全 文 ：微生物学通报 MAY 20, 2011, 38(5): 780−785
Microbiology China © 2011 by Institute of Microbiology, CAS
tongbao@im.ac.cn


基金项目：NSFC-云南联合基金项目(No. U0932601)
* 通讯作者：Tel: 86-871-5035263; : lihxu@ynu.edu.cn
收稿日期：2010-09-27; 接受日期：2010-12-27
主编点评文章
灯台树内生放线菌多样性及抗菌活性评价
黄海玉 1 李洁 1,2 赵国振 1 朱文勇 1 段学伟 1 李秀萍 1 赵立兴 1 徐丽华 1*
(1. 云南大学 云南省微生物研究所 云南省生物资源保护与利用重点实验室 云南 昆明 650091)
(2. 中国科学院南海海洋研究所 广东省海洋药物重点实验室 广东 广州 510301)


摘 要: 从云南西双版纳采集 7 份灯台树样品, 经过表面消毒, 用 4 种分离培养基分离得到 105
株内生放线菌。经 16S rRNA 基因序列分析鉴定, 分布于 7 个科 9 个属。利用 5 种植物病原真菌指
示菌对所有菌株的发酵液进行抗菌活性检测。结果显示, 有 12.4%、14.3%、11.4%、12.4%、8.6%
的菌株分别对镰刀霉、疫霉、赤星霉、苹果炭疽、白色念珠菌有抗性。对 3 株具有广谱抗菌活性
的菌株进行再次发酵和抗菌活性复筛, 结果显示这 3 株的抗菌活性稳定, 并可能含有生物碱类化
合物。
关键词: 灯台树, 内生放线菌, 分离, 鉴定, 抗菌活性
Diversity and antimicrobial activities of endophytic
actinomycetes isolated from Alstonia scholar
HUANG Hai-Yu1 LI Jie1,2 ZHAO Guo-Zhen1 ZHU Wen-Yong1 DUAN Xue-Wei1
LI Xiu-Ping1 ZHAO Li-Xing1 XU Li-Hua1*
(1. Laboratory for Conservation and Utilization of Bio-resources, Yunnan Institute of Microbiology, Yunnan University,
Kunming, Yunnan 650091, China)
(2. Guangdong Key Laboratory of Marine Materia Medica, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of
Sciences, Guangzhou, Guangdong 510301, China)
Abstract: One hundred and five endophytic actinomycetes were isolated using four different media
from surface-sterilized tissues of 7 plants samples of Alstonia scholar collected from Xishuangbanna
Yunnan province, southeast China. The results showed that they belong to 9 genera, 7 families by 16S
rRNA gene sequences analysis. All actinomycete strains fermentation liquids were carried out the an-
timicrobial activities test against five plant pathogenic fungi. The results showed that 12.4%, 14.3%,
11.4%, 12.4%, 8.6% endophytic actinomycetes presented antimicrobial activity for Fusarium
graminearum, Phytophthora nicotianae, Alternaria alternata, Colletotrichum gloeosporioides and
Candida albicans, respectively. Three strains with strong antibacterial activities were refermented and
DOI:10.13344/j.microbiol.china.2011.05.020
黄海玉等: 灯台树内生放线菌多样性及抗菌活性评价 781

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rescreened, their antimicrobial activities were stability, and may produce alkaloids.
