全 文 ：中国生物工程杂志 China Biotechnology, 2009, 29( 1): 27~ 33
新疆盐生植物车前 PmNHX1基因的
克隆及生物信息学分析*
张雨良 1 张智俊 2 杨峰山 3 MaheshKu lye1 袁 辉 1 罗淑萍 1**
( 1新疆农业大学农学院 乌鲁木齐 830052 2浙江林学院林业与生物技术学院 杭州 311300)
( 3黑龙江大学生命科学学院 哈尔滨 150080 )
摘要 盐分对植物的伤害主要是 Na+引起的,而 Na+ /H +逆向运输蛋白催化 Na+ /H +逆向跨膜运
输,从而使质膜上 Na+运出细胞和液泡膜中的 Na+区隔化。这是植物尤其是盐生植物抵御盐胁迫
的主要方式之一。根据不同植物编码液泡膜逆向运输蛋白基因的保守序列,设计简并引物, 采用
RT - PCR和 RACE技术,首次从新疆盐生植物车前 (P lantagoma ritima )中克隆到 Na+ /H +逆向运
输蛋白基因的 cDNA全长 2464 bp,命名为 PmNHX1(GenBank登录号: EU233808), 该基因编码区
长为 1 662bp,编码 553个氨基酸,理论分子量为 61. 16kDa,等电点为 7. 22。数据分析结果显示,
该蛋白质主要定位于液泡膜上,由 12个序列保守的跨膜结构域组成, 其中 TM3跨膜结构域上存
在 / LFFIYLLPPI0 -氨氯吡嗪咪结合域,并且该位点与 Na+有竞争作用。 PmNHX1逆向运输蛋白
与其他植物逆向运输蛋白的氨基酸同源性为 64% ~ 80%。通过生物信息学方法对其理化性质和
功能分析进行预测,这为进一步研究转耐盐基因 PmNHX1及其功能鉴定奠定了基础。
关键词 新疆车前 逆向运输蛋白 PmNHX1基因 基因克隆 生物信息学
中图分类号 Q812
收稿日期: 2008-10-20 修回日期: 2008-11-10
* 新疆自治区教育厅重点项目 ( XJEDU2004G 07 )、新疆自治区科
技攻关项目 ( 200415114-2) 资助项目
** 通讯作者,电子信箱: luoshuping2008@ 163. com
高盐环境严重影响植物的生长发育,是造成农作
物减产的主要原因之一。土壤盐渍化已成为一个全球
性的问题,全世界有约 57亿亩土地存在着不同程度的
盐渍化,约占可耕地面积的 10% [ 1]。其中我国的盐渍
地约有 23. 3万平方公里, 而新疆是中国荒漠化大区,
也是中国最大的盐土区,盐渍面积达 1 100万公顷, 约
占全国盐渍土面积的三分之一 [2 ]。这严重阻碍了新疆
现代农业经济的发展。自 1985年, 在甜菜根部贮藏组
织的液泡膜上发现 Na+ /H +逆向转运活性以来 [3 ], 人
们相继发现在兼性 CAM植物冰叶日中花 [4 ]、甜菜 [5]、
甜土植物大麦 [6 ]和海滨车前 [7]等均存在着 Na+ /H +逆
向转运蛋白,其运输活性的强弱直接关系到植物耐盐
能力的大小 [8 ]。
B lumwald等 [9 ]在首次克隆得到了拟南芥液泡膜上
的 Na+ /H +逆向运输蛋白基因后, 通过转基因技术科
学家们成功获得了耐盐的转基因拟南芥、西红柿和油
菜。另外, Fukuda等 [ 10 ]也首次从单子叶植物水稻中克
隆得到了水稻液泡膜 Na+ /H +逆向运输蛋白基因,该基
因超表达的转基因水稻耐盐性明显增强。到目前为
止,逆向运输蛋白基因 NHX1基因已从拟南芥、水稻、大
豆、玉米、苜蓿、芦苇和盐角草等植物中得到了克隆和
鉴定 [ 11 ]。不同物种间的逆向运输蛋白虽具有较高的同
源性却具有一定的活性差异, 新疆车前是新疆广泛存
在的特色盐生植物,与其他植物相比具有更高耐盐性,
有研究表明,在 400mmol /LNaC l高盐环境中,新疆车前
仍然可以正常的生长。因此,从新疆盐生植物车前中
寻找优质耐盐或抗盐相关基因,研究其抗盐机理,可为
改造农作物的耐盐能力打下坚实基础 [12 ]。本文依据
NHX1基因家族的蛋白保守序列设计简并引物,并进一
步通过 RACE法克隆到新疆车前 PmNHX1全长基因,
从而为寻找新的 NHX1家族成员提供了新途径。
