全 文 ：转 rolA、B、C 基因枳橙快繁技术
胡春华,谢玉明,黄训才,郭 琛,焦 徕,吴芯茹,邓子牛 *
(湖南农业大学园艺园林学院,长沙 410128)
摘 要:通过对转rol基因枳橙B、D、E系及对照的高接植株春梢茎段进行萌芽诱导、增殖及试管苗生根成苗的试验,
摸索出适宜枳橙快繁各种培养基配方及培养条件。结果表明,以MS+6-BA1mg/L的培养基适合于芽萌发,以MS+6-
BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L的培养基适合于芽增殖,生根则以 1/2MS+NAA0.5mg/L+0.2%活性炭的组合最佳,转基
因各系生根率均在93.3%以上,显著高于对照生根率(66.7%)。快繁苗移栽成活率可达90%,目前生长良好。
关键词:rolABC基因;转基因枳橙;组织培养;快速繁殖
中图分类号:S666文献标识码:A 文章编号:1009-9980(2006)01-142-03
In vitropropagationofrolA,B,C ra sgeniccitrange
HUChun-hua,XIEYu-ming,HUANGXun-cai,GUOChen,JIAOLai,WUXin-ru,DENGZi-niu*
(HorticultureandLandscapeCollege,HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan410128 China)
Abstract:InvitropropagationmakesitpossibletospeedthemultiplicationoftherolA,B,Ctransgeniccitrangep ants,soi
ispossibletoquicklyevaluatethisnewrootstock.Usingbudsticksofthetransgenicclones(B,D,E)andthecontrolc trange
as explants,cul ure media containing various plant growth regulators were tested for bud burst,sho t multip ication and
rooting. The resultsindicated thatMSmediumcontaining1 mg/L6-BAresulted in fastestbud bursting,MSadded with 6-
BA0.5 mg/L+ NAA0.05 mg/Lwas the best choice for shoot multiplication,and 1/2MSsupplied with NAA0.5 mg/Land
0.2%activated charcoalshowed quite suitable for rooting. The transgenic clones had significantlyhigher rootingpercentage
(93.3%)thanthatofthecontrol(66.7%).
KeyWords: rolA,B,Cgenes;Transgeniccitrange;Tissueculture;Micropropagation
转rol基因枳橙表现出顶端优势减弱、分枝增
多、节间缩短、整个树冠变得紧凑,矮化[1],有望成为
柑橘新的矮化砧木资源。为了能尽快形成转基因系
群体,以便进行砧木选育,需对转rol基因枳橙进行
快速繁殖研究。柑橘离体培养在国内外进行过长期
研究,在快速繁殖方面,利用实生苗胚轴、子叶或嫁
接苗茎尖培养,有过不少报道[2～5],但大多以实生苗
为材料,并且各类之间还存在较大差异。用嫁接苗枳
橙茎段作外植体及转基因柑橘快繁研究未见报道。
本研究以转 rol基因枳橙及对照高接带芽茎段为材
料,以期优化转基因柑橘快繁技术,获得成批遗传稳
定的转基因枳橙快繁苗,并初步研究 rol基因对枳
橙根系的影响。
1 材料和方法
1.1材料
供试材料为转rol基因枳橙B、D、E3个系[1],以
未经转化的通过相同再生体系获得的枳橙植株为对
照。材料采自高接在10年生枳砧温州蜜柑尾张树的
枝条。
1.2培养方法
芽萌发、增殖基本培养基为 MS,附加 BA,浓度
设为0,1,2,5mg/L,3%蔗糖、0.8%琼脂、pH5.8。生根
培养基为 1/2MS,2%蔗糖、0.8%琼脂、pH5.8,附加
0.2%活性碳(AC)。培养温度(24±2)℃,连续光照12
h/d,光照强度为1000～1500Lx。
枝条去叶、刺后,剪成约5cm长的茎段,自来水
冲洗 60 min,超净工作台上用 70%酒精表面消毒
1 min,再用0.1%的升汞溶液消毒 12min,无菌水冲
洗 3～4次,切成 1.5cm长的单节带芽茎段,然后芽
眼朝上平放于培养基上进行培养。当芽萌发后,将嫩
芽从基部切下,进行芽增殖培养,每月继代1次。每
代选取部分健壮芽进行生根培养。试管苗经过炼苗
后转入白砂土与发酵棉籽壳(1∶1)的基质中,继续在
收稿日期:2005-04-11接受日期:2005-11-18
基金项目:国家转基因专项资助项目(JY04-B-02);湖南农业大学引进人才基金项目(03YJ09)。
作者简介:胡春华,男,在读博士研究生。Tel:0731-4635302
6通讯作者。Authorforcorrespondence.Tel:0731-4635302,E-mail:deng7009@163.com
致谢:本试验在湖南农业大学细胞工程重点实验室完成。特致谢意!
果 树 学 报 2006,23(1):142～144
Journal ofFruit Science
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2006.01.035
胡春华等:转rolA、B、C基因枳橙快繁技术
表1 不同植物生长调节剂及浓度对枳橙芽增殖的影响
Table1Efectsofplantgrowthregulatorsonshoot
multiplicationofthetransgenicandthecontrolcitrange
BA
(mg/L)
NAA
(mg/L)
接种芽个数
ExplantNo.
