全 文 ：微 生 物 学 报 24 ( 2): 1 3斗一 8 1 3, 1 9 8 4
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用 D N A 杂交技术测定烟草花叶病毒
与长叶车前花叶病毒的关系
康良仪 田颖川 田 波
(中国科学院微生物研究所 ,北京 )
从油菜上分离的属于烟草花叶病毒组的油菜花叶病毒 15 ( Y M v : , ) 和从大白菜上分离到的
白菜花叶病毒 ( cC M v ) 的外壳蛋白中 , 都含有组氨酸和甲硫氨酸 , 类似于长叶车前花叶病毒
( R M v )
。 用 Y M v : ,一 、 R M V 一和番茄花叶病毒 ( T o M v ) 突变体 N : ; 一NR A 的 e D N A 与 Y M v 一R N A 、
R M v 一 R N A 和 cC M v 一 R N A 进行了同源和异源的分子杂交试验 。 从分子杂交的 oR t 曲线和杂交
产物的 T m 值看 , Y M v , , 和 cC M v 都不同于 R M v , 其饱和杂交率表明 , cC M v 与 Y M v . , 有一定
核若酸序列的同源性 , 两者都与 R M v 没有核若酸序列同源性 , 说明它们属于烟花叶病毒组的
不同亚组 。
关镶词 : 烟草花叶病毒组 , c D N A 分子杂交
用互补 D N A ( c D N A ) 分子杂交技 术
测定病毒 D N A 核昔酸序列的 同 源性 , 是
进行病毒亚组分类的一种新方法 。 由于它
可对病毒的整个基因组作比较 , 比仅由基
因组 10 多的核昔酸编码的外壳 蛋 白氨 基
酸成分的分析更为可靠。 我们已用这种技
术研究了中国分离的几个烟草花叶病毒组
病毒 RN A 序列的同源性 l1L , 结果表明 , 烟
草花叶病毒普通株 ( T M V 。 ) 、 番茄花 叶病
毒 ( T o M V ) 及其突变体 ( T o M V 一 N l ; ) 、 杨
树病毒 ( P v ) 、 地黄退化病毒 (D D v ) 可归
于 T M v 一 U : 株所代表的亚组 。 油菜花叶病
毒 15 号 ( T M V 一 Y M V I , ) 与 T M V 一 U I 株无
关 。 根据 Y M VI , 外壳蛋白氨基酸组成中含
有组氨酸和甲硫氨酸 〔2 , , 它与长叶车 前花
叶病毒 ( RM v ) 相近 。 最近 , 根据氨基酸组
成的电子计算机分析 ,把 Y M VI , 与 RM v 分
在一个亚组 〔3j 。
本文进一步测定了中国十字花科植物
上分离的烟草花叶病毒组的病毒与长叶车
前花叶病毒 ( RM V ) 的关系 。
材 料 与方 法
(一 ) 病毒和核酸
Y M v
. , 系由十字花科植物上分离的烟草花叶
病毒组的油菜花叶病毒 巧 号 ; cC 劫 v 系上海郊区
大白菜上分离的一株病毒 , 由中国科学院上海生
物化学研究所朱本明提供 ; 长叶 车 前花叶 病毒
( R M v ) 系由澳大利亚国立大学 .A iG h hs 博士赠
送 ; 还有 T O M v 病毒 N : ; 突变株系。
提纯的病毒用酚法抽提核酸 , 加 2 倍体积的
95 % 乙醇沉淀 , 1 2。。 o x g 离心 10 分钟 ,沉淀物用
重蒸乙醚洗 3 次 , 1 2。。 o x g 离心 10 分钟后 , 沉淀
物溶于无菌蒸馏水 , 使核酸浓度达 1 . o m g / m l , 保
存于 一 10 ℃ 备用 。
(二 ) e D N A 的制备
Y M v
: 厂R N A 和 T o M v 一N . ;一 R N A 的 e D N A分别
按以前所叙述的方法制备 〔 ” 。 R M v艰NA 的 。 D N A
除反应底物中的标记底物用 , ’ 一 3 H刁 A T P ( 26 . S iC /
n , m o l , l m C i加 l , 加 5 0料 l ) (上海原子核研究所 )
本文于 19 82 年 7 月 19 日收到。
感谢澳大利亚国立大学 A . G i b b, 博士赠送长叶车
前花叶病毒和上海生物化学研究所朱本明提 供上 海郊
区大白菜花叶病毒分离物 。
DOI : 10. 13343 /j . cnki . wsxb. 1984. 02. 008
2期 康良仪等 :用 D NA杂交技术测定烟草花叶病毒与长叶车前花叶病毒的关系
外 , 其余均与$IJ 备 Y M v : , 一 RN A 和 T o M v 一 N , ;一 RN A
的 c D N A 方法相同 。 实验中所用的禽类白血病病
毒反转录酶由美国马里兰州国家癌 症研 究所 .J
eB
o r d 博士赠送。
(三 ) 互补 D N A 与 R N A 的杂交
c D N A 与 R N A 的饱和杂交 率 、 c D N A 与 R N A
杂交的 oR t 曲线 和 。 D N A . R N人 杂 交物 T m 值的
测定按以前所叙述的方法进行「” 。 实验中所用的
单链特异的核酸酶 s1 由本实验室制备川 。
实 验 结 果
(一 ) c D N A 与同 源和异源 的 R N A
分子杂交
图 i 是 T o M V 一N , ; 一 , Y M V 巧 一和 R M V -
R N A 的 ’ H 一 c D N A 与 它 们 同源 和 异源 的
RN A 杂交反应动力学曲线 。 由图可见 , 三
种 ’ H 一 c D N A 与它们 同源 的 RN A 杂交动
力学所得到的 Ro t l / 2 值 , N , ; 一 , H 一 e D N A ·
N
, 4一 R N A 为 5 . 6 2 X 10 一 , 、 Y M V , 5一 ’ H 一 e D N A ;
YM V
, ,一 R N A 为 5 . 6 2 x 10 一 , ; RM v 一 3H -
e D N A
·
R M V
一 RN A 为 3 . 9 8 x 1 0一 、 11、 )1. 5 .
L 一 ` 。 在所用的条件下 , 这些 c D N A 与它们
同源的 RN A 饱和杂交率分别为乃 多 、 89 %
和 65 多 以上 。
三种 。 D N A 与异源 RN A 的杂交动力
学表明 , 只有 Y M V 、 、 一 , H 一 e D N A 与上 海郊
区大 白菜病 毒 一 R N A 杂 交 所 得 的 R ot l / 2
值 为 1 x lo 一 , , 杂交率为 65 务 以上 ,其余
的 3H 一 c D N A 与异源 RN A 杂交均没有明显
的杂交率 。 根据其 R ot l / 2 值可估计出上
海郊区大 白菜 病 毒一 RN A 与 Y M v l s 一 R N A
之间具有约 5 1 . 1关 核昔酸序列同源性 , 而
N
, ` 一 RN A 和 RM V 一 RN A 与 YM V 1 5一 R N A
l司亩原
R N A 古之置八é一了
切`币ù`Uód
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u。ùù旧zǐPùó喂工ǎ欲ó价铭张
一 3 一 2 一 l
10 9 R o t
图 1 杂交反应动力学曲线
F i g
.
1 K in e t i c s o f h y b r i` li z
a t i o n b e tw e e n e D N A , a n d R N A s
^ , B a n d C 分别为 3 H 一 N , ; 一 e D N A , ’ H 一 Y M V : , 一 c l ) N A 和 3H 一R M v 一 e D N A 与其同源的和异源的病毒
R N A 的杂交反应
1
.
N
i ; 一
R N A ; 2
.
Y M v
, , 一
R N A : 3
.
R M v
一
R N A ; 峪. C e M v 一 R N A
A
,
B a n d C r e p r e s e n t t h e h yb
r i
.
l i多a t i o n o f J H一 N : ; 一 c D N A 3 H 一 Y MV : , 一 e D N A a n d ’ H 一 R M v 一 c l ) N A
w i t h Lh
e
i「 h o m o l《 、 g o u s a n d h e t e r o g e n e o u s v ir u a l R N A , , r e s p e c t i v e ly
之间没有序列同源性 , 彼此无相关性 。
(二 ) 饱和杂交率
在使伙 一 c D N A 与它们同源和 异源 的
RN A 杂交达最大 R ot 值的条件下 , 测定了
三种 ’ H 一 c D N A 与它们同源和异源 R N A 的
饱和杂交率 。 若以每种 ’ H 一 c D N A 与其同
源 R N A 杂交率为 1 0 沁 计 ,则只有上海郊
区 大 白菜 病 毒一 RN A 与 Y M v , , 一 ’ H 一 c D N A
微 生 物 学 报 2斗 卷
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温度 Te m Pe ra tu re (℃ )
图 2不同杂交物的热变性曲线
Fi g
.