Keywords: Alstonia scholar, Endophytic actinomycetes, Isolation, Identifiation, Antimicrobial activity
灯台树 Alstonia scholar (L) R. Bro., 属夹竹桃
科(Apocynaceae)鸡骨常山属的常绿乔木。灯台树在
民间用树皮治疗头疼、伤风、支气管炎、妊娠呕吐
和溃疡出血等[1−2], 其提取物具有细胞毒活性、抗肿
瘤活性, 可治疗呼吸道和消化道疾病等 [3−4]。目前,
灯台树的研究主要集中在对其化学成分、药理和药
效作用方面[5−7], 且有一定的药理活性, 因此受到研
究者的广泛关注, 但关于灯台树内生菌的研究尚未
见报道。1993 年 Stierle 等[8]从短叶紫杉中发现产紫
杉醇的内生真菌, 从而激发了人们研究植物内生菌
的极大兴趣。近几年的研究表明, 从植物内生菌代
谢产物中分离到的活性物质, 大约有 51%是未知的
新化合物, 而从土壤微生物代谢产物中分离新化合
物的几率只有 38%[9], 从而使植物内生菌得到广泛
关注。放线菌是一类广泛存在于植物中, 而且产生
抗生素及生物活性物质最多的微生物资源, 当前临
床和农牧业上应用的抗生素有 60%以上是放线菌生
产的 [10]。本文采用纯培养法分离灯台树内生放线
菌 , 通过对物种多样性、抗菌活性和分类学研究 ,
为药用微生物资源的研究、保护和寻找微生物源的
天然产物提供一定的理论依据和实践指导。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品: 灯台树样品于 2009 年 6 月采自西双
版纳。
1.1.2 培养基: (1) 分离培养基:
TWYE[11](g/L): 酵母浸膏 0.25, K2HPO4 0.5, 琼
脂 15, pH 7.2。
海藻糖-脯氨酸培养基(g/L): 海藻糖 6, 脯氨酸
1, KNO3 0.5, Na2HPO4 0.3, MgSO4·7H2O 0.2, CaCl2
0.3, 琼脂 15, pH 7.2。
L-天门冬氨酸-纤维素培养基(g/L): L-天门冬氨
酸 1, 纤维素 3, K2HPO4 1, 琼脂 15, pH 7.2。
丙 酸钠 培养基 (g/L): 丙 酸 钠 2, NH4NO3 0.1,
KCl 0.1, MgSO4 0.05, FeSO4 0.05, 琼脂 15, pH 7.2。
每种分离培养基均加入如下抑制剂: 萘啶酮酸
25 mg/L, 重铬酸钾 25 mg/L。
(2) 发酵培养基 (g/L): 可溶性淀粉 10, 葡萄
糖 10, 蛋白胨 5, 酵母膏 5, NaCl 4, K2HPO4 0.5,
MgSO4·7H2O 0.5, CaCO3 2, pH 7.2。
(3) 抗菌实验培养基(PDA 培养基, g/L)[12]: 马
铃薯(去皮) 200, 葡萄糖 20, 琼脂 15, pH 自然。
1.1.3 主要试剂和仪器: 薄层层析用 GF254 硅胶购
自青岛海洋化工厂; 改良碘化铋钾试剂用时新鲜配
制, 溶菌酶、蛋白酶、dNTPs、Taq 酶等购自上海生
工生物工程技术服务有限公司; DNA Marker 购自宝
生物工程(大连)有限公司, 其余试剂为国产分析纯
试剂。电泳仪为 Bio-Rad, PCR 仪为 Biometra 公司,
旋转蒸发仪为德国 Heidolph 公司的 Laborota 4000。
1.1.4 指示菌株: 镰刀霉 Fusarium graminearum、
疫 霉 Phytophthora nicotianae、 赤 星 霉 Alternaria
alternate、苹果炭疽菌 Colletotrichum gloeosporioides、
白色念珠菌 Candida albicans, 均由云南大学云南省
微生物研究所提供。
1.2 方法
1.2.1 灯台树内生放线菌的分离: 将灯台树样品表
面用自来水清洗干净, 然后按如下步骤进行表面消
毒: 0.01% Tween 20 浸泡 1 min, 有效氯含量为 5%
的次氯酸钠浸泡 3−4 min (根、茎、叶的处理时间不
同), 用无菌水清洗 3 次, 无菌 2.5%硫代硫酸钠浸泡
10 min, 75%乙醇处理 5 min, 无菌水清洗多次, 最后
用无菌 5%碳酸氢钠浸泡 10 min。取 0.2 mL 最后一
遍清洗植物样品的水涂布于 ISP 2 固体培养基上,
28 °C 培养 3−6 周, 进行消毒效果检测。在无菌条件
下将植物组织粉碎后撒在分离平板上, 分离培养基
中加入 25 mg/L 重铬酸钾和奈啶酸作为抑制剂, 在
28 °C 培养 4 周后挑菌。
1.2.2 灯台树内生放线菌的系统发育分析: 选取代
表 性 菌 株 进 行 DNA 的 提 取 [13] 。 用 PA (8-27f:
5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)做为正向引物,
扩增 16S rRNA 基因部分片段(953−1 134 bp)。PCR
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产物直接送上海生工生物技术有限公司测序, 所测
序列利用 BLAST 软件进行序列相似性分析 , 用
MEGA 3.1 的 Neighbor-Joining 法[14]构建系统进化树。
1.2.3 内生放线菌摇瓶发酵 : 将实验菌株接种于
100 mL 发酵培养液中, 28 °C、200 r/min 摇床振荡培
养 168 h, 离心, 取上清液备用。
1.2.4 抗菌活性检测: 用双层平板法[15]检测试验菌
株的抗菌活性, 每孔滴加 80 µL 发酵液, 空白培养
基作阴性对照, 在 28 °C 培养 24−48 h。并且进行抗
菌活性的复筛, 方法与初筛一致。
1.2.5 生物碱检测: 取较强抗菌活性菌株的发酵液
用乙酸乙酯萃取 , 旋转蒸发仪蒸干后用适量的甲
