全 文 ：狗肝菜多糖对肝纤维化大鼠肝组织 临床研究
MMP － 1 及 TIMP － 1 表达的影响
李志超1 曹庆生2(1 唐山市玉田县中医医院风湿一科;
2 唐山市玉田县医院病理科 河北 玉田 064100)
【摘要】 目的 研究中药狗肝菜多糖对二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化大鼠肝组织中基质金属蛋白酶 － 1(matrix
metalloproteinase － 1，MMP －1)及基质金属蛋白酶抑制剂 － 1(tissueinhibitor of matrix metalloproteinase － 1，TIMP － 1)蛋白
表达的影响。方法 用二甲基亚硝胺诱导大鼠肝纤维化模型，不同浓度狗肝菜多糖干预后，取肝脏常规制片并 HE 染
色，观察各组大鼠肝组织病理学改变，免疫组织化学方法检测各组大鼠肝组织 MMP － 1 及 TIMP － 1 蛋白表达的情况。
结果 狗肝菜多糖高、中剂量组中大鼠肝组织 MMP －1 蛋白表达较模型组明显升高(P ＜ 0． 05) ，狗肝菜高、中剂量组中
大鼠肝组织 TIMP － 1 蛋白表达较模型组明显降低(P ＜ 0． 05)。结论 狗肝菜多糖具有显著的抗肝纤维化作用，其机制
可能与提高 MMP －1 表达，降低 TIMP － 1 蛋白的表达而调控细胞外基质的代谢有关。
【关键词】 大鼠 肝纤维化 狗肝菜 免疫组织化学 基质金属蛋白酶 基质金属蛋白酶抑制剂
狗肝菜是爵床科华九头狮子草属，全草味甘、微苦，
现代药理学表明，其主要成分为多糖、有机酸、氨基酸
等，在临床上属于清热解毒药，常用于治疗感冒高热、肺
热咳嗽、肝热目赤、急性肝炎等［1］。研究发现，植物多糖
对肝炎及肝损伤也有很好的作用，可能与其具有免疫调
节及抗氧化抗纤维化的作用有关，而且与西药比较，最
大优势是没有细胞毒性［2］。肝纤维化中，一般有基质金
属蛋白酶(matrix metalloproteinase － s，MMPs)的减少和
基质金属蛋白酶抑制剂(tissueinhibitor of matrix metallo-
proteinase － s，TIMPs)的增加，使细胞外基质降解减少，
胶原合成增加。狗肝菜多糖在肝纤维化的治疗中对基
质金属蛋白酶 － 1(matrix metalloproteinase － 1，MMP －
1)及基质金属蛋白酶抑制剂 － 1(tissueinhibitor of matrix
metalloproteinase － 1，TIMP －1)蛋白表达的影响，国内目
前未见文献报道。本课题利用 DMN 建立肝纤维化模
型，同时用狗肝菜多糖分组进行干预，四周后常规取肝
脏、脱水、包埋，制片，运用免疫组织化学方法检测肝纤
维化大鼠肝组织MMP －1 及 TIMP －1 蛋白表达情况，来
评估狗肝菜多糖在肝纤维化的治疗中对 MMP － 1 及
TIMP －1 蛋白表达的影响。
1 材料与方法
1． 1 动物与试剂 无特定病原体(SPF级)斯泼累格·
多雷(SD)大鼠 72 只，体质量 180 ～ 220 g，雄性，由桂林
医学院 SPF 实验动物中心提供(许可证号 SCXK2007 －
0001)。并于实验中心内饲养，饲料由桂林医学院 SPF
实验动物中心提供。狗肝菜多糖由桂林医学院药学院
天然药化室张可锋老师提供;兔抗鼠 MMP － 1，TIMP － 1
多克隆抗体(1 ∶ 100 稀释) ，兔抗人 Bax 抗体免疫组化
试剂盒(SPKit)及 DAB 试剂盒均购于武汉博士德有限
公司;抗肝纤维化:秋水仙碱粉剂，以 0． 9%氯化钠溶液
配成 1mg /100ml浓度，冷藏备用，购自德国 serva 公司;
造模采用二甲基亚硝胺(DMN，纯度 99%) ，以 0． 9%氯
化钠溶液配成 0． 5%浓度，冷藏备用，购于天津市化学