DOI：10.13523/j.cb.20090106
中国生物工程杂志 China Biotechnology Vo.l 29 No. 1 2009
1 材料与方法
1. 1 材料的采集与培养
实验材料新疆盐生植物车前 ( P lan tago maritima )
采自新疆农业大学附近雅玛里克山,在温室中用珍珠
岩盆栽培养, H oagland营养液浇灌,营养繁殖, 待植物
成活后选择健康植株进行实验。
1. 2 总 RNA提取
采用 Invitrogen 公司的 Trizo l试剂提取经 400
mmol /L NaCl处理 24 h以上新疆车前幼嫩叶片的
RNA,直接于 - 80e 保存或直接转录得到相应的
cDNA, 放置于 - 20e 冰箱备用。
1. 3 PmNHX1基因全长序列的获得
依据不同物种 NHX1基因家族的蛋白保守序列设计
简并引物 ( sense P1: 5c-ATGCTACNTCAGTGGTKCTTTTC
AA-3c, an tisense P2: 5c-CCTCTCATNAGACCAGCCCACC
A-3c),扩增新疆车前 PmNHX1基因的中间片段 1,根据
测序结果,设计第二对简并引物 ( sense P3: 5c-GGARAAY
MGATGGATGAAYG-3c, antisense P4: 5c-TGTAGGAAAGG
TAAGCCATAAGC-3c),扩增获得中间片段 2, 结合 5c-
RACE和 3c-RACE技术获得该基因的 5端序列和 3端序
列,经序列拼接获得新疆盐生植物车前逆向运输蛋白基
因 PmNHX1全长序列。
5cRACE: 根据测序已得到的新疆车前 PmNHX1基
因中间片段 1、2序列,设计 5cRACE特异性引物 (GSP1:
5c-GATAATCTCCAATGGCAAG-3c; GSP2: 5c-GAAATTGC
GAAAGAACTG-3c),进行 5cRACE扩增。参考 TaKaRa公
司试剂盒说明对新疆车前叶片总 RNA的去磷酸化、/去
帽子 0反应、5cRACE Adaptor连接反应, 获得 Ligated
RNA。反转录:取 Ligated RNA 6 L ,l Random 9 mers( 50
Lmol /L) 0. 5L ,l 5 @M-MLV Buffer2L ,l dNTPs( 10mmol /
L each) 1L ,l RNase Inh ib itor ( 40U /L l) 0. 25L ,l Reverse
TranscriptaseM-MLV( Rnase H- ) ( 200U /L l) 0. 25L ,l 30e
10m in, 42e 60m in, 70e 15m in。5cOuter PCR反应: 取
RT产物 4L ,l 1 @cDNA Dilu tion BufferÒ 6L ,l 10 @LA PCR
BufferÒ 4L ,l MgC l2 ( 25mmol /L) 3L ,l TaKaRa LA Taq( 5U /
L l) 0. 25L ,l 5cRACE特异性引物 GSP1( 10Lmol /L) 2L ,l 5c
RACE outer p rimer( 10Lmol /L) 2L ,l ddH2O 28. 75 L ,l
94e 3m in, 94e 30s, 55e 30s, 72e 1m in, 25个循环;
72e 延伸 10m in。 Inner PCR反应:取 Outer PCR反应液
1L ,l 10 @LAPCR BufferÒ 5L ,lMgCl2 ( 25mmol /L) 5L ,l dNT
PMix tu re( 2. 5mmol /L each) 8L ,l TaKaRa LA Taq( 5U /L l)
0. 5L ,l 5cRACE 特异性引物 GSP2 ( 10Lmol /L) 2L ,l 5c
RACE inner primer( 10Lmol /L) 2L ,l ddH 2O 26. 5L ,l PCR
反应条件同前一步 PCR。 5cRACE PCR产物经回收、克
隆、鉴定,挑取阳性克隆送 Invitrogen公司进行测序。
