全 文 ：第 34卷第 3期
2 0 1 1年 5月
河 北 农 业 大 学 学 报
JOURNA L OF AGRICULT URAL UNIVERS IT Y OF HEBEI
　 　 Vol.34 No.3
May .2 0 1 1
文章编号:1000-1573(2011)03-0050-06
麦冬和菊三七药用植物内生放线菌的多样性
及产酶特性的研究
张秀敏 , 　马友楠 , 　王　顺 , 　张利平
＊ (河北大学 生命科学学院 , 河北省微生物多样性研究与应用实验室 , 河北 保定 071002)
摘要:从麦冬(Ophiopogon ja ponicus)和菊三七(Gynura j aponica)2 种药用植物根部共分离得到 47株内生放线
菌 ,其中分离自麦冬的有 24 株 ,分离自菊三七的有 23 株。对 47菌株进行了分泌胞外淀粉酶 、蛋白酶 、脂肪酶和
纤维素酶特性的研究。结果表明:从以上 2种药用植物中分离得到的内生放线菌中具有产胞外淀粉酶活性的菌
株 39 株 , 产纤维素酶活性的菌株 17 株 , 产蛋白酶活性的菌株 36株 , 既能产淀粉酶 ,又能产纤维素酶和蛋白酶的
菌种有 15 株 , 没有筛选到产脂肪酶的菌株。对其中部分菌株进行了 16S r DNA 序列系统发育分析 , 可知 , 绝大
多数内生放线菌为链霉菌(Streptomyces), 其次为小单孢菌属(Micromonospora)放线菌。
关　键　词:麦冬;菊三七;内生放线菌;功能酶;系统发育分析
中图分类号:Q 93 文献标志码:A
Study on biodiversity and feature of enzyme excreting about endophytic
actinomycetes isolated from Ophiopogon japonicus
Ker-Gawl.and Gynura japonica Juel.
ZHANG Xiu-min , MA You-nan , WANG Shun, ZHANG Li-ping
(Key Labo rato ry o f M icrobial Diver sity Research and Application o f Hebei P rov ince , College o f Life Sciences ,
Hebei Univ ersity , Baoding 071002 , China)
Abstract:The re were 24 and 23 strains o f endophy tic actinomyce tes isolated f rom Ophiopogon
japonicus Ker-Gaw l and Gynura japonica Juel , respectively.The results of phy logenet ic anal-
ysis based on 16S rDNA sequences about partial st rains indicated that most iso lated st rains be-
longed to S trep tomyces and Micromonospora.The feature of excreting enzyme about these
strains w as studied.T he resul t show ed that the number of st rains w hich could produce amyl-
ase , pro tease , cellulase and lipase w ere 39 , 17 , 36 , respectively.And the st rains w hich could
simul taneously produce amy lase , pro tease and cellulase w ere 15.No strains were found to pro-
duce lipase.
Key words:Ophiopogon japonicus Ker-Gaw l.;Gynura japonica Juel.;endophy tic actinomyce-
tes;enzyme;phy logene tic analy sis
　　放线菌是一类产生生物活性物质比其他微生物
更为丰富的生物资源 。目前己有效描述的放线菌至
少有 290多个属 , 2 500多个种[ 1] ;从放线菌发现的
生物活性物质至少有 11 000多种[ 2] 。植物内生放
＊收稿日期:2010-12-31
基金项目:河北省自然科学基金项目(C2010000260);河北大学引进人才专项基金项目(2007-711).
作者简介:张秀敏(1970-),女 , 河北省涞水人 , 博士 ,副教授 , 主要从事微生物资源与物种多样性研究.
E-mail:zhxiumin1106@126.com.