试剂研究所。
1． 2 方法
1． 2． 1 肝纤维化大鼠模型的制备及药物处理 实验
前，所有大鼠先适应性喂养 2 d。采用随机原则分为 6
组:正常对照组、模型组、秋水仙碱组，狗肝菜多糖高剂
量组、狗肝菜中剂量组、狗肝菜低剂量组，各 12 只。肝
纤维化大鼠模型制备:除正常对照组 12 只大鼠腹腔注
射等量 0． 9%氯化钠溶液外，其余 60 只按 2 ml /kg 剂
量，腹腔注射 0． 5%二甲基亚硝胺(DMN) ，每周连续注
射 3 d，1 次 /d，然后停药 4 d，模型制备时间共计 4 周。
第 1 周腹腔注射时用常规剂量的 2 /3。饲养采用普通饮
食，可自由进水。药物处理:各实验组大鼠给药方法均
采用灌胃给药，1 次 /d，至实验结束。秋水仙碱组采用
抗纤维化有效剂量 0． 1 mg /kg，狗肝菜多糖高剂量组为
300 mg /kg、狗肝菜多糖中剂量组 200 mg /kg、狗肝菜多
糖低剂量组为 100 mg /kg，对照组和模型组不给任何药
物治疗，用 0． 9%氯化钠溶液代替。
1． 2． 2 标本采集及免疫组织化学方法 采用颈椎脱臼
法处死大鼠后，剖开腹腔，暴露肝脏，观察大鼠肝脏大
小、颜色、质地等情况，然后迅速取出肝脏，在洁净的取
材台上选择肝左叶相同部位组织进行取材，以保证各组
大鼠肝组织可比性，组织块大小适中，放入 10%甲醛中
充分固定，自动脱水机脱水、常规石蜡包埋组织，石蜡切
片机切片，免疫组织化学染色采用 SP 法，染色步骤按
MMP －1 及 TIMP － 1 试剂说明书进行。均设阳性对照
及阴性对照。
1． 2． 3 判定标准 MMP －1 及 TIMP －1 均以胞浆中出
现棕黄色或棕褐色颗粒作为阳性细胞。先按染色强度
计分:无着色计 0 分，浅黄色计 1 分，棕黄色计 2 分，棕
褐色计 3 分;再按百分比计分:阴性为 0 分，≤10%为 1
分，11% ～50%为 2 分，51% ～ 75%为 3 分，≥75%为 4
分。二者相加，总分 0 ～ 1 分(－) ，2 ～ 3 分(+) ，4 ～ 5
分(+ +) ，6 ～ 7 分(+ + +)。
·4131· Journal of Clinical and Experimental Medicine Vol． 11，No． 16 Aug． 2012
1． 3 统计学处理 应用 SPSS 17． 0 统计软件，参照刘
军祥等［3］的方法，用 SPSS 对等级资料进行 Ridit 分析。
检验水准 α = 0． 05。
2 结果
2． 1 MMP －1 表达情况 MMP － 1 在正常组中表达呈
棕褐颗粒状，范围广;模型组细胞呈淡黄色且着色浅，范
围窄;狗肝菜高、中剂量组、秋水仙碱组 MMP － 1 表达呈
棕褐颗粒状，范围较广;与正常组比较，模型组 MMP － 1
蛋白表达明显降低(μ = 8． 45，P ＜ 0． 05) ;与模型组比
较，狗肝菜多糖高剂量组、中剂量组、秋水仙碱组 MMP
－1 蛋白表达明显升高(μ 分别为 7． 65，6． 13，6． 21，P
＜ 0． 05) ，狗肝菜多糖低剂量组 MMP － 1 蛋白表达无统
计学意义(μ = 1． 85，P ＞ 0． 05)。狗肝菜多糖高、中剂
量组与秋水仙碱组比较，差异无统计学意义(μ = 2． 15，
2． 03，P ＞ 0． 05)。
2． 2 TIMP －1 表达情况 TIMP － 1 在正常组中表达着
色浅，范围窄;模型组细胞棕褐颗粒状，范围较广;狗肝
菜多糖高、中剂量组、秋水仙碱组 TIMP －1 表达着色浅，
范围窄;与正常组比较，模型组 TIMP － 1 蛋白表达明显
升高(μ = 7． 74，P ＜ 0． 05) ;与模型组比较，狗肝菜多糖
高剂量组、中剂量组、秋水仙碱组 TIMP － 1 蛋白表达明
显降低(μ分别 6． 01，5． 12，3． 25，P ＜ 0． 05) ;狗肝菜多