3cRACE: 根据测序已得到的 PmNHX1基因中间片
段 1、2序列,设计 3cRACE特异性引物 (GSP1: 5c-CAAAA
ACATCAGTTGCTGTTAGTG-3c; GSP2: 5c-TCCTCTGTCATT
TCTGTCTAACTTG -3c),进行 3cRACE扩增。反转录:取
车前总 RNA 3L ,l 3cRACE Adaptor( 5Lmol /L) 1L ,l 5 @M-
MLV Buffer 2L ,l dNT PMixtu re ( 10 mmol /L each) 1L ,l
RNase Inh ib itotor ( 40U /L l) 0. 25L ,l Reverse Transcriptase
M-MLV ( RNase H- ) ( 200U /L l ) 0. 25L ,l RNase Free
ddH2O 2. 5L ,l反应条件为 42e 温浴 60m in后 70e 灭活
15m in, - 20e保存备用。 3cOuter PCR反应:取 RT产物
3L ,l 1 @cDNA Dilution BufferÒ 7L ,l 3cRACE特异性引物
GSP1( 10Lmol /L) 2L ,l 3cRACE outer p rimer( 10Lmol /L)
2L ,l 10x LA PCR BufferÒ 4L ,l MgC l2 ( 25mmol /L) 3L ,l
TaKaRa LA Taq( 5U /L l) 0. 25L ,l ddH 2O 28. 75L ,l反应条
件为 94e 3m in, 94e 30 s, 55e 30 s, 72e 1 m in, 30个循
环; 72e延伸 10m in。3cInner PCR反应:取上步 PCR产物
1L ,l dNT PMix tu re( 2. 5mmol /L each) 8L ,l 10 @LA PCR
BufferÒ 5L ,lMgC l2 ( 25mmol /L) 5L ,l 3cRACE特异性引物
GSP2( 10Lmol /L) 2L ,l 3cRACE inner p rimer( 10Lmol /L)
2L ,l TaKaRa LA Taq( 5U /L l) 0. 5L ,l ddH 2O 26. 5L ,l反应
条件同前一步 PCR。套式 PCR扩增产物经回收、克隆、
鉴定,挑取阳性克隆送 Invitrogen公司进行测序。
1. 4 PmNHX1基因的生物信息学分析
通过 RT-PCR及 RACE方法获得一个新的功能基因
PmNHX1,利用生物信息学数据库和因特网上的软件对
PmNHX1基因及其蛋白加以分析。从而为进一步研究该
基因的遗传操作和耐盐性功能鉴定提供了首要的理论参
考资料。采用 DNAMan软件对 PmNHX1基因序列进行
整理和蛋白多重序列比对,并对系统进化树进行构建,采
用的是 C lustal X软件 ( Ver 1. 8), 进化距离的计算用
Neighbor - Join ing方法在Mega4软件作图。用 B last程序
软件从 GenBank中挑选 5个来源不同植物中的逆向运输
蛋白的氨基酸序列,这些序列依次为:野滨黎 AgNHX1
( BAB11940),拟南芥的 AtNHX1(NP_187288),盐角草的
SeNHX1( AAN08157), 水稻 OsNHX1( BAA83337),棉花
GhNHX1( AAM54141)。用 P rotparam分析 PmNHX1编码
蛋白的氨基酸序列组成、相对分子质量、等电点等理化性
质 ( h ttp: / /au. expasy. org /tool /p rotpara- m s. h tm l); 利用
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2009, 29( 1) 张雨良 等: 新疆盐生植物车前 PmNHX1基因的克隆及生物信息学分析
DNASTAR预测新疆车前 PmNHX1蛋白二级结构;利用
Scanprosite搜索 PmNHX1编码蛋白的 Motif( h ttp: / /us.