增 殖 系 数Multiplicationratio
转基因
Transgenicclones
对照
Control
0.0
0.2
0.5
1.0
1.5
0.5
0.5
0.05
0.05
0.05
0.05
0.05
0.00
0.10
30
30
30
30
30
30
30
1.0d
1.5b
2.4a
2.1a
1.4b
1.3c
1.8a
1.0c
1.2c
2.0a
1.6b
1.3c
1.0c
1.3c
温室中生长。
2 结果与分析
2.1 BA对枳橙茎段芽萌发的影响
在MS+BA1mg/L培养基萌发效果最好,接种
7d芽全部萌发,嫩芽整齐、健壮,生长速度快,15d
可达1.5～2.0cm高。BA浓度达2mg/L时,也能诱导
芽萌发,但芽生长不整齐,甚至芽停止生长,最后水
滞样死亡。BA浓度达5mg/L时,几乎无芽萌发,外
植体最后褐化死亡。不加BA时,外植体仅有部分萌
发,芽生长速度慢、不整齐、生长势弱。
2.2 芽的增殖
2.2.1 植物生长调节剂对芽增殖的影响 从表1中
可以看出,以MS+BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L的培
养基配方最适合于枳橙芽的增殖,其增殖系数分别
达到2.4和2.0。BA浓度对芽的增殖影响很大,浓度
增加或者减少,增殖系数均减少。这与Jameel等[6]的
研究结果相似。NAA对芽的增殖影响不及BA,但适
当浓度的NAA有利于芽的生长,BA浓度为0.5mg/
L时,NAA由 0增加到 0.05mg/L时,芽生长情况、
增殖系数有所提高。提高到0.1mg/L时,致使外植
体产生愈伤组织,增殖系数下降。
2.2.2 不同继代培养次数对枳橙芽增殖的影响 第
1代培养过程中,各转rol基因枳橙系及对照都出现
不同程度试管脱落现象,但经过第1代驯化后,叶片
不再脱落,芽基部产生大量丛芽,芽梢长势好,叶色
浓绿,有效新梢多。第1代到第4代,芽增殖系数逐
步提高,第 4代达到最大值,其中对照由 2.06增加
到 2.86,转基因 B、D、E各系由 2.43～2.66增加为
4.36～4.83。增殖芽无畸形,几乎没有愈伤组织形成,
生长势旺。转基因各系新梢与田间苗一样,表现出矮
化性状,一般新梢长度在2cm左右,而对照达到3～
4cm(图版-3,4)。到第5代,少数外植体基部形成一
层较薄的愈伤组织。
影响了芽的质量和芽的增殖系数。为了解决此
问题,第6代继代时,先将继代芽转入 MS无激素培
养基培养10d,以降低体内激素浓度水平,然后再转
入增殖培养基继续继代培养,从而有效地避免了愈
伤组织的产生,保持了转基因各系每1代增殖系数
在3.5以上,对照增殖系数在2.7以上。
2.2.3 转基因与对照芽增殖的差别 转基因各系与
对照的芽增殖存在着明显的差异。在继代培养中,转
基因各系形成的芽多、芽梢短,叶片小,叶柄短,与转
基因田间植株的表现相似。同时,由于腋芽生长多而
快,芽增殖系数各代都比对照要高,特别是第 4代,
B系增殖系数达到4.83,而对照只有2.86。
2.3 生根培养与移栽
2.3.1 不同培养基配方对枳橙生根的影响 从表2
可以看出,最适合于生根的培养基配方为 1/2MS+
NAA0.5mg/L+0.2%AC培养基,转基因D系生根率
达到100%,对照为66.7%。根健壮,白色,根数2～4
条,根长 3～6cm。部分根长出多条侧根,芽苗长势
好,其次为1/2MS+NAA0.2mg/L+0.2%AC培养基。
1/2MS+NAA0+0.2%AC培养基的生根效果最差,对
照不生根,转基因系生根率只有30%。
NAA对枳橙生根有着显著的影响。当NAA浓
度由 0升至 0.5mg/L时,对照生根率由 0升至
66.7%,转基因枳橙D系由30%提升至100%。对照
枳橙在无NAA培养基上不能生根,转基因枳橙也只
有部分芽能诱导出根,但根细、褐色、老化,芽苗生长
势差,生长慢。
此外,活性炭(AC)也能显著促进根的诱导和生
长,1/2MS+NAA0.5mg/L培养基不加活性炭,生根
率显著降低,原因可能是活性炭的加入造成了培养
基的黑暗,使其更接近自然土壤的黑暗条件,从而适
合于生根培养;也可能是吸收了切芽分泌的不利于
根生长的代谢产物,从而有效地促进生根。
2.3.2 转基因枳橙与对照生根差异 转基因枳橙与
对照生根存在显著的差异。在相同的培养条件下,无
论是生根率还是单芽平均根数,前者都显著高于后
者(表2)。在1/2MS+NAA0.5mg/L+0.2%AC生根培
养基中,转基因苗诱导 15d即有根产生,对照要滞
后 4～6d,转基因枳橙生根率达到 93.3%、单芽平均
根数2.1条以上,部分根还分化出多条侧根。对照生
根率只有 66.7%,单芽平均根数 1.5,无侧根(图版-
5)。另外,转基因苗还能在无激素生根培养基上诱导
1期
注:同列中不同字母表示差异显著性(P<0.05)。下同。
Note:Thediferentletersinthesamecolumnmeanssignificantdifer-
enceat0.05levelbyDuncan’s.Thesameasbelow.