　第 3期　 张秀敏等:麦冬和菊三七药用植物内生放线菌的多样性及产酶特性的研究
线菌长期生活在植物体内微环境中 ,并与之协同进
化 ,一方面植物为内生放线菌提供光合作用的产物
和矿物质 ,另一方面内生放线菌的代谢产物能刺激
宿主植物的生长发育 ,提高宿主植物对生物胁迫和
非生物胁迫的抵抗能力。这种特殊的生态环境决定
了物种的特殊性 ,新物种必定有新基因 ,新基因必然
有新产物 。药用植物作为一类特殊的植物 ,其内生
环境不同于一般植物 ,其内生放线菌在与它们协同
进化过程中 ,可能产生新的基因及代谢产物。
麦冬(Ophiopogon japonicus Ker-Gaw l.)和菊
三七(Gynura japonica Juel.)是 2种可人工栽培的
药用植物 ,前者功效主要是滋阴润肺 、生津止咳 ,后
者主要是止血 、消肿。目前关于麦冬和菊三七药用
植物内生放线菌的研究还没有相关的报道。本研究
旨在从这 2种药用植物中分离内生放线菌 ,并对它
们的多样性及产酶特性进行研究 ,以期得到新的放
线菌物种资源及产功能酶活性的菌株 ,为对其进一
步的开发利用奠定基础。
1　材料和方法
1.1　材料来源
麦冬 、菊三七购于安国药材种植基地。
1.2　内生放线菌的分离
1.2.1　分离培养基　采用 S 培养基[ 3] 并添加萘啶
酮酸(终浓度 30 μg/mL)和放线菌酮(终浓度 50
μg/mL)。
1.2.2　分离方法　①选取适量根部材料 ,清水浸泡
30～ 60 min ,无菌水清洗 2 ～ 3遍 , 75%酒精浸泡 5 ～
10 m in ,0.1%HgCl2 浸泡 2 ～ 5 min ,无菌水清洗3 ～
4遍 ,取清洗的最后一遍水适量涂布平板 ,作为对
照 ,以检验表面消毒情况。 ②将表面消毒好的材料
剪碎后用灭菌研钵研成匀浆状 ,直接取匀浆液涂布
S 培养基平板 ,置于 28 ℃培养 ,2 ～ 4周 。
1.2.3　菌种的纯化和保藏　将挑取的单菌落划线
接种S 平板 ,至长出单菌落 ,再转接单菌落至 S斜面
培养基 ,28 ℃培养 5 ～ 7 d ,之后 4 ℃保藏。同时接
种至 S 液体培养基 ,28 ℃摇床振荡培养 3 ～ 6 d后 ,
取菌悬液加入含有 30%的甘油管中 ,置于-80 ℃冰
箱冷冻保藏。
1.3　产酶菌株的筛选
参照周旭华等[ 4] 方法并有所改进 。
分别以 1%可溶性淀粉 、1%脱脂奶粉 、1%
CMC-Na 和 1%的 Tw een 80 作为淀粉酶(Amyl-
ase)、蛋白酶(Protease)、纤维素酶(Cellulase)和脂
肪酶(Lipase)的作用底物添加到 S 培养基上制成筛
选平板 。将新活化的纯种培养物点接在筛选平板
上 ,28 ℃倒置培养至形成明显菌落 ,每个菌株每个
筛选平板做 3个平行。观察菌落周围透明圈或白色
晕圈的产生情况以定性地判断底物利用状况及菌株
产酶能力。具体判定方法如下:
1.3.1　淀粉酶　待菌落长成后 ,用 Lugol′s 碘液
(1 g 碘和 2 g 碘化钾溶于 300 mL 去离子水中)均
匀铺于平板上染色数分钟 ,之后倒掉碘液 ,观察透明
圈的产生情况 ,有则为阳性 ,为淀粉酶产生菌。
1.3.2　蛋白酶　待菌落长成后 ,可直接观察透明圈
的产生情况 ,有则为阳性 ,为蛋白酶产生菌 。
1.3.3　纤维素酶　待菌落长成后 ,用 1%的刚果红
染液染色 15 ～ 30 min , 然后依次用去离子水和
1 mo l/L的 NaCl溶液彻底洗去染液 ,再用 5%醋酸
固定染色 ,观察透明圈的产生情况 ,有则为阳性 ,为
纤维素酶产生菌。