2 T h
e r n、 a l de na tu ra ti o no fi d f fe re n t h沙 ri d .
A , B , e 分别表示 3 H 一 YM v : , 一 e n N A , ’ H 一 N : ; 一 e D N A , ’ H 一 RM v 一 e D N A 与其同源和异源
病毒 R N A 杂交反应物的热 变性曲线
1
.
Y M V :
s一
R N A 2
.
N
:一 R N A 3 . RM V 一 R N A 峪. C o M V 一 R N A
箭头指示杂交物的 T 川 值
A , H , C i n d i e a t e t h e t h
e r m a l d
e n a t u r a t i o n e u r v e s o f t h e h y b r i d 3 be t w e e n
,
H
一 Y M v : , 一 e D N A ,
3
H
一 N : ; 一 e D N A a n d 3 H 一 RM V 一 e D N A a n d R N A s f r o m h o l n o l o g o u s a n d h e r e r o g e n e o u s v i r u , e 吕
A r r o w s i n d i e a t
e t h e T m v
a
l u
e , o f t h e h y b r id ,
的饱和杂交率达 67 多 , 其 余的 均 在 13 外
以下 (表 l ) 。 进一步说明上海郊区大白菜
病毒与 YM v : , 亲缘关系较近 , 而与其余两
个属于不同亚组的病毒 T o M v 一 Nl ; 和 RM v
农 1 饱和杂交率
T a b l
e
1 s a t u r a t e d H沙 r i d i z a t i o o Ra t e (% )
3
H
一 c l〕 N A
R N A
Y M V 15
Y M V 1 5
C C卜I V
1 0 0
6 7
N I月
RM V
l
。 斗
1 0 0
12
。
9
无亲缘关系 。
(三 ) 杂交产物的 T m 值
由图 2 计算出 Y M V , s 一 , H 一 c D N A , N : ; -
,
H
一 e D N A 和 R M v 一 , H 一 c D N A 与它们 同 源
RN A 杂交物的 T m 值分别为 79 ℃ , 84 ℃ 和
8 2℃ 。 在三种 ’ H 一 c D N A 与异源 R N A 的杂
交中 , 只有上海郊区大白菜病 毒 一 RN A 与
Y M V
1 5一 ,
H
一 c D N A 的杂交物 T m 值为 7 6℃ ,
很接近 YM V 15一 3H 一 e D N A 与其同源 R N A 杂
交物的 T m 值 , 表明 cC M V ~ RN A 与 Y M v , , -
3
H
一 c D N A 杂交百分率不是 ’由于 错误 配对
所致 , 而是确实存在着核普酸序列的同源
性 。
期 康良仪等 : 用 D N A杂交技术测定烟草花叶病毒与长叶车前花叶病毒的关系
讨 论
根据本文报道和以前 【 1用 CD N A分子
杂交技术测定的烟草花叶 病 毒组 RN A序
列同源性的分析结果 , 可将我国分离的烟
草花叶病毒组的一些成员划分为两个不同
的亚组 , T M V 。 , T o M v 及其突变体 N l . , P V ,
D D v 属于以 T M v 一 U : 株 为 代表 的 亚 组 ,
根据杂交物的 T m 值又 可 划 分 为 T M vc 、
T
o
M V N
: 、 以及 p V 和 D D V 两 个 病毒 群 ,
而 Y M VI , , C c M V 为另一亚组 。
从本文所报道的结果看 , cC M v 一 RN A
与 Y M V1 5一 3H 一 c D N A 的异源杂交和 YM VI , -
3
H
一 c D N A 与 Y M V , ,一 R N A 同源杂交比较 ,
它们具有相近的 R o t生 值 (图 I B ) , 较高
2
的饱和杂交率 , 以及杂交产物具有相近的
丁 m 值 (图 Z B ) 。 表明两种病毒 R N A 序列
有同源性 。 因此 , cC M v 与 Y M v l , 应属同
一个亚组 。 这与它们的外壳蛋白均含有组
氨酸和甲硫氨酸 `习是一致的 。 而上海郊区
大白菜病毒 R N A 与属于 T M v 一 U , 株 为代
表的亚组中的 N l ; 一 R N A 的 ’ H 一 c D N A 则 不
能杂交 , 表明 RN A 之间没有序列同源性 。
iG b
、 等 〔习 根据中国分离的儿个烟草
花叶病毒 组的病毒蛋 白氨基酸组成的电子
计算机分析 , 将 YM v l , 和 RM v 归为一 个
亚组 , 但本文结果证明 , 无论是 RM V 一 ` H -
c D N A 与 Y M V 1 5一 R N A , 还是 Y M V 15一 办H -
cD N A 和 RM v 一 RN A 都没有明 显的 杂交 ,
表明 RM v 一 R N A 和 Y M v , 5一 R N 八 没有序 列
的 同 源 性 。 RM V 一` H 一 c D N A 与 N 14 一 l丈N A
和 N l ; 一 3H 一 c D N A 与 RM v 一 R N A 杂 交 结 果
