 即 77.8% ～ 97.8%。但由表 1和回归
方程可知 , KT超过 2.00 mg/L时诱导率下降 , 诱导率 Y与生
长素 NAA呈负相关 ,因此,对最优组合进行改良, 即为 KT2.00
mg/L+NAA0.05mg/L,将钻天柳嫩叶柄接种到附加 KT2.00
mg/L和 NAA0.05mg/L的 MS培养基上进行愈伤组织诱导
培养的验证试验(重复数为 30), 培养 15d,发现嫩叶柄开始
膨胀且表面伴有颗粒状愈伤组织出现(图 1a);继续培养至 45
d,嫩叶柄完全脱分化形成黄绿色的愈伤组织(图 1b),诱导率
达 95.5%, 在估计区间内 ,比表 1中 9个处理的诱导率均高。
因此 , 钻天柳嫩叶柄愈伤组织的最佳诱导培养基为:MS+KT
2.00mg/L+NAA0.05mg/L。
表 1　钻天柳嫩叶柄愈伤组织诱导培养基的 U9(92)均匀设计试验安
排与结果
处理
号
因　　素
KT/mg·L-1(X1) NAA/mg·L-1(X2)
诱导
率 /%
1 0.50 0.20 68.5
2 0.75 0.35 67.5
3 1.00 0.50 66.0
4 1.25 0.15 75.0
5 1.50 0.30 73.5
6 1.75 0.45 72.5
7 2.00 0.10 89.0
8 2.25 0.25 79.0
9 2.50 0.40 76.5
2.2　MS培养基中不同质量浓度 6-BA和 NAA配比对钻天柳
嫩叶柄愈伤组织分化不定芽的影响
由表 2试验结果可得回归方程Y=67.4 +7.0 9X1 -
0.627X2 , 经计算 ,复相关系数 R=0.985 5,剩余标准差 s=1.20,检验值 Ft=117.9,临界值 F(0.01, 2 , 7)=9.547, Ft>F(0.01, 2, 7), 表
明回归方程有意义。 对各方程项进行显著性检验可知:各方
程项对 Y影响均显著。根据回归方程求出 Y的最优组合为:
X1 =4.25, X2 =0.01, 在此组合基础上求得最优解:y=94.9,此解为回归方程的解析解 , 需按公式 Y=y±uα· s计算出优
化值区间估计为 Y=94.9±4.21, 即 90.69% ～ 99.11%。通
过表 2试验结果和回归方程及愈伤组织的芽苗分化情况可
知 , 6-BA超过 4.00mg/L时分化率下降 , NAA与分化率呈负
相关 , 猜测 6-BA在 3.75 ～ 4.00mg/L之间有较高的芽苗分化
率的峰值 , 又以 6-BA为 3.80、3.85、3.90、3.95和 4.00 mg/L,
NAA0.01mg/L做了 5个处理的试验 , 重复 3次 , 发现 6-BA
在 3.90mg/L时分化率最高。因此 , 将钻天柳嫩叶柄诱导产
生的愈伤组织接种到附加 6-BA3.90mg/L和 NAA0.01mg/L
的 MS培养基上进行不定芽分化培养 ,培养 30d,由愈伤组织
上分化出不定芽(图 1c);继续培养至 50d,不定芽可长至 2 ～
3cm以上(图 1d), 且苗壮而整齐 ,分化率达 98%以上 , 在估
计区间内 , 比表 2中 10个处理的分化率均高。因此 , 钻天柳
嫩叶柄愈伤组织不定芽分化的最佳培养基为:MS+6-BA3.90
mg/L+NAA0.01mg/L。
表 2　钻天柳嫩叶柄愈伤组织不定芽分化培养基的 U10(102)均匀设
计试验安排与结果
处理
号
因　　素
6-BA/mg·L-1(X1) NAA/mg·L-1(X2)
分化
率 /%
1 2.00 0.02 75.5
2 2.25 0.03 75.0
3 2.50 0.05 72.5
4 2.75 0.01 84.0
5 3.00 0.02 83.5
6 3.25 0.04 81.0
7 3.50 0.05 80.0
8 3.75 0.01 93.0
9 4.00 0.03 87.5
10 4.25 0.04 85.0
2.3　1/2MS培养基中不同质量浓度生长素配比对钻天柳组
培苗生根的影响
根据表 3试验结果可得回归方程 Y=102-71.0X2 ,经计算 , 复相关系数 R=0.955 7, 剩余标准差 s=3.46, 检验值 Ft=
84.28,临界值 F(0.01, 1, 8)=11.26, Ft>F(0.01, 1, 8), 回归方程显著。对方程项 X
2
进行显著性检验可知:X
2
方程项对 Y影响
均显著。根据回归方程求出 Y的最优组合为:X2 =0.10,在此
组合基础上求得最优解:y=94.6, 按公式 Y=y±uα· s计算出优化值区间估计为 Y=94.8±11.6, 即 83.2% ～ 106.4%。
待愈伤组织分化产生的不定芽长至 3.0cm以上时 , 将生长健
壮的苗切下 , 切割成 1～ 3叶 1段 ,将其接种到附加 IBA0.10
mg/L的 1/2MS培养基中 , 培养 7d发现茎段基部开始膨胀并
逐步形成瘤状物 , 继续培养至 21d, 根从瘤状物中发出 , 根据
无性育苗经验 ,这样的根在移栽时根随瘤状物脱落 ,移栽成活
率几乎为零 , 不宜采用此种形态的植株。因此 ,对现有培养基