expasy. org /p rosite /);利用 TMHMM软件进行蛋白质跨膜
区 段 预 测 ( h ttp: / /genome. cbs. dtu. dk /services /
TMHMM /);利用 Signal P程序分析 N-末端的信号肽序
列 ( h ttp: / /genome. cbs. d tu. dk /services / SignalP /); 用
P rotFun分析分析预测 PmNHX1蛋白的功能 ( h ttp: / /
www. cbs. dtu. dk /services /P rotFun /)。
2 结果与分析
2. 1 PmNHX1基因保守区中间片段的克隆与分析
用新疆车前 cDNA为模板,两对简并引物 P1和 P2进
行 RT-PCR反应, PCR产物在 1%的琼脂糖凝胶中电泳,
Gold View染色,引物 P1与引物 P2的产物在 600 bp左右
有一条亮带,与预测的基因片段基本相符,初步判断为目
的基因片段 (图 1)。回收与克隆载体 pMD19-T连接,转化
后送 3个单克隆送公司测序。测序结果表明,插入的中间
片段 1为 619 bp。应用生物软件 Primer P rem ier5, DNAMan
和 B last在线软件,将测序的序列与已经报道的基因进行
同源性比较,结果显示插入片段与 NHX1基因家族的保守
区有着较高的同源性,其中与夏堇 (Toren ia hybrida )的同源
性最高为 81%,与拟南芥 (Arabidopsis tha liana )的同源性
68%。为了便于 5cRACE操作,又设计了简并引物 P3和
P4,方法同上所述。测序结果表明,中间片段 2为 662 bp
(图 2),并将中间片段 1和 2进行序列拼接。
图 1 PmNHX1基因中间片段 1的 PCR扩增
F ig. 1 PCR resu lt ofPmNHX1m idd le fragmen t on e
M: DL2000Marker; 1: M idd le fragment one
2. 2 cDNA编码区全长的克隆与序列分析
图 2 PmNHX1基因中间片段 2的 PCR扩增
F ig. 2 PCR resu lt ofPmNHX1m idd le fragm en t tw o
M: DL2000Marker; 1: M idd le fragmen t two
为了获得 PmNHX1基因的全长,根据已获得中间
片段 1和 2的拼接序列和 TaKaRa独特设计的 5c和 3c
RACE outer和 Inner p rimer, 同时我们分别设计了 5c
RACE和 3cRACE特异性引物 GSP1和 GSP2,分别配对
进行扩增。 5c RACE GSP1与 5c RACE outer p rimer在
800 bp左右有一条亮带, 5c RACE GSP2与 5c RACE
inner p rimer在 650bp左右有一条亮带 (图 3 )。 3c
RACE GSP1与 3cRACE outer p rimer在 1 100bp左右有
一条亮带, 3c RACE GSP2与 3c RACE inner p rimer在
950bp左右有一条亮带 (图 4)。将 PCR产物回收,连接
后转化,每一组分别取 3个阳性克隆子进行测序。通
过序列分析拼接后获得含有一个完整编码区的基因序
列,命名为 PmNHX1, GenBank登录号为 EU233808, 其
cDNA 全长 2 464bp, 包含一个完整开放阅读框为
1 662bp,编码 553个氨基酸残基的多肽, 5c端非编码区
( 5cUTR) 426 bp和 3c端非编码区 ( 3cUTR) 376 bp。在
poly(A )上游 10 bp存在典型的真核生物基因 poly( A)
的信号序列 -AATAAA,起始密码子 ATG附近具有 5c -
CAAAATGG-3c序列结构, 与其他真核生物中普遍存在
的高效起始序列 5c -CA /GNNATGG-3c一致。
图 3 PmNHX1基因 5cRACE PCR扩增结果
F ig. 3 PCR resu lts ofPmNHX1 gene by 5cRACE
M: DL2000Marker; 1: PCR amp lification produ ct of p rimer 5 and
3c RACE outer p rimer; 2: PCR amp lification p roduct of primer 6
and 5c RACE inner p rimer
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中国生物工程杂志 China Biotechnology Vo.l 29 No. 1 2009
图 4 PmNHX1基因 3cRACE PCR扩增结果
F ig. 4 PCR results ofPmNHX1 gene b y 3cRACE