也表明没有序列的同源性 。 因此 , YM v , , ,
R M v 和 N l ; 应属于不同的亚组 , 说明仅根
据氨基酸组成来分类的局限性 , 而用 。 D N A
分子杂交技术分析病 毒 R N A 基 因组 序 列
的同源性是 目前将病毒进行组以下分类较
为可靠的方法 。
参 考 文 献
p al u k ia t沁 , P . 等 : 生物化学与生物物理学报 ,
1 4 ( 3 )
: 2 17一 2 2 3 , 19 8 2。
C h a n g Y u , h a n g e t a l
.
, S c i亡路 t i 一` S t n i c a , 8 :
1 42 1一 l月3 2 , 19 6 4 .
G ib b s
, A
.
e t a l
.
: I 刀一e r扩 i r o l o g夕 , 18 : 16 0一 16 3 ,
19 8 2
.
杨希才 、 康良仪: 微生物学通报 , 10 ( 2 ): 7 一
歹9 , 1 9 8 3。
朱本明等: 生物化学与生物物理学报 , 1:3 2 1 7 ,
1 9 8 1
0
1J .,J11
2
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、.1,
34
r.. rL
[ 5 ]
1 3 8微 生 物 学 报2 斗 卷
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,
A M O V I R U S E S IS O L A T E D F R O M C R U C IF E R A E P L A N T i N
C H IN A A N D R I B G R A S S M O S A IC V IR U S B Y M O L E C U L A R
H Y B R I D IZ A T I O N T E C H N IQ U E U S IN G C O M P L E M E N T A R Y D N A
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s a i e v iur s ( R M V )
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I n o r d e r t o d e t e r m i n e t h e
r e l a t io n s h iP a m o n g t h e s e v iur s e s
, e x Pe r i
-
m e n t s o f h
o m o l o g o u s a n d h
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一 a n
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14一 RN A a n d YM V I s
-
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,
RM V
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一
RN A w e r e
c a r r ie d o u t
.
F r o m R o t cu vr e s o f m o l e cu l a r h yb r id i
-
z a t i o n a n d Tm
v a l u e s o f h y b r id s
,
i t e a n b
e
s e e n t h a t b o t h Y M V
一5 a n d C e M V a r e d i f f e
-
r e n t f r o m RM V
.
T h e p e cr e n t a g e o f t h e i r
s a t u r a t i o n h y b r id i z a ti o n s h o w e d t h a t t h e n u
-
e le o t id
e s e q u e n e e h o m o l o g y b e t w e e n C cM V
a n d Y M V
, 5 15 p r e s e n t
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u t t h e r e 15 n o h o m 。
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I t 15 e o n e l u d e d t h a t a e e o r d in g t o t h e r e s u l t s
o f m o le cul
a r h y b r i山 z a t i o n Y MV I , a n d C e -
M V ar e id ff e r e n t f r o m R M V
, a n d s h o u ld
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t s u b g or
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