全 文 ：研究报告
Research Report
楸子脱水素基因的克隆及表达分析
高帆 * 梁东 * 夏惠 ** 唐月明 徐颖欢 侯帅
四川农业大学果蔬研究所,成都, 611130
*共同第一作者
**通讯作者, susanxia_2001@163.com
摘 要 脱水素(dehydrin)在植物抵御非生物逆境胁迫方面具有重要作用。本研究以楸子(Malus prunifolia)为
材料，采用改良 CTAB法提取 RNA，根据苹果的脱水素基因序列设计特异引物，利用反转录聚合酶链式反应
(RT-PCR)技术扩增，获得一条楸子脱水素 cDNA全长序列。该基因全长 874 bp，序列中含有一个 720 bp的开放
阅读框，编码 233个氨基酸，为 YK3型脱水素，命名为MpDHN8。氨基酸同源性分析表明，该基因编码的氨基
酸序列与苹果(Malus domestica)脱水素基因(AFG33216.1)的同源性高达 97%。荧光定量 PCR结果表明，在干
旱和盐胁迫下，MpDHN8的表达量显著提高，说明该基因作为正向调控因子参与调控楸子的逆境胁迫。
关键词 楸子,脱水素,基因克隆,基因表达
Analysis of Cloning and Expression of Dehydrin Gene in Malus prunifolia
Gao Fan * Liang Dong * Xia Hui ** Tang Yueming Xu Yinghuan Hou Shuai
Institute of Pomology and Olericulture, Sichuan Agricultural University, Chengdu, 611130
*These authors contributed equally to this work
** Corresponding author, susanxia_2001@163.com
DOI: 10.13417/j.gab.035.000436
Abstract Dehydrin plays an important role in against various abiotic stresses in plants. In this paper, a novel total
dehydrin cDNA was obtained from Malus prunifolia by using modified CTAB method to extract total RNA, and
specific primers designed according to dehydrin sequence of Malus prunifolia, which got amplification by using
RT-PCR. This gene that belonged to YK3 type dehydrin was named MpDHN8, with full length of 874 bp
containing a 233 bp long ORF and encoding 233 amino acids. Homology analysis of the deduced amino acids with
that of other plants indicated that the dehydrin of Malus prunifolia had a similarity of 97% with apple (Malus
domestica) dehydrin 6 (AFG33216.1). Real-time PCR showed that expression amount of MpDHN8 were signifi-
cantly promoted under drought and salt stress, which indicated that this gene plays a role in regulating Malus
prunifolia under stresses as a positive regulatory.
Keywords Malus prunifolia, Dehydrin, Gene cloning, Gene expression
基金项目：本研究由国家自然科学基金青年基金项目(31300316)资助
基因组学与应用生物学，2016年，第 35卷，第 2期，第 436-441页
Genomics and Applied Biology, 2016, Vol.35, No.2, 436-441
干旱、低温和盐碱等非生物胁迫是限制农业生
产的重要环境因子，不但影响植物的分布，并且还影
响植物的生长发育和产量。植物在面临这些环境因
子引起的水分胁迫时，体内会产生一系列生理生化
反应来适应新环境，包括降低水势，关闭气孔，提高
脱落酸含量，积累抗氧化物质，提高抗氧化活性，及
启动一系列复杂的基因网络活动(Farooq et al., 2012;