M: DL2000Marker; 1: PCR amp lification produ ct of primer 7 and
5c RACE ou ter p rimer; 2: PCR amp lification p roduct of primer 8
and 3cRACE inner p rimer
蛋白序列比对及系统进化树的构建采用 C lustalX
软件 (Ver1. 8 ),进化距离的计算用 Neighbor-Joining方
法在 Mega4软件作图。用于进化树分析的 Na+ /H +逆
向转运蛋白的来源与 GenBank注册号如下:新疆车前
PmNHX1(ABW93557),野滨黎 AgNHX1( BAB11940),
拟南芥的 A tNHX1 ( NP _187288), 盐角草的 SeNHX1
( AAN08157 ), 水 稻 OsNHX1 ( BAA83337 ), 棉 花
GhNHX1(AAM54141),分析结果见图 5和图 6。
2. 3 PmNHX1逆向运输蛋白的理化性质
用 P rotparam预测 PmNHX1逆向运输蛋白的理化
性质,推测该蛋白的分子式为 C2820H4387N695O767S27,相对
分子质量为 61 164. 6,等电点为 7. 22;理论推导半衰期
大于 10h,不稳定参数为 33. 16,属于稳定蛋白 (标准 40
以下为稳定蛋白 )。该蛋白中相对含量比较多的氨基
图 5 新疆车前 PmNHX1与其他植物液泡膜 Na+ /H+逆向运输蛋白氨基酸序列比较
F ig. 5 A lignm ent ofPmNHX1 and oth er p lan t vacuola r Na十 /H十 an tip or ter s
An tiporter inh ib itor. s ami loride-b ind ingmotif ismark edw ith asterisk s. Iden tical residues among the six proteins are indicated in b lack,
and conservative amino acid subst itu tions are ind icated in gray
酸是 Leu( 63个, 11. 4% )、Val( 50个, 9. 0% )、Ser( 47
个, 8. 5% )、Phe( 45个, 8. 1% )和 Thr( 44个, 8. 0% )。
图 6 几种植物 Na十 /H十 逆向转运蛋白的
系统进化关系分析
F ig. 6 Phylogene tic tree ana lysis ofN a+ /H+
an tip or ter s from var ious p lan t spec ies
该蛋白中含量比较少的氨基酸是 Cys( 4个, 0. 7% )和
Trp( 7个, 1. 3% )。总的带负电荷的残基 ( Asp+ Glu)为
38;总的带正电荷的残基 (A rg+ Lys)为 38。亲水性平
均数为 0. 522,预测该蛋白为疏水性蛋白。
2. 4 PmNHX1逆向运输蛋白的二级结构预测
利用 DNASTAR预测新疆车前 PmNHX1蛋白二级
结构 (图 7),可以看出 PmNHX1是以 A螺旋和 B折叠
结构为主。
2. 5 PmNHX1蛋白的 M ot if分析
利用 Scanprosite搜索 PmNHX1编码蛋白的Moti,f
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2009, 29( 1) 张雨良 等: 新疆盐生植物车前 PmNHX1基因的克隆及生物信息学分析
图 7 PmNHX1逆向转运蛋白二级结构预测
F ig. 7 Seconda ry struc tur e p r ed iction of th e ant ipor ter prote in PmNHX1
分析结果表明该蛋白含有多个潜在的翻译后修饰位
点:包括 11个 N-豆寇酰化位点 ( 59~ 64位, 117~ 122
位, 120~ 125位, 142~ 147位, 152~ 157位, 228~ 233
位, 232~ 237位, 282~ 287位, 349~ 354位, 389~ 394位,
482~ 487位 ); 7个蛋白激酶 C磷酸化位点 ( 7~ 9位,
249~ 251位, 300~ 302位, 336~ 338位, 369~ 371位,
460~ 462位, 497~ 499位 ); 3个 N-糖基化位点 ( 50~
53位, 292~ 295位, 367~ 370位 ); 3个酪氨酸激酶 Ò
磷酸化位点 ( 249~ 252位, 475~ 478位, 537~ 540位 );
1个亮氨酸拉链位点 ( 213~ 234位 )。
2. 6 PmNHX1逆向运输蛋白跨膜结构区分析
通过蛋白质亚细胞定位软件 PSORT预测表明
PmNHX1蛋白属于一类跨膜蛋白,利用 TMHMM软件
进行蛋自质跨膜区段预测 ( h ttp: / /genome. cbs. d tu.