醇溶解置于 4 °C 冷藏备用。用 GF254 层析板展层,
254 nm 检测是否具有荧光点, 然后再用改良的碘化
铋钾显色。
2 结果与分析
2.1 灯台树内生放线菌多样性
表面消毒效果检测显示, 在 28 °C 培养 4 周的平
板均没有菌落长出 , 证明植物样品表面消毒彻底 ,
所分离得到的菌株均为植物内生菌。
用上述 4 种分离培养基从 7 份灯台树样品中共
分离到 105 株放线菌, 根据菌株在 ISP 2 培养基上的
菌落形态和颜色的差异去重复, 从中选取 17 株代表
性菌株。16S rRNA 基因发育分析的结果显示(图 1)
它们分属于 6 个亚目, 7 个科, 9 个属, 分别为: 链霉
菌 亚 目 (Suborder Streptomycineae) 中 链 霉 菌 科
(Streptomycineae)的链霉菌属(Streptomyces); 棒杆
菌亚目 (Suboder Corynebacterineae)中诺卡氏菌科
(Nocardiaceae)的 诺 卡 氏 菌 属 (Nocardia)和 红 球 菌
属 (Rhodococcus); 丙 酸 杆 菌 亚 目 (Suboder Propi-
onibacterineae)中 类 诺 卡 氏 菌 科 (Nocardioidaceae)
的 韩 国 生 工 菌 属 (Kribbella); 小 单 孢 菌 亚 目
(Suborder Micromonosporineae) 中 小 单 孢 菌 科
(Micromonosporaceae) 的 小 单 孢 菌 属
(Micromonospora); 微球菌亚目 (Suboder Micrococ-
cineae) 中 微 球 菌 科 (Micrococcaceae) 的 微 杆 菌 属
(Micrococcus)和考克氏菌属(Kocuria); 假诺卡氏菌
亚目 (Suborder Pseudonocardineae)中假诺卡氏菌科
(Pseudonocardiaceae) 的 假 诺 卡 氏 菌 属
(Pseudonocardia); 链孢囊菌亚目(Suborder Strepto-
sporangineae) 中 高 温 单 孢 菌 科
(Thermomonosporaceae) 的 珊 瑚 放 线 菌 属
(Actinocorallia)[16] 。 17 株 代 表 菌 株 中 链 霉 菌 属
(Streptomyces) 7 株, 诺卡氏菌属(Nocardia) 2 株, 韩
国 生 工 菌 属 (Kribbella) 2 株 , 小 单 孢 菌 属
(Micromonospora) 1 株 , 红球菌属(Rhodococcus) 1
株 , 微 杆 菌 属 (Micrococcus) 1 株 , 假 诺 卡 氏 菌 属
(Pseudonocardia) l 株, 考克氏菌属(Kocuria) 1 株,
珊瑚放线菌属(Actinocorallia) 1 株。该结果表明, 灯
台树植物内具有丰富的放线菌物种多样性, 其优势
类 群 为 链 霉 菌 (Streptomyces), 其 次 是 诺 卡 氏 菌 属
(Nocardia)和假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)。
2.2 抗菌活性评价
抗菌活性检测结果表明(表 1), 在所检测的 105
株放线菌中有 33 株表现出至少对 1 种指示菌有抗菌
活性, 占检测菌株的 31.4%, 阴性对照没有表现出
抗菌活性, 有 12.4%、14.3%、11.4%、12.4%和 8.6%
的菌株分别对镰刀霉、疫霉、赤星霉、苹果炭疽和
白色念珠菌有抗性。16S rRNA 基因分析结果显示,
这些菌株以链霉菌为主, 稀有放线菌大部分都未表
现出活性。结果表明, 链霉菌依然是活性物质的主
要菌源, 此外这也可能与菌株的发酵条件有关。其
中有 3 株菌 YIM 61644、YIM 61744 和 YIM 61757
对 5 种指示菌均具有较强的活性, 复筛的结果说明
这 3 株菌在所选发酵培养基上活性稳定, 具有一定
的开发潜力。
2.3 生物碱检测
灯台树化学成份研究表明, 其代谢产物以生物
碱为主[17], 而且具有抗菌和抗肿瘤等活性[18]。为探
索灯台内生放线菌中是否存在类似灯台树中的生物
碱类化合物, 我们对 3 株高活性广谱抗菌菌株的代
谢产物进行了生物碱化学筛选, 经过紫外观察和生
物 碱 通 用 显 色 剂 碘 化 铋 钾 显 色 检 测 , 菌 株 YIM
61644、YIM 61744 和 YIM 61757 这 3 株菌的发酵提
取物在 254 nm 紫外观察时均有明显的斑点, 并经碘
化铋显色时均显黄色, 说明这 3 株菌有可能产生生
物碱, 值得深入研究。
黄海玉等: 灯台树内生放线菌多样性及抗菌活性评价 783

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图 1 根据 16S rRNA 基因序列构建部分菌株系统进化树
Fig. 1 Neighbour-Joining phylogenetic tree based on almost-complete 16S rRNA gene sequences
Note: Numbers at nodes are levels of bootstrap support for branch points, based on 1 000 resamplings; Values are shown only if greater than
50%. The GenBank accession number are showed in parentheses after each strain name. The sequence of Bacillus acidiceler DSM 18954T
was used as the outgroup. Bar, 2% nucleotide substitutions per position.