徐芳等, 2013)。其中，亲水性蛋白的积累是植物应对
细胞脱水的主要途径之一。试验证实，在非生物胁迫
下，脱水素的表达与积累有利于其抗逆性增强(Ra-
manjulu and Bartels, 2002; Allagulova et al., 2003)。
脱水素最早发现于 20世纪 80年代，是一类容
易受干旱诱导的水溶性的蛋白，具有较高热稳定性
和亲水性，其分子质量从 9 kD到 200 kD不等，属于
晚期胚胎发生丰富蛋白Ⅱ组蛋白(Close, 1996)。脱水
素序列高度保守，具有 3种非常保守的结构域，位于
N端的 Y片段(V/T) DEYGNP，丝氨酸(Ser)残基组成
S 片段和位于 C 端的由 15 个氨基酸残基组成
(EKKGIMDKIKEKLPG)的 K片段。Y片段与细菌、
植物的分子伴侣核苷酸结合位点具有同源性，具
有对细胞信号做出应答的作用(Baker et al., 1988;
Jensen et al., 1998)；S片段的磷酸化可以使信号肽引
导脱水素进入细胞核；K片段富含赖氨酸，能够形成
双亲性的 α-螺旋，是亲水性的重要结构基础，所有
的脱水素都含此片段(Allagulova et al., 2003)。在 K
片段之间还存在保守性较弱的 Ф片段(Close, 1997)。
植物遭受干旱胁迫时引起细胞组成成分的晶
体化，从而破坏了细胞的有序结构。而脱水素蛋白
家族具有特殊结构(Ingram and Bartels, 1996; Ker-
mode, 1997)，使其具有高度的亲水性，能够吸附住细
胞内的水分，保护细胞免受干旱伤害 (Ingram and
Bartels, 1996; Close, 1997)。目前，已从多种植物中克
隆并定位了脱水素或相关基因，如苹果中的MdDHN1、
MdDHN2、MdDHN3 (Liang et al., 2012)，沙冬青中的
AmDHN (Sun et al., 2013)和银杏中的 GbDHN (Deng
et al., 2006)等。
楸子(Malus prunifolia (Willd.) Borkh.)属蔷薇科
苹果属植物，又名海棠果。我国是世界苹果属植物的
起源演化中心，种质资源极为丰富。楸子在我国主要
分布于新疆、陕西、山西、辽宁和山东等省份。楸子因
其适应性强，抗寒抗旱，常作为苹果的优良砧木。本
研究从楸子中分离了一个脱水素基因，并分析了其
在盐胁迫下和干旱胁迫下的表达模式，为之后的功
能研究奠定了基础，对提高果树抗逆育种有重要意义。
1结果与分析
1.1楸子脱水素基因的克隆及序列分析
以楸子叶片为材料，采用改良 CTAB 法提取
RNA，根据苹果的脱水素基因序列设计特异引物，利
用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增，获得
一条目标条带，约 900 bp (图 1)。回收纯化该片段，连
接 pMD18-T载体后转化大肠杆菌，对 PCR鉴定的
阳性克隆进行测序。测序结果显示该楸子脱水素
cDNA长 874 bp，包含一个长 720 bp的开放阅读框，
该开放阅读框编码 233个氨基酸，含有一个 Y片段
和 3个 K片段，属于 YK3型脱水素(图 2)，将该基因
图 1楸子脱水素基因序列 PCR扩增
注: 1,2:扩增目标条带(以 cDNA为模板); 3,4:阴性对照(以 RNA
为模板)
Figure 1 PCR amplification of MpDHN8
Note: 1,2: Aimed band (cDNA as templates); 3,4: Negative control
(RNA as templates)
图 2楸子脱水素基因序列及推测的氨基酸序列
注:灰色为开放阅读框;启动子和终止子标有下划线;黄色为 Y-片段;桃红色为 K-片段
Figure 2 Full-length cDNA and its protein sequence of MpDHN8
Note: The grey is the ORF; Underline is promoter and terminator Yellow is Y segment; Pink is K segment
楸子脱水素基因的克隆及表达分析
Analysis of Cloning and Expression of Dehydrin Gene in Malus prunifolia 437
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
命名为MpDHN8。
利用 Protparam软件分析，该楸子脱水素蛋分子
质量为 25.11 kD，等电点 pI=7.06；带正电荷残基总
数为 24，带负电荷残基总数为 24，属于稳定类蛋白。
亲水性 /疏水性分析表明，多肽链中的第 10位和第
18位氨基酸疏水性最强；第 196位的氨基酸亲水性
最强。总平均亲水性(GRAVY)为-1.151 7，是亲水性
蛋白。SignaIP 4.0分析表明，该脱水素蛋白不含有信