1.3.4　脂肪酶　待菌落长成后 ,直接观察菌落周围
有无白色晕圈出现 ,有则为阳性 ,为脂肪酶产生菌。
1.4　16S rDNA系统发育分析
1.4.1　基因组 DNA 的提取　基因组 DNA 的提取
参照 Fred等人[ 5] 的方法 ,并有所改进。
1.4.2　16S rDNA 扩增　PCR扩增 16S rDNA 采
用通用引物 , 27f[ 6] (对应 E.col i 8-27 碱基:5′-
GAGT TTGA TCCTGGCTCAG-3′), 1525r[ 7] (对应
E.coli1525-1545 碱基:5′-AGA AAGGAGG TG-
TACCAGCC-3′)。
反应体系 50μL:引物 27f(20 μmo l/L)1μL ,引
物 1525 r(20 μmo l/L)1 μL , dNT P(10 mmo l/L)
1 μL ,10×Buf fer 5 μL , TaqDNA 聚合酶(2.5 U/
μL)1 μL , 基因组 DNA 1 μL(50 ng), ddH2O 40
μL。
PCR反应条件:94 ℃, 4 min;95 ℃, 0.5 min ,
55 ℃, 0.5 min , 72 ℃,1.5 min ,30个循环;72 ℃,10
min 。
PCR扩增产物由北京三博远志生物公司进行
测序。
1.4.3　系统发育树的构建　将所测得的菌株 16S
rDNA序列在 Genbank 数据库中与已知的 16S rD-
NA 序列进行 BLAST 同源性比较 ,调出相关模式
菌株的 16S rDNA 序列 ,采用 BioEdi t7.0软件中的
Clustal W
[ 8] 软件进行多序列比对 , 利用 MEGA
4.1[ 9] 软件包中的邻接法构建系统发育树 ,分析其系
统发育地位 。
51
　　　　　 河 北 农 业 大 学 学 报 第 34卷
2　结果与分析
2.1　内生放线菌的分离结果
共分离得到 47株内生放线菌 ,其中分离自麦冬
的有 24株 ,分离自菊三七的有 23株 。图 1是培养
2周后的部分分离平板 ,其中图 1A 分离自麦冬药用
植物 ,图 1B 是分离自菊三七药用植物。从分离平
板上可以看出 ,分离自麦冬的平板具有小单孢菌特
征(通常无气生菌丝 ,菌落较湿润)的菌落相对较多 ,
而分离自菊三七的平板具有链霉菌特征(气生菌丝
比较旺盛 ,绒毛状或皮革状)的菌落相对较多 。
图 1　内生放线菌分离平板
Fig.1　Isolated plates of endophytic act inomycetes
2.2　产酶菌株的筛选结果
对上述分离得到的 47 株药用植物内生放线菌
菌株进行胞外淀粉酶活性的筛选。图 2为部分菌株
的蛋白酶活性筛选平板。其中图 2A 为分离自麦冬
的部分内生放线菌筛选平板 ,图 2B 为分离自菊三
七的部分内生放线菌筛选平板 。
图 2　内生放线菌蛋白酶活性筛选平板
Fig.2　Screening plates of protease produced from
endophytic actinomycetes
分离自麦冬的 24株内生放线菌中 ,产胞外淀粉
酶的菌株有 20株 ,产蛋白酶的有 4株 ,产纤维素酶
的有 20株 ,没有筛选到产脂肪酶的菌株 ,其中既能
产淀粉酶 ,又能产纤维素酶和蛋白酶的菌种有 4 株
(见表 1)。
表 1　分离自麦冬药用植物的内生放线菌
菌株功能酶活性筛选结果
Table 1　The result of enzyme screening Ophiopogon
j aponicus Ker-Gawl.