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表 1 分离菌株的抗菌活性
Table 1 Antimicrobial activity tests of isolates (mm)
菌号
No. of strains
属名
Genus name
镰刀霉
Fusarium
Graminearum
疫霉
Phytophthora
nicotianae
赤星霉
Alternariaal
ternata
苹果炭疽
Colletotrichum
gloeosporioides
白色念珠菌
Candida
albicans
YIM 61628 Streptomyces − − 4 − −
YIM 61631 Streptomyces − − − 3 −
YIM 61632 Streptomyces 5 5 − 4 4
YIM 61633 Streptomyces − − 6 − −
YIM 61634 Streptomyces − 4 − 4 5
YIM 61640 Streptomyces 5 − − 10 8
YIM 61644 Streptomyces 16 4 8 7 9
YIM 61700 Kribbella 8 − − 9 5
YIM 61704 Nocardia 4 11 − − −
YIM 61744 Streptomyces 8 14 12 5 −
YIM 61757 Streptomyces 1 11 9 − 12
YIM 61758 Streptomyces 12 − − − −
YIM 61760 Streptomyces 11 − 12 − −
YIM 61761 Streptomyces 10 − − − 9
YIM 61769 Streptomyces − − − 10 −
YIM 61770 Streptomyces − − 1 − −
YIM 61777 Streptomyces − − − − −
YIM 61778 Streptomyces 12 10 − − −
YIM 61779 Streptomyces 10 6 − − −
YIM 61780 Streptomyces 13 − − − 10
YIM 61792 Streptomyces − 9 − 8 −
YIM 61796 Streptomyces − − − 10 −
YIM 61799 Streptomyces − 4 − − −
YIM 61800 Micrococcus − 9 − 8 −
YIM 61801 Streptomyces − 8 − 10 −
YIM 61805 Streptomyces − 6 − − −
YIM 61806 Streptomyces − − − − 12
YIM 61808 Streptomyces − − 8 10 −
YIM 61809 Streptomyces − 11 − − −
YIM 61810 Streptomyces − 12 9 − −
YIM 61816 Streptomyces − − 12 − −
YIM 61819 Streptomyces − − 10 − −
YIM 61823 Streptomyces − − 5 − −
注: 数字: 抗菌活性圈直径; −: 未检测到活性.
Note: Numbers: Diameter of inhibation activity transparent circle; −: Negative.
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3 讨论
随着从来源于普通环境土壤微生物中分离、筛
选新化合物几率的不断下降, 人们已经逐步将注意
力转向了特殊生境的微生物[19]。植物内生菌能够产
生结构新颖、功能特殊的次生代谢产物, 并且由于
植物内生菌在植物体内经过与植物宿主的长期协同
进化, 使植物内生菌可能产生与宿主植物一样或是
相似以及独特代谢产物的潜力 , 因此成为发现天
然活性产物的重要来源 , 也是发现新化合物和新
药物的潜在资源 , 在农业和医药业中具有重要的
应用前景[20]。本研究表明, 分离得到的 105 株内生
放线菌分布于 7 个科 9 个属, 显示了灯台树内存在
丰富的内生放线菌。它们对植物病原菌具有普遍的
抗性, 部分菌株对所检测的所有指示菌均有较好的
广谱抗性, 而且抗菌活性稳定。本研究筛选到 3 株
具有较好广谱抗菌活性的链霉菌菌株 , 其活性可
能与它们代谢产物中的生物碱有关系 , 值得进一
步研究。
参 考 文 献
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