号肽序列，为非分泌蛋白。二级结构进行分析表明，
无规则卷曲是楸子脱水素蛋白中最多的元件，散布
于整个蛋白质中。
1.2 MpDHN8蛋白序列的同源性分析
用 NCBI Blast 对楸子脱水素基因编码氨基酸
序列进行同源搜索，结果表明(图 3)，楸子脱水素基
因编码的氨基酸序列与其他植物脱水素基因编码的
氨基酸序列(苹果 AFG33216.1, 枇杷 ACK37880.1,
沙 梨 ACK37880.1, 梅 XP_008241734.1, 甜 樱 桃
AGW17295.1,榛子 ADN93460.1, 小麦 EMS50664.1,
山 羊 草 EMT30992.1, 大 麦 AAX10957.1, 葡 萄
NP_001268221.1,拟南芥 CAA45524.1)一致性较高，
其中与蔷薇科的苹果(Malus domestica)的一致性为
97%，枇杷(Eriobotrya japonica)的一致性为 93%，沙
梨(Pyrus pyrifolia)的一致性为 77%，梅(Prunus mume)
的一致性为 61%，甜樱桃(Prunus avium)的一致性为
58%，与木科榛子(Corylus heterophylla)的一致性为
53%，与十字花科拟南芥(Arabidopsis thaliana)的一致
性为 50%，与禾本科小麦(Triticum urartu)的一致性为
48%，与禾本科山羊草(Aegilops tauschii)的一致性为
48%，与禾本科大麦 (Hordeum vulgare subsp. spon-
taneum )的一致性为 48%，与葡萄科葡萄 (Vitis
vinifera)的一致性为 48%。
利用 MEGA 5.10 软件构建出楸子脱水素基因
与其他植物的系统进化树(图 4)。从进化树图可看
出，楸子首先与苹果聚为一类，再与其他植物聚类，
说明楸子与苹果的进化关系较为接近，可能由同一
祖先进化而来，可推测其生理特性与生态特征在进
化过程中表现出相似的特性。
1.3 MpDHN8的逆境表达分析
使用 Real-Time PCR 研究不同胁迫下基因表
达模式，在盐胁迫下 MpDHN8的表达量逐渐上升，
盐胁迫 12 h达到峰值，是对照的 40倍。之后在盐
胁迫 24 h MpDHN8 的表达量又下降到盐胁迫 6 h
的水平(图 5)。同样地，在干旱胁迫下 MpDHN8 的
表达量逐渐上升，在第 6 天表达量大幅上升，是对
照的 250倍左右，第 8天表达量上升到对照的 350
倍(图 6)。
2讨论
楸子具有较强的抗寒、抗旱、耐盐碱的特性，
适应力极强，是苹果的野生近缘种，常用作苹果砧
木，具有与苹果相似的基因信息，因此该物种对苹
果的基因改良具有重要的应用价值。同源克隆是
基因克隆经典技术之一，所分离出的同源基因往
往具有很高的氨基酸序列的相似性。并且利用基
因序列的相似性和保守性来克隆物种中功能基因
的成功范例较多(洪林等, 2013)。脱水素为 LEAⅡ
家族成员，其基因序列具有高度的保守性(Baker et
al., 1988; Dure et al., 1989)，且保守片段在序列内
部具有若干个拷贝，基于这些特性，本试验采用同
源克隆的方法，以楸子为材料，成功扩增得到楸子
脱水素基因的 cDNA 全长序列，具有快速、经济、
简便的优势。
利用 NCBI Blastx 对测序结果进行序列比对显
示，该基因编码的氨基酸序列与苹果、枇杷的相似
性最高，分别为 97%和 93%，此结果表明脱水素基
因在楸子、苹果以及枇杷中有很高的保守性。通过
对楸子脱水素基因编码的蛋白质进行生物信息学
分析，获得了该基因编码的蛋白质的理化性质，该
蛋白是一个亲水性蛋白，无信号肽，属于非分泌型
蛋白，其主要的二级元件是无规则卷曲和 α-螺旋。
本试验虽然成功克隆得到了楸子脱水素基因，
但是还有许多需要深入研究的地方。植物中脱水
素往往都是以基因家族的形式存在的，如拟南芥
(Hundertmark and Hincha, 2008)、水稻(Wang et al . ,
2007)、大麦(Tommasini et al., 2008)和苹果(Liang et
al., 2012)中的家族成员分别为 10个、8个、13个和
9个，据此推测，楸子中的脱水素应该也是以家族
形式存在。根据 Y、S、K 保守区域组成情况，脱水
素又分为 5 种类型：YnSK2、Kn、SKn、KnS 和 Y2Kn
(Close, 1996)，5 种类型的酸碱性和诱导因素各不
相同，那么，楸子的脱水素基因家族是否包含这 5
种类型，它们有什么功能差异，我们不得而知。今
后，采用同源克隆的方法，获得更多的楸子脱水素
基因家族成员，通过原核表达和转基因等方法对
脱水素的抗逆性做进一步研究，尽早运用在实际
生产中。
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楸子脱水素基因的克隆及表达分析
Analysis of Cloning and Expression of Dehydrin Gene in Malus prunifolia
图 3楸子脱水素基因编码的氨基酸序列与其他相关序列的多重对比
Figure 3 Alignment of multiple sequences of MpDHN8 protein amino acid sequence with that of other plants
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基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
3材料与方法
3.1植物材料
植物材料处理：选取长势一致的楸子当年生实
生苗，以盆栽方式在温室中培养 3个月后进行干旱
和盐胁迫处理。干旱胁迫处理：盆栽苗胁迫处理前先
浇水饱和，其后停止供水，待花盆土壤田间持水量达
到 75%~80%时计为 0 d，分别在 0 d、2 d、4 d、6 d和
8 d取植株中部成熟叶片，叶片采集后液氮速冻并存
于-80℃备用。盐胁迫处理：盆栽苗胁迫处理前先浇
水饱和，其后停止供水，待花盆土壤田间持水量达到
75%~80%是浇 200 mmol/L NaCl 至土壤含水量饱
和，然后在 0 h、3 h、6 h、12 h和 24 h取植株中部成熟
叶片，叶片采集后液氮速冻并存于-80℃备用。
3.2基因克隆及序列分析
以楸子叶片为材料，采用改良 CTAB 法提取
RNA，根据苹果的脱水素基因序列设计特异引物
(表1)，进行 RT-PCR扩增。扩增产物经 1%琼脂糖电
泳检测后，回收纯化目的片段，并连接到 pMD18-T
载体上，转化大肠杆菌 DH5α，挑取阳性克隆，PCR
检测后测序。
用 Protparam 软件分析蛋白理化性质，用 Sig-
naIP 4.0软件分析蛋白信号肽序列，利用 Anthepro分
析蛋白二级结构，用 MEME分析蛋白保守结构域。
序列比对用 Bioedit 5，随后用MEGA5软件应用邻接
法构建 MpDHN8与其他物种脱水素基因的系统进
化树。
3.3表达分析
使用实时荧光定量 PCR 法研究干旱和盐胁迫
下 MpDHN8 基因的表达模式，根据 cDNA 测序结
果，设计定量表达引物(表 1)，以 Actin和 EF为内参
基因。提取采集叶片的总 RNA，利用 PrimeScript
RTReagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)
试剂盒(TaKaRa)进行反转录。将反转录产物稀释至
同一浓度，然后按照试剂盒 SYBRPremix Ex TaqTM
(Tli RNaseH Plus)试剂盒(TaKaRa)进行 PCR 扩增。
PCR扩增采用 BIO-RAD公司 iQ5型实时定量 PCR
仪进行，利用 iO5TM Real-Time PCR Detection Sys-
图 4不同植物脱水素基因编码的氨基酸序列的系统进化
Figure 4 Phyletic evolution of amino acid sequence encoded by
dehydration gene from different plants
图 5盐胁迫下脱水素基因的表达
Figure 5 Expression patterns of MpDHN8 under salt stress
图 6干旱胁迫下脱水素基因的表达
Figure 6 Expression patterns of MpDHN8 under drought stress 引物名称
Primer
MpDHN8S
MpDHN8A
MpDHN8S-RT
MpDHN8A-RT
EF1 (F)
EF2 (R)
Actin1 (F)
Actin2 (R)
引物序列(5-3)
Primer sequence (5-3)
AAAATGCCAGGTGTCCTCAG
GAAGTGCTCGCTGCTCACTC
AAAGCCCCAAGACACAGATG
AGCCTCCGGTAGTACCCTGT
ATTCAAGTATGCCTGGGTGC
CAGTCAGCCTGTGATGTTCC
CCAAAGGCTAATCGGGAGAA
ACCACTGGCGTAGAGGGAAAG
表 1基因克隆及表达引物
Table 1 Primers for gene cloning and expression
440
tem进行基因表达数据分析。数据分析采用 2-ΔΔct法，
重复 3次。
作者贡献
高帆和梁东是本研究的实验设计和实验研究的
执行人，完成数据分析，论文初稿的写作；唐月明、徐
颖欢和侯帅参与实验研究、实验结果分析；夏惠是项
目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论
文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家自然科学基金青年基金项目
(31300316)资助。
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