143
表2 转基因与对照枳橙生根差异
Table2Thediferencebetweentransgeniccitrangeandthecontrolonrootinginduction
培养基Medium 外植体Explant 接种芽数ExplantNo. 单芽平均根数RootNo.pershoot 生根率Rootingrate(%)
1/2MS+NAA0.5mg/L+0.2%AC
1/2MS+NAA0.2mg/L+0.2%AC
1/2MS+NAA0+0.2%AC
1/2MS+NAA0.5mg/L
B系CloneB
D系CloneD
E系CloneE
对照Control
B系CloneB
D系CloneD
E系CloneE
对照Control
B系CloneB
D系CloneD
E系CloneE
对照Control
B系CloneB
D系CloneD
E系CloneE
对照Control
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
30
2.4a
2.3a
2.1a
1.5b
2.1a
1.9a
2.2a
1.1b
1.0a
1.0a
1.0a
0.0b
2.0a
2.1a
2.2a
1.0b
96.7a
100.0a
93.3a
66.7b
93.3a
90.0a
93.3a
63.3b
30.0a
26.7a
33.3a
0.0b
80.0a
73.3a
83.3a
46.7b
图1 不同继代培养次数对转rol基因枳橙芽增殖的影响
Fig.1 Theefectsofsubculturetimesonshootsmultiplica-
tionofthetransgenicandthecontrolcitrangeplants
生根,甚至还能在增殖培养基中生根,这在对照中却
没有此现象,表明rolABC基因具有很强的诱根效
果,转基因枳橙表现出很强的生根能力,这与转 rol
基因促进生根的结论相同[7～9]。
2.3.3 试管苗移栽 生根培养30～35d后,将苗小
心从瓶中取出,彻底洗净根上培养基,移栽到白沙
土∶棉籽壳=1∶1的基质中,薄膜覆盖30d保湿。成活
率在90%以上。目前已有500多株转基因苗及100
多株对照的试管苗移栽入温室(图版-6)。
果 树 学 报 23卷
3 讨 论
转 rolA、B、C基因枳橙同其他转基因柑橘一
样,是通过卡那霉素抗性筛选而获得的。而具有卡那
霉素抗性的转基因芽难以生根的现象已有报道[10]。
通常转基因柑橘的再生都避开生根过程,直接嫁接
到砧木上,结果是很难得到自根的转基因植株。本试
验结果表明,转rolA、B、C基因枳橙虽然同样具有
卡那霉素抗性,但却表现出很强的生根能力,并成功
获得了批量的转基因自根苗。
同时,对转rolA、B、C基因枳橙芽将近1年的
增殖继代培养,继代芽能保持较高的增殖率并有效
地避免了愈伤组织成苗途径。通过对高接枳橙带芽
茎段的芽萌发、芽增殖、生根及试管苗移栽等4个环
节的试验,初步得出了1套关于转基因枳橙的快繁
技术,大大提高了转基因枳橙的繁殖效率,为柑橘工
厂化育苗提供了技术参考,加快了对转基因及新选
育品种的繁殖速度,进而加速了选育种的进程。(本
文图版见封底)
参考文献References:
[1]GentileA,DengZN,MalfaSLa,etal.MorphologicalandPhysio-
logicalEfectsofrolABCGenesintoCitrusGenome[J].ProcXLVI
ItalianSoc.Agr.Genetics,2002,1～8.
[2]CHENQY,SONGRL,CHENJY,etal(陈菁瑛,宋瑞琳,陈景
耀,等).Astudyonshoottipcultureandinducingproliferationof
trifoliateorangeandcitrange[J].JournalofFujianAcademyofAgri-
culturalSciences(福建省农科院学报),1991(6):53～59.(inChi-
nese)
[3]CHENQY,SONGRL,CHENJY,etal(陈菁瑛,宋瑞琳,陈景耀,
等).StudiesonshoottipcultureofcitrusⅠ.Shoottipcultureandits
propagation[J].JournalofFujianAcademyofAgriculturalSciences(福
建省农科院学报),1994,9(3):1～6.(inChinese)
[4]WANGRX,GAOCW,LIJR,etal(王任翔,高成伟,李洁荣,
等).TissuecultureofcitrusCV.Olindainivtro[J].JournalofGuangxi
NormalUniversity(广西师范大学学报),2003(6):71～74.(inChi-
nese)
[5]WANGRX,LIANGQH,CHENTT,etal(王任翔,梁倩华,陈腾土,
等).Tissuecultureofcitrusgrandis[J].ChineseBuletinofBotany(植
物学通报),1996,13(增刊):70～71.(inChinese)
[6]JