全 文 ：中国农学通报 2012,28(10):21-26
Chinese Agricultural Science Bulletin
基金项目：国家林业公益性行业科研专项项目“重要乡土树种核心种质评价及高效育种共性技术研究”(201004009)；国家863快速反应课题“速生杨
树品种抗虫、抗旱耐盐转基因育种研究”(SQ2009AA10Z1484952)。
第一作者简介：任媛媛，女，1985年出生，河北临西人，在读博士，研究方向为林木抗逆生物技术。通信地址：100083北京市海淀区清华东路35号北
京林业大学生物科学与技术学院，Tel：010-62336248，E-mail：renyychina@163.com。
通讯作者：王延伟，男，1979年出生，河南平顶山人，博士，研究方向：林木遗传与分子育种。通信地址：100083北京市海淀区清华东路35号北京林业
大学生物科学与技术学院，Tel：010-62336248，E-mail：ywwang@bjfu.edu.cn。
收稿日期：2012-01-17，修回日期：2012-03-28。
河北杨脱水素基因(Phdhn1)的克隆与胁迫表达分析
任媛媛，王泽亮，康向阳，孙丰硕，杨 喆，张志毅，王延伟
（北京林业大学林木育种国家工程实验室/林木花卉遗传育种教育部重点实验室/
国家林业局树木花卉育种与生物工程重点开放实验室，北京 100083）
摘 要：为了鉴定河北杨中的脱水素基因并研究其在逆境胁迫中的表达规律，以初步分析脱水素基因在
河北杨逆境胁迫中的调控功能，在实验室前期工作的基础上设计引物，通过PCR方法扩增河北杨cDNA
文库获取脱水素基因，并通过半定量RT-PCR方法研究其在逆境中的表达情况。结果表明，河北杨脱水
素基因全长856 bp，共编码227个氨基酸。同源性分析表明，河北杨中的脱水素基因与已知的其他杨树
脱水素高度同源，因此将该基因定名为Phdhn1。半定量RT-PCR结果表明在干旱、低温、高温、高盐及
ABA溶液不同时间段(0、0.5、1、2、5、10、24 h)的胁迫下，河北杨Phdhn1在干旱、ABA以及低温胁迫下均
出现表达差异。该研究初步阐述了Phdhn1的逆境表达模式，说明了Phdhn1在河北杨逆境胁迫中起到
的重要作用。
关键词：河北杨；脱水素；胁迫；PT-PCR
中图分类号：S722 文献标志码：A 论文编号：2012-0157
Cloning and Expression Analysis of Dehydrin Gene (Phdhn1) in Populus hopeiensis Under Stress
Ren Yuanyuan, Wang Zeliang, Kang Xiangyang, Sun Fengshuo, Yang Zhe, Zhang Zhiyi, Wang Yanwei
(National Engineering Laboratory for Tree Breeding, Beijing Forestry University/Tree and Ornamental Plant Breeding and
Biotechnology Laboratory of State Forestry Administration/Key Laboratory of Genetics and Breeding in Forest Trees and
Ornamental Plants of Ministry of Education, Beijing 100083)
Abstract: In order to identify the dehydrin gene of Populus hopeiensis and analyze the expression regularity
under abotic stresses for the genetic regulation functions elucidation in stress, the primers were designed on the
basis of previous work in our lab and the gene was amplified by PCR using cDNA library, the expression of the
gene under abotic stresses was analyzed by semi-quantitative RT-PCR. The results indicated that dehydrin
gene of P. hopeiensis was 856 nucleotides long and encoded a protein of 227 amino acid sequences.
Sequencing and the homology analysis indicated that P. hopeiensis dehydrin gene was highly similar with
dehydrin gene in Populus species. Consequently P. hopeiensis dehydrin gene could be named Phdhn1.
Semi-quantitative RT-PCR expression analysis of Phdhn1 under drought, cold, heat, high salinity and ABA at
different stress stage (0, 0.5, 1, 2, 5, 10, 24 h) showed that it was differentially expressed in response to
drought, ABA and cold stresses. The study showed that Phdhn1 played an important role in abotic stresses of P.
hopeiensis.
Key words: Populus hopeiensis; dehydrin; stress; RT-PCR
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0 引言
脱水素(dehydrin)最早发现于20世纪80年代[1]，属
于Lea D-Ⅱ蛋白家族（晚期胚胎发生蛋白），是植物在
胚胎发生晚期或受到干旱、高盐、低温等失水环境胁迫
时大量表达的一类蛋白[2]。有研究表明脱水素能够清
除胁迫所带来的活性氧自由基，维持细胞的自由基平
衡，防止细胞膜的过氧化，还能在植物脱水时代替失去
的水分子与细胞膜相结合，阻止水分的过多流失，从而
防止细胞的膜结构塌陷。此外脱水素中的部分保守性
片段和氨基酸残基能够与蛋白质相结合，从而稳定和保
护蛋白质的结构及功能，增强植物抵抗逆境的能力[3]。
大部分的脱水素蛋白成员都含有1个高度保守性
的双亲水性α-螺旋（K片段)，而部分成员会含有1个丝
氨酸片段（S片段），和 1个N端保守序列（Y片段），除
此之外，脱水素还具有一些保守性较差的区域分布在
保守片段之间。不同的脱水素具有多个不同的片段组
合，1个脱水素蛋白中可以有 1~11个K片段拷贝。脱
水素在植物未受诱导时表达量较低，在逆境条件下表
达量增高，其表达量与植物抗逆能力的大小成正比，即
在抗性较弱的植株中脱水素表达量低于抗性较强的植
株[4]。对脱水素基因表达调控的研究是人们关注的焦
点之一。脱水素基因在籼稻、欧美杨、拟南芥等中的成
功克隆及基因的序列分析，尤其是在干旱等逆境条件
下的表达分析，为进一步了解、鉴定及利用植物脱水素
打下了基础[5-7]。
河北杨(Populus hopeiensis Hu et Chow)属杨柳科
杨属白杨派山杨亚派，是中国特有树种，广泛分布于西
北、华北各省区，其耐寒、耐旱、耐瘠薄的特性，使之成
为黄土高原半干旱地区少有的能够上山栽植、生长稳
定、可以成材的乔木树种[8]，在水土保持、林业生产和
经营中起着举足轻重的作用[9]。随着世界气候的不断
变化及中国干旱盐碱地区的扩大，培育抗逆林木新品
种愈加必要，林木分子育种能加速林木育种进程，而对
林木抗逆分子机理的研究及关键基因的鉴定是开展林
木抗逆分子育种的基础和关键。目前，河北杨的研究
多集中于种源调查、组织快繁技术、嫁接扦插繁殖技
术、杂交、逆境下生理响应等方面，尚没有脱水素分子
机制等方面的研究报道[8-10]。笔者采用PCR扩增河北
杨 cDNA文库的方法，获取脱水素全长基因并进行序
列的生物信息学分析。通过半定量RT-PCR方法，分
析其在干旱、低温、高温、高盐以及ABA胁迫下的表达
模式与功能，为进一步研究河北杨抗旱分子机理及分
子育种打下了基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料及处理
试验材料为河北杨组培苗，取新鲜茎段放在含有
0.5 mg/LBA和0.1 mg/LNAA的MS生根培养基上，培
养温度为 25℃，16 h光照/8 h黑暗。取培养 50天组培
苗进行失水胁迫处理，参照Pelah等[10]的方法并略有改
动。将足够的组培苗从培养基中取出，置于 Parafilm
膜上使其分别自然失水至原来鲜重的 90%、80%、
70%、50%，后置于自封袋中3 h，对照则直接置于自封
袋中3 h；低温处理，将生根苗转移至4℃，分别处理0、
0.5、1、2、5、10、24 h；高温处理温度为 42℃，ABA处理
浓度为 100 µmol/L，高盐处理为 250 mmol/L NaCl，处
理时间同上，未处理苗子作为对照。每个处理为 3~5
株，处理后置液氮速冻并保存于-70℃。
1.2 总RNA、基因组DNA的提取及反转录
所有保存的材料取 300 mg使用美国 Promega公
司的 SV Total RNA Isolation System试剂盒进行总
RNA的提取，最后溶解到 50 µL的RNase-free水中并
测量计算浓度。使用Promega反转录试剂盒进行反转
录，取1 µg总RNA进行 cDNA第一链的合成。基因组
DNA的提取则使用天根公司基因组DNA提取试剂盒。
1.3 河北杨脱水素基因的克隆
以获得的河北杨2个脱水素相关的TDF片段为基
础，根据GenBank已发表的相关 dehydrin基因同源保
守序列，以及毛果杨基因组序列与杨树EST序列，合
成 了 河 北 杨 脱 水 素 基 因 的 引 物 ：
5-GCGTTTAGTGAGCTTCGTCTT-3（上游引物），
5-TTCCAGCTCTTCTAGTGACGA-3（下游引物）。
以 1 µL扩增后河北杨 cDNA文库（本实验室构建）溶
液作为模板，使用 20 µL反应体系进行 PCR扩增。
PCR反应条件为：先 94℃预变性 5 min，再在 94℃变性
20 s，57℃退火20 s，72℃延伸1 min的条件下运行35个
循环；最后 72℃延伸 5 min。用 1%的TAE琼脂糖凝胶
电泳检测 PCR结果，切下目的片段回收后，连接
KaTaRa pMD19-T载体并转化Top10感受态细胞，最后
筛选阳性克隆并测序。
1.4 河北杨脱水素基因的生物信息学分析
使用DNAMAN将测序所得的 cDNA序列去除载
体序列后，放入GenBank数据库中查询其同源序列，
并在NCBI数据库上进行Blast比较分析；使用Predict
Protein网络相关程序推断基因的氨基酸序列及其结
构，并用Megea 4.1软件绘制进化树。
1.5 不同胁迫条件下Phdhn1基因的差异表达分析
分别提取不同胁迫条件下河北杨植株的总RNA
·· 22
任媛媛等：河北杨脱水素基因(Phdhn1)的克隆与胁迫表达分析
并测量其浓度。使用与 1.3中相同的引物，Actin基因
作为内参，等量的RNA合成 cDNA做为模板，在线形
扩增范围内进行RT-PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测
PCR 结果。在计算 Phdhn1 的表达量时，使用
BandLeader软件读取条带的灰度值，将每种胁迫下
Phdhn1灰度值分别与相对应的Actin灰度值的比值作
为参考进行表达分析。
2 结果与分析
2.1 河北杨脱水素基因的克隆及序列分析
PCR克隆及测序得到的河北杨脱水素基因序列
全长为 856 bp（图 1），开放读码框长度为 681 bp，共编
码227个氨基酸，该氨基酸序列包括2个重复的富含赖
氨酸残基的K片段和由7个连续的丝氨酸残基组成的
S片段，属于脱水素家族中典型的 SKn型脱水素
（图2）。
2.2 河北杨脱水素基因的生物信息学分析
通过在NCBI数据库中比对，发现所得到的河北
杨脱水素基因序列与杨属植物中的 P. tremula基因
[EF639400.1]、P. alba dhn 基 因 [EF639405.1]、P.
Marker为核酸电泳marker，DL2000
图1 河北杨dhn基因PCR电泳图
S片段和K片段由横线标出
图2 Phdhn1核苷酸序列及氨基酸序列
euramericana dhn1基因[AJ300524.4]等脱水素基因都
具有 95%以上的序列一致性，故将其命名为 Phdhn1。
经BLAST比对和进化树分析，推断出河北杨脱水素基
因Phdhn1序列与欧洲山杨和银白杨的脱水素基因序
列有98%的同源性，Phdhn1与其他杨树有93%的同源
性、与柑橘脱水素有 50%以上的同源性。该基因蛋白
与其他植物脱水素蛋白的系统形成分析，进一步说明
了上述观点（图3）。
2.3 Phdhn1基因在不同胁迫条件下的差异表达分析
半定量RT-PCR分析表明，Phdhn1基因在不同胁
迫条件下呈差异表达，其中低温、干旱及ABA处理能
够诱导基因的表达。Phdhn1在干旱和ABA胁迫条件
下该基因的表达呈先上升后下降的趋势，分别在失水
率为30%的条件下和ABA处理2 h的条件下表达量最
高；在低温胁迫下表达呈先下降再上升后下降的趋势，
处理1 h条件下表达量最低，处理5 h条件下表达量达
Marker phdhn
2000 bp
1000 bp
700 bp
500 bp
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到高峰。而在高温与盐胁迫条件下，基因表达水平基
本保持不变（图4）。脱水素基因在不同的植物中表达
模式各不相同，例如胡杨脱水素能在400 mmol/LNaCl
溶液中有较高的表达量[11]，红海榄种子在收到盐胁迫
时，其脱水素表达量明显上调[12]，这可能跟它们的生长
环境和耐盐的生物学特性有关。
3 结论与讨论
笔者成功克隆了河北杨脱水素Phdhn1基因全长
856 bp，并进行了蛋白序列分析、同源性分析和在五种
逆境胁迫不同时间段下的半定量RT-PCR表达分析，
发现干旱、低温、ABA胁迫均能诱导 Phdhn1的表达，
表达模式基本相同，高温、高盐对其表达量变化影响不
大。
通过对Phdhn1蛋白序列的分析，发现其存在几个
脱水素蛋白成员中比较保守的区域，分别是位于中间
的由 7个连续的丝氨酸残基组成的 S片段，和在脱水
图3 Phdhn1蛋白与其他物种脱水素蛋白的系统形成分析
对照