菌株编号
Strain number
酶活性
Activity o f enzyme
淀粉酶
Amy lase
脂肪酶
Lipa se
蛋白酶
Protease
纤维素
Cellulase
M D-10 + - - +
M D-11 + - - -
M D-12 + - - +
M D-13 + - - +
M D-14 + - + +
M D-15 + - + +
M D-16 + - - +
M D-17 + - - +
M D-18 + - - +
M D-19 + - - +
M D-20 + - - +
M D-21 - - - +
M D-22 + - - +
M D-24 - - - -
M D-25 + - - +
M D-29 + - + +
M D-31 + - + +
M D-33 + - - +
M D-34 + - - -
M D-38 + - - +
M D-41 + - - +
SM-1 - - - -
SM-2 + - - +
SM-3 - - - +
　　注:“ +”为阳性;“ -”为阴性;“N”为无数据 ,下表同。
分离自菊三七的 23株内生放线菌中 ,产胞外淀
粉酶的菌株有 20株 ,产蛋白酶的有 13株 ,产纤维素
酶的有 16株 ,没有筛选到产脂肪酶的菌株 ,其中既
能产淀粉酶 ,又能产纤维素酶和蛋白酶的菌种有 11
株(见表 2)。
表 2　分离自菊三七药用植物的内生放线菌
菌株功能酶活性筛选结果
Table 2　The result of enzyme screening
Gynura j aponica Juel.
菌株编号
Strain number
酶活性
Activity o f enzyme
淀粉酶
Amy lase
脂肪酶
Lipa se
蛋白酶
Protease
纤维素酶
Cellulase
T J-23 + - - +
TJ-24 + - - N
TJ-25 + - + +
TJ-27 + - - +
TJ-28 + - - +
TJ-29 + - + +
TJ-32 + - + +
TJ-33 + - + +
TJ-34 + - - -
TJ-35 + - - -
TJ-36 + - + +
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　第 3期　 张秀敏等:麦冬和菊三七药用植物内生放线菌的多样性及产酶特性的研究
续表
菌株编号
Str ain numbe r
酶活性
Ac tivity of enzyme
淀粉酶
Amy lase
脂肪酶
Lipase
蛋白酶
P ro tease
纤维素酶
Cellulase
T J-37 + - - N
TJ-39 + - - -
TJ-40 + - + +
TJ-41 + - + +
TJ-42 + - N +
TJ-47 + - + +
TJ-48 - - N N
TJ-49 + - + +
TJ-50 - - + +
TJ-55 + - + +
TJ-64 + - + +
TJ-66 - - + N
　　从上述结果可以看出 ,分离自同一宿主药用植
物的内生放线菌绝大多数(麦冬中占 75%;菊三七
中占 74%)具有 2种以上的功能酶活性 ,有少数产
生 1种(麦冬中占 17%;菊三七中占 22%)或不产生
功能酶(麦冬中占 8%;菊三七中占 4%)。既能产淀
粉酶 ,又能产纤维素酶和蛋白酶的菌株在麦冬中占
17%,在菊三七中占 48%。这表明药用植物内生放
线菌具有产多种水解酶(尤其是淀粉酶和纤维素酶)
的能力 ,并且不同宿主药用植物中内生放线菌产功
能酶的差异也较大 ,是一类具有很大开发前景的微
生物。
2.3　菌株 16S rDNA系统发育树的构建
从获得的 47株内生放线菌中 ,根据菌落形态 、
颜色选择其中的 12株作为代表 ,进行了 16S rDNA
系统发育分析 。该 12株内生放线菌 16S rDNA 序
列的注册号见表 3。
表 3　12 株内生放线菌 16S rDNA序列的注册号
Table 3　GenBank accession number of 16S rDNA sequencesof 12 endophytic actinomycetes strains
菌株编号
S train
numbe r
属水平分类地位
Genus
序列注册号
Accession numbe r
菌株编号
S train
number
属水平分类地位
Genus
序列注册号
Accession number
T J-25 S treptomyces sp. HQ850380 MD-38 S treptomyces sp. HQ850386
TJ-27 S treptomyces sp. HQ850381 TJ-35 Micromonospora sp. HQ850375