糖高、中剂量组与秋水仙碱组比较，差异无统计学意义
(μ = 2． 38，2． 02，P ＞ 0． 05)。
表 1 狗肝菜多糖对肝纤维化大鼠肝组织
MMP －1 和 TIMP － 1 表达的影响(只)
分组 大鼠数
MMP －1
－ + + + + + +
TIMP －1
－ + + + + + +
正常组 12 2 4 5 1 10 2 0 0
模型组a 10 5 5 0 0 0 3 4 3
秋水仙碱组ab 11 2 5 4 0 2 6 3 0
狗肝菜多糖高剂量组ab 11 1 6 4 0 2 7 2 0
狗肝菜多糖中剂量组ab 10 1 6 3 0 1 8 1 0
狗肝菜多糖低剂量组a 10 4 5 1 0 0 4 4 2
注:与正常组比较，aP ＜ 0． 05;各用药组与模型组比较，bP ＜ 0． 05。
3 讨论
肝纤维化的发生一般是细胞外基质的生成与沉积
增加，造成细胞外基质积累，最后导致肝纤维化，甚至肝
硬化。影响细胞外基质降解的主要是 MMPS 和 TIMPS，
其中，降解细胞外基质主要成分Ⅰ、Ⅲ型胶原的 MMP －
1 和 TIMP －1 被认为发挥了关键作用。TIMP － 1 是抑
制 MMPS活性的一组多功能因子家族的主要成员之一，
是一种分子质量单位约为 28． 5 ku 的糖蛋白，在肝脏中
由库普弗细胞、肝星状细胞及肌纤维母细胞产生，活化
的肝星状细胞表达 TIMP － 1 最强，TIMP － 1 主要抑制
MMP －1 的活性。很多学者把 TIMP － 1 看做是肝纤维
化发生过程中的一个非常重要的促发因素，因而 TIMP
－1 在肝组织中的表达水平可以反映肝组织学纤维化
程度［4，5］。在正常情况下，两者处于动态平衡，维持肝内
细胞外基质质和量的稳定。肝纤维化中，一般有 MMPS
的减少和 TIMPS的增加。新近，张可锋等［6］用 CCL4 制
备小鼠急性肝损伤模型，发现狗肝菜水部位和正丁醇部
位组的不同剂量组均可明显抑制小鼠血清中谷丙转氨
酶、谷草转氨酶的升高，显著降低丙二醛含量、提高超氧
化物歧化酶活性，改善肝细胞的变性坏死，其作用效果
与联苯双酯相比无显著性差异，说明狗肝菜具有降酶、
保肝的作用，机制可能与狗肝菜提高肝细胞抗氧化能
力、抗膜脂质过氧化有关。张小玲等［7］利用 D － GalN
建立大鼠急性肝损伤模型，观察各组大鼠血清 ALT、AST
水平，结果显示，狗肝菜多糖组大鼠血清 ALT、AST 水平
较模型组明显降低，病理形态学显示，狗肝菜多糖组大
鼠肝细胞变性、坏死较模型组均明显减轻，说明狗肝菜
多糖能够减轻 D － GalN 所致肝损害，对肝细胞有保护
作用。所以，本实验利用 DMN诱导大鼠肝纤维化模型，
观察狗肝菜多糖对肝纤维化大鼠肝组织 MMP － 1 及
TIMP －1 蛋白表达的影响，探讨狗肝菜抗肝纤维化的机
制。
本实验检测结果显示，模型组 TIMP －1 表达明显高
于正常组，MMP － 1 表达却较正常组明显降低，证实
TIMP －1 与 MMP －1 表达失调，在肝纤维化形成中起了
重要作用。狗肝菜多糖高、中剂量组中 TIMP －1 表达与
模型组比较，染色强度和阳性细胞数明显降低，MMP － 1
染色强度和阳性细胞数较模型组明显增高，提示狗肝菜
多糖可能通过抑制 TIMP － 1 蛋白在肝纤维化大鼠肝组
织中的表达，提高 MMP －1 蛋白在肝纤维化大鼠肝组织
中的表达，使细胞外基质生成减少，这可能是狗肝菜多
糖抗肝纤维化的作用机制之一，但狗肝菜多糖抗纤维化
的具体机制还有待于进一步研究。
参考文献
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(收稿日期:2011 － 05 － 29)
·5131·临床和实验医学杂志 2012 年 8 月 第 11 卷 第 16 期