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
0 0.5 1 2 5 10 24
处理时间/h
Phdh
n1/A
ctin
低温胁迫
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
0 0.5 1 2 5 10 24
处理时间/h
Phdh
n1/A
ctin
盐胁迫
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
0 0.5 1 2 5 10 24
处理时间/h
Phdh
n1/A
ctin
高温胁迫
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
0 0.5 1 2 5 10 24
处理时间/h
Phdh
n1/A
ctin
·· 24
任媛媛等：河北杨脱水素基因(Phdhn1)的克隆与胁迫表达分析
素 的 末 端 存 在 的 由 l5 个 氨 基 酸 残 基
（EKKGELDKIKEKLPG）组成的2个重复的K片段，其
中第 2个K片段的第 1个单核苷酸略有不同。因此
Phdhn1属于SKn型脱水素，这种类型的脱水素由于K
片段较多而属于酸性蛋白质，有研究表明它能够在植
物受到逆境胁迫时担负起生长所需基本蛋白的维护功
能，也能在植物开始脱水时提供早期保护[14]。
干旱是影响植物细胞生长发育的主要环境因素之
一，它能引起植物内源ABA的含量增加，从而产生失
水反应。而ABA又能调节保卫细胞的离子通道，控制气
孔关闭，减少水分流失，增加植物的逆境存活机率[15]。大
量的证据证明脱水素能够被ABA诱导[3]，但有研究表
明在干旱条件下，缺少ABA的植株与野生型植株中脱
水素的表达量变化不大[16]。由半定量分析结果可以看
出，内源和外源 ABA 均能诱导 Phdhn1 的表达。
Phdhn1在干旱胁迫和ABA胁迫中随时间的变化呈逐
渐上升再逐渐下降的趋势，表达模式基本相同，分别在
未经处理的植株中表达量较低，在失水率为 30%的条
件下和ABA处理2 h的条件下表达量最高。这可能是
由于K片段的双亲水性α-螺旋结构能够在细胞膜中的
水合大分子遭到破坏时，使脱水素与膜脂相结合，增强
细胞膜结构的稳定性，对由细胞失水而导致的膜脂双
分子层间距缩小，细胞膜融合等生物膜结构的不稳定
起到了修复作用[17]。另外，Phdhn1在低温胁迫中的半
定量RT-PCR结果表明，低温胁迫在早期轻微抑制了
Phdhn1的表达，表达模式与干旱和ABA胁迫略有不
同，这可能是处理方式导致的，后随着时间变化逐渐回
升，在5 h时达到最高峰。研究表明在4℃的低温胁迫
下，柑橘脱水素CuCOR19的大量表达能有效增强过氧
化氢酶和乳酸脱氢酶的活性[18]；而在0℃以下的环境条
件中，相对于去除脱水素的白桦水培植株，含有脱水素
的植株中的α-淀粉酶活性明显增强[19]。据推测这是由
于脱水素能在K片段形成的双亲水性α-螺旋作用下与
部分变性蛋白质的疏水位点相结合，起到了类似于分
子伴侣的作用，能有效防止蛋白质受到胁迫而变
性[2-3]。这说明脱水素不但能够阻止细胞膜因失水遭到
破坏，还能在低温条件下对一些蛋白质起到保护作用。
与胡杨、红海榄的脱水素研究结果不同 [12-13]，
Phdhn1没有受到盐胁迫的诱导发生表达差异，这可能
是与相对以上 2种植物，河北杨的生长环境较好及抗
盐性较弱有关，进一步证明了植物脱水素的表达量受
植物抗逆能力强弱的影响，来自不同植物的脱水素对
胁迫的反应也各不相同[4]。
河北杨脱水素全长基因的克隆及其在不同胁迫下
的表达变化研究，为进一步研究河北杨的抗逆分子机
制奠定了基础，同时为河北杨的抗逆分子水平研究指
出了新的方向，为今后的林木转基因抗逆分子育种提
供了新的基因材料。
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对照：Phdhn1在水中的表达量
图4 Phdhn1在不同胁迫及处理时间下的表达量变化
ABA胁迫
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
0 0.5 1 2 5 10 24
处理时间/h
Phdh
n1/A
ctin
干旱胁迫
0.0
0.2
0.4
0.60.8
1.0
1.2
1.4
1.6
0% 10% 20% 30% 50%
失水量百分比
Phdh
n1/A
ctin
0 10 20 30 50
/%
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