dk /services /TMHMM /),结果见图 8表明:该蛋白 N-端
为高度疏水区,位于膜外部, 序列包含 12个跨膜区, 分
别位于第 21~ 43, 52 ~ 70, 77 ~ 95, 114~ 136, 149 ~
167, 180~ 198, 217~ 239, 260~ 289, 304~ 322, 342~
364, 383~ 401, 414~ 436氨基酸残基间, 跨膜螺旋长度
最小 19个氨基酸残基,最大 30个氨基酸残基,平均长
度为 21. 6个氨基酸残基。从图 8中还可以看出,跨膜
结构域 TM5和 TM6并没有完全跨过液泡膜, 据报道这
两个跨膜结构域与 Na+结合,是液泡型 Na+ /H +逆向运
输蛋白活性的重要结构域。因此, 可以推断车前
PmNHX1逆向运输蛋白为一个跨膜运输蛋白。
2. 7 PmNHX1逆向运输蛋白的信号肽分析
利用 Signal P程序分析 PmNHX1逆向运输蛋白
N -末端序列,发现该蛋白可能存在一段信号肽序列,信
号肽切除位点位于 40和 41氨基酸之间即 VIG-HL存
在酶切位点。
2. 8 PmNHX1逆向运输蛋白的功能预测
P rotFun预测 PmNHX1逆向运输蛋白的主要功能
有蛋白运输结合作用、胁迫应答、膜蛋白受体和信号转
导等,其中 PmNHX1所具有的蛋白运输活性功能极有
图 8 PmNHX1逆向运输蛋白跨膜结构分析
F ig. 8 T ransm emb ran e structu re pr ed ic tion of the
an tip or ter p rotein PmNHX1
可能与其他逆向运输蛋白的功能是一致的。
3 讨 论
Na+ /H+逆向转运蛋白是目前研究较为深入的耐盐基
因之一,耐盐植物 Na+ /H +逆向转运蛋白的克隆为作物耐
盐基因工程提供了优良的基因来源。大量的证据表明,液
泡膜 Na+ /H +逆向转运体是盐分区隔化机制的一个重要
组成部分,其运输活性的强弱直接关系到此机制在耐盐功
能中起到的作用大小 [8]。Zhu[13]指出植物有三种机制协同
作用共同阻止胞质内 Na+的累积,即抑制 Na+的流入、增
加 Na+的外流和液泡内 Na+区域化。其中 Na+的外流和
液泡内 Na+区域化主要依赖于质膜和液泡膜上的 Na+ /
H +逆向运输蛋白。植物的 Na+外流可能是由 H+ -ATPase
提供能量,通过质膜 Na+ /H +逆向运输蛋白将 Na+泵到胞
外。Na+液泡区域化是由 H + -ATPase和 H + -PP iase提供
能量,产生跨膜质子电化学梯度将液泡基质中质子顺电化
学梯度运出液泡,同时将胞质中的 Na+逆浓度梯度运入液
泡内积累。这不仅能够降低胞质内的 Na+以维持胞质正
常的 K+ /Na+比值,还可以有效利用储存在液泡中的 Na+
作为渗透剂,从而大大降低了 Na+对植物细胞的毒害作
用。盐敏感植物主要依靠质膜逆向运输蛋白 SOS1排出
Na+而非区隔化,盐生植物则在液泡中积累大量的 Na+ ,其
Na+ /H+反向转运器的生化活性较高 [14 ]。大多数盐生植
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物为吸盐型植物,能够利用 Na+区隔化的分配方式将盐分
积累于液泡中,从而达到耐盐目的 [15]。基于单个基因,筛
选组织特异性启动子,实现排 Na+的质膜 Na+ /H+逆向转
运蛋白在根中的表达及负责离子区隔化的液泡膜 Na+ /
H +逆向转运蛋白在茎、叶中的表达,可能是提高植物耐盐
性的一条有效的途径。但是到目前为止,车前科中 Na+ /
H +逆向运输蛋白基因还未见报道。通过 RT-PCR和
RACE方法得到了 PmNHX1基因。它和夏堇 (Torenia
hybrida )的同源性最高,氨基酸序列的相似性为 80%。
当获得新功能基因 PmNHX1的核苷酸和蛋白质序
列后,更进一步是想了解该基因在逆境植物体中充当什
么样的角色。试验方法是多年来解决这类问题的主要途
径,但运用生物信息学方法,通过计算机模拟和计算可
/预测 0这些信息或提供与之相关的辅助信息 [16]。本文
通过对基因序列和蛋白序列的详细解析 (包括编码区、分
子量、等电点、系统进化树、各级结构和跨膜结构域等 ),
可为进一步研究该基因的功能鉴定提供重要参考。
尽管现在还不完全清楚 Na+ /H +逆向运输蛋白在
正常条件下和盐胁迫条件下的表达调控机制, 但目前
响应盐胁迫的基因表达主要分为依赖于 ABA的信号通
路和不依赖于 ABA的信号通路两种途径。在依赖于
ABA的信号通路中调控植物耐盐基因表达又分为两种
调控途径:一是通过 MYC M/ YB蛋白的激活, 另一个是
通过 bZIP转录因子的调控 [ 17 ]。本实验室还采用了半
定量 RT-PCR分析了新疆车前在一定浓度 NaC l、甘露
醇、ABA和 LiC l处理下,胁迫对 PmNHX1基因表达的
调控作用。发现新疆盐生植物车前幼苗中 PmNHX1明
显受 NaC l胁迫诱导表达,其次是 LiC l、甘露醇和 ABA。
同时也做了干旱胁迫,发现 PmNHX1基因不受干旱胁
迫的诱导 (数据另文发表 )。由此得出结论, PmNHX1
受 NaC l等胁迫的正调节表达,而且叶片中表达丰度最
高。这些结果暗示 PmNHX1在将 Na+从细胞质运输到
液泡区隔化中起重要作用。植物尤其盐生植物可能在
叶片中将 Na+在液泡中区隔化为主要的策略以提高耐
盐性。这种情况与拟南芥 AtNHX1基因的表达模式相
似。另外,有文献报道,通过对拟南芥 AtNHX1基因和
AtNHX2基因的启动子分析发现:在两个启动子上游不
含有 ABA响应元件,而是含有一个 AACNG /CACGTG
元件, 它可能与 MYC M/ YB因子相互作用。这暗示
AtNHX1基因和 AtNHX2基因在依赖于 ABA的信号通
路中是被一些转录因子 (如 RD22)激活而表达的 [18, 19],
说明我们所克隆的 PmNHX1基因可能是依赖于 ABA
的信号通路中的一个下游基因。因此, 下一步的工作
可以对 PmNHX1基因的启动子进行研究,并通过转化
盐敏感和 ABA突变体来研究 PmNHX1基因在渗透胁
迫和离子胁迫下的信号转导途径。如果转 PmNHX1基
因的盐敏感植物拟南芥耐盐性有极大的提高,将进一
步通过反义 PmNHX1基因载体构建、RNA干扰技术及
病毒载体诱导的 PmNHX1基因沉默来对该基因做更深
一步的功能性鉴定及抗盐机理的研究。
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C lon ing and B ioin form a tics Ana lysis ofPmNHX1 G ene from
X in jiang Ha lophyte P lan tago ma ritima
ZHANG Yu- liang1 ZHANG Zhi- jun2 YANG Feng-shan3 Mahesh Kulye1 YUAN Hui1 LUO Shu-ping1
( 1 X in jiang Agricu ltu ralUn iversityAgronomy Departmen,t Urumqi 830052, China)
( 2 ZhejiangForestD epartment School of Forest and Biotechnology, H angzhou 311300, Ch ina)
( 3 H eilongjiangUn iversity L ife Science Departmen,t H arb in 150080, Ch ina)
Ab str act The sa lt damage to the plan ts is mainly caused by Na+ . The cata lytic transport ofNa+ /H+
antiporter protein causes Na+ to come out of the Na+ compartmentalization of the vacuole membrane and the
plasmamembrane of the ce l.l The ha lophyte p lants have been found to be resistant to sa lt stress caused byNa+ .
Based on the conse rvative transport p rotein gene sequence of halophyte, the degenerate pime rs were designed,
and the Na
+
/H
+
transport p rotein gene ( 2464 bp fu ll-length cDNA) in P lantagoma ritima at X injiang, named
asPmNHX1 (GenBank acce ssion numbe r: EU233808), was cloned for the first time by RT-PCR and RACE . It
was found that the cod ing sequence of the gene consisted of the 1662 bp nuc leotides which encoded 553 am ino
acids. The molecu larweigh t of the protein was 61. 16kDa and the isoe lec tric pointwas 7. 22. The data analysis
showed that the protein m ainly located in vacuole membrane was from 12 conse rvative sequence of the
transmembrane domain of which the TM3 transmembrane domain ( LFFIYLLPPI - putative amiloride binding
domain) was found to be responsib le for playing a competitive role. The am ino ac id homology ofPmNHX1 and
othe r plan ts antiporte r protein was 64% ~ 80% . Due to its unique ability to find out physical and chem ical
properties and forecast the function of the gene, the use of b ioinforma tics methods laid the founda tion for study
re lated to identifica tion of the sa lt- tole rant gene function ofPmNHX1.
K ey word s P lantagomaritima Antiporter prote in PmNHX1 Gene cloning Bioinforma tics
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