MD-16 S treptomyces sp. HQ850382 TJ-36 Micromonospora sp. HQ850376
MD-12 S treptomyces sp. HQ850383 TJ-39 Micromonospora sp. HQ850377
MD-25 S treptomyces sp. HQ850384 TJ-32 Micromonospora sp. HQ850378
MD-31 S treptomyces sp. HQ850385 TJ-41 Micromonospora sp. HQ850379
　　通过在 GenBank 中进行 BLAS T 比对及构建
的系统发育树(图 3 、图 4)表明 ,所分离菌株中绝大
多数为链霉菌属(S treptomyces)菌株 ,其中菌株 TJ-
25 与 S treptomyces chromo f uscus 亲缘关系最近 ,
16S rDNA 序列相似性为 98.40%;菌株 TJ-27 与
Streptomyces chromof uscus亲缘关系最近 ,16S rD-
NA 序列相似性为 98.30%;菌株 MD-16与 S trep-
tomyces bobi li 亲缘关系最近 , 16S rDNA 序列相似
性为 100%;MD-12与 S trep tomyces mutabi li s亲缘
关系最近 , 16S rDNA 序列相似性为 100%;MD-25
与 Streptomyces capi ll isp iral is 和 Streptomyces
griseo f lavus 亲缘关系最近 ,16S rDNA 序列相似性
均为 99.2%;MD-31 与 S treptomyces ciscaucasicus
和S treptomyces canus 亲缘关系最近 , 16S rDNA
序列相似性为 99.6%;MD-38 与 S treptomyces
gal i laeus 亲缘关系最近 , 16S rDNA 序列相似性为
99.9%。其次为小单孢菌属(Micromonospora)菌
株 ,其中菌株 TJ-35 与 Micromonospora p urpurea
亲缘关系最近 , 16S rDNA 序列相似性为 99.20%;
菌株 T J-36与 Micromonospora aurantiaca 亲缘关
系最近 , 16S rDNA 序列相似性为 99.60%;菌株
TJ-39与 Micromonospora narathiwatensis 亲缘关
系最近 , 16S rDNA 序列相似性为 98.20%;菌株
TJ-32与Micromonospora inosi tola 亲缘关系最近 ,
16S rDNA 序列相似性为 98.80%;菌株 TJ-41 与
Micromonospora auratinigra 和 Micromonospora
peucet ia 亲缘关系最近 , 16S rDNA 序列相似性均
为 98.00%;在已测序菌株中还未发现其他属的放
线菌。
53
　第 3期　 张秀敏等:麦冬和菊三七药用植物内生放线菌的多样性及产酶特性的研究
3　讨论
本试验利用 S 培养基对麦冬和菊三七 2种药用
植物内生放线菌多样性和产酶特性进行了研究。结
果表明 ,从这 2种药用植物中分离得到的内生放线
菌主要是链霉菌和小单孢菌。之所以没有获得其他
属的放线菌 ,分析原因可能是由于链霉菌和小单孢
菌在这 2种药用植物内为优势菌群 ,它们的生长抑
制了其他劣势菌群的生长;另外这 2种药用植物内
可能存在其他非可培养的放线菌类群 ,目前的分离
培养条件还不能获得它们的纯培养物。基于上述可
能原因 ,还应在分离培养方法上进一步增加选择性 ,
来提高一些劣势菌群的分离几率。除此之外 ,要想
更全面地了解这 2种药用植物内生放线菌的多样
性 ,还应尝试用宏基因组的方法进行研究。
上述研究结果还表明 ,分离自这 2 种药用植物
内的绝大多数内生放线菌能够分泌胞外淀粉酶 、蛋
白酶和纤维素酶 ,而且有些菌株还具有同时分泌这
3种水解酶的能力 。这种产酶特性可能与其适应独
特的生活环境有关。内生放线菌代谢产生的酶类能
刺激宿主植物的生长发育 ,提高宿主植物对生物胁
迫和非生物胁迫的抵抗能力。在弗兰克氏菌中 ,大
多数菌株可以耐受一定浓度的 Pb2+ 、CrO4 2- 、
AsO 4 3- 与 SeO 2 2- , 但 对 Ag + 、 AsO 2- 、 Cd2+ 、
S bO 2- 、Ni2+敏感 ,不同菌株对 Cu2+耐受程度也不
同 ,并且各种菌株对重金属离子的解毒机制也不相
同[ 10] ,可以推测解毒过程也包括多种酶的参与 ,显
示出功能多样性 。这同时也表明植物内生放线菌是
一类具有重要工业酶开发价值的微生物 。
目前国内外对植物内生放线菌资源的研究取得
了一定的进展 ,但相对于我国丰富的药用植物资源
来说 ,对其内生放线菌资源的开发和利用还是远远
不够的 。据普查统计 ,我国的中药资源种类有12 807
种 ,其中药用植物有 11 146种[ 11] 。药用植物作为一
类特殊的植物 ,其内生环境不同于一般植物 ,其内生
放线菌在与它们协同进化过程中 ,可能产生新的基因
及代谢产物 。全面系统地对药用植物内生放线菌资
源及其活性代谢产物进行研究是非常必要的。
参考文献:
[ 1] 　Euzé by J P.L ist o f P rokar yo tic names with Standing
in Nomenclature [ EB/OL ] .http:// ww w.bacterio.
cict.fr , 2010.
[ 2] 　Bé rdy J.Bioactive mic robial me tabo lites[ J] .The Jour-
nal of Antibio tics , 2005 , 58(1):1-26.
[ 3 ] 　Lechevalier M P , H or rie re B D.Physiolog y , chemis-
try , se rolog y , and infectivity o f two Frankia isolates
fr om Alnus incana subsp.[ J] .Rugo sa Can J Bot ,
1983 , 61:2826-2831.
[ 4 ] 　周旭华 , 吴敏 ,孟凡旭.舟山地区抗 Mn2+ 、Cr6+和产功
能酶嗜盐菌的筛选[ J] .浙江大学学报:理学版 ,
2010 , 37(1):92-95.
[ 5] 　F red A R, Rainey N W , Kroppenstedt R M , et al.The
Genus Nocardiopsis Represents a Phylogenetically
Coherent Taxon and a Distinct Ac tinomycete Line-
age:Proposal o f Nocardiopsaceae fam.nov[ J] .Int J
Sy st Evol M icrobiol , 1996 , 46:1088-1092.
[ 6] 　Edw ards U T , Rogall H , Blcker M , et a l.I so lation and
direc t comple te nucleo tide de te rmination of entire
g enes:characterization of a g ene coding for 16S ribo-
somal RNA[ J] .Nucleic Acids Res , 1989 , 17:7843 -
7853.
[ 7 ] 　Lane D J.16S/ 23S rRNA sequencing[ M] // Stacke-
brandt E , Goodfellow M .Nucleic acidtechniques in
bacterial sy stema tics.Chichester , UK:John Wiley &
Sons , 1991:115-175.
[ 8] 　Thompson J D , Higgins D G , Gibson T J.C LUSTAL
W:improving the sensitivity o f pr og ressive multiple
sequence alignment through sequence w eighting , po-
sitio n-specific g ap penalties and weight matrix choice
[ J] .Nucleic Acids Resear ch , 1994 , 22:4673-4680.
[ 9] 　Tamura K , Dudley J , Nei M , e t al.M EGA4:Molecula r
Evo lutiona ry Genetics Analy sis (MEGA)So ftwa re
Ver sion 4.0[ J] .Molecular Biolog y and Evo lution ,
2007 , 24:1596-1599.
[ 10] 　Richards J W , Krumho lz G D , Chval M S , et al.Heavy
metal resistance patterns of Frankia strains[ J] .Appl
Environ M icr obiol , 2002 , 68:923-927.
[ 11] 　秦路平.生物活性成分的高通量筛选[ M] .上海:第二
军医大学出版社 , 2002:14-20.
(编辑:宗淑萍)
55