进行改良 , 即以 1/2MS+IBA0.07mg/L为生根培养基进行验
证试验 , 茎段培养 15d后 ,茎段基部或茎部直接发出 3 ～ 5条
不定根(图 1e), 继续培养至 35d后腋芽可萌发伸长至 2.00 ～
3.00cm以上 , 有的产生了侧根 ,根和苗的形态 、发育均正常 ,
生根率达 99%以上 , 在估计区间内 , 比表 3所列 10个处理的
生根率均高。可见 , 钻天柳组培苗的最佳生根培养基为:1/
2MS+IBA0.07mg/L。
表 3　钻天柳组培苗生根培养基的U10(103)均匀设计试验安排与结果
处理
号
因　　素
IAA/mg· L-1(X1) IBA/mg·L-1(X2) NAA/mg·L-1(X3)
生根
率 /%
1 0.10 0.50 0.07 64.0
2 0.20 0.10 0.07 91.0
3 0.30 0.40 0.10 73.0
4 0.40 0.20 0.10 86.5
5 0.50 0.30 0.06 89.0
6 0.60 0.30 0.09 81.0
7 0.70 0.20 0.09 87.0
8 0.80 0.40 0.05 72.5
9 0.90 0.10 0.08 96.0
10 1.00 0.50 0.08 66.0
22 　　　　　　　　　　　东　北　林　业　大　学　学　报　　　　　　　　　　　　　　　第 37卷
　　待生根苗长至 3.00cm时 , 从培养瓶中取出试管苗 , 在含
有 10mg· L-1杀毒矾溶液中洗去苗上残留的琼脂 , 然后植入
经 100倍液杀毒矾消毒过的腐泥炭土和细河砂(3∶1)混合的
基质中 , 用透光好的塑料薄膜覆盖以保湿保温 , 湿度保持在
85%, 温度控制在(18±2)℃,每天自然光照 10h, 每天适时通
风 , 10d后揭去薄膜 , 每天早晨喷洒清水 1次。成活率达 95%
以上(图 1f)。
3　结论
笔者成功建立了钻天柳嫩叶柄植株再生体系 ,达到了预期
目的。试验结果表明 , 培养基 MS+KT2.00mg/L+NAA0.05
mg/L对钻天柳嫩叶柄愈伤组织的诱导效果最好。当 KT质量浓
度低于 0.50 mg/L嫩叶柄诱导愈伤组织的速度慢 , 超过 2.50
mg/L时愈伤组织致密且几乎不分化芽苗;NAA质量浓度低
于 0.10mg/L时嫩叶柄产生的速度极其缓慢 , 超过 0.50mg/L
时嫩叶柄产生愈伤组织极其疏松且失去分化能力。培养基
MS+6-BA3.90mg/L+NAA0.01mg/L较适合钻天柳嫩叶柄
愈伤组织不定芽的分化 , 6-BA质量浓度超过 3.90mg/L时 ,
对芽苗分化起抑制作用。培养基 1/2MS+IBA0.07mg/L较
适合钻天柳组培苗的生根 , 过高质量浓度的 IBA导致幼苗基
部膨胀或产生愈伤瘤 , 继续培养根从膨胀部或愈伤瘤上发出 ,
这样的苗在移栽时根随愈伤瘤从苗基部脱落 , 移栽成活率几
乎为零 ,可能是根与苗茎的纤维疏导组织连接不完整所致 , 另
外 ,应用均匀设计法处理和分析数据 ,可大大缩短培养基配方
的摸索时间。
图 1　钻天柳离体培养及种质试管保存各阶段的培养物形态
a.嫩叶柄诱导愈伤组织的培养;b.嫩叶柄诱导产生的愈伤组织;c-d.愈伤组织分化不定芽;e.植株;f.移栽苗。
参　考　文　献
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产技术的研究 [ J] .林业科技, 1994, 19(6):17-19.
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[ J] .吉林林业科技 , 2006, 35(2):8-11.
(上接 20页)
4　结论与讨论
对中国白桦和欧洲白桦优良杂交子代中选择的 20株优
树进行单株腋芽离体繁殖 , 从单株优树腋芽的启动 、愈伤组织
诱导率 、增殖倍数及植株的长势等方面考察优树之间无性繁
殖的结果发现 , 优树间无性繁殖性状出现了不同程度的差异:
在腋芽启动方面 ,启动率从 63.1%(3号和 16号优树)到 75.0%
(4号和 17号优树),相差 10个百分点;以优树腋芽启动苗的
茎段为外植体 , 愈伤组织的诱导率从 60.0%(6号和 8号优
树)到 95.5%(16号优树), 差异非常明显 , 而且这些愈伤组
织的分化率都较高 , 都在 90%以上 ,但是它们分化的芽质量
差异很大。造成这些差异的主要原因是遗传物质的差异。虽
然 20株优树是从相同的白桦母树杂交获得的 ,但由于有性繁
殖的性状分离 , 致使它们之间存在遗传物质的差异 , 这些差异
有的就表现在无性繁殖性状方面 , 利用这些差异考察优树的
无性繁殖性状 , 使它们的优良性状最大程度地保持下来 , 为白
桦良种的选育和快速繁殖提供理论依据。
通过研究 ,初步筛选出无性繁殖性状较优良的 3号和 16号
优树,选择它们用于工厂化育苗 ,可以满足造林和生产需要。
参　考　文　献
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23第 11期　　　　　　　　　　　顾地周等:应用均匀设计法优化钻天柳嫩叶柄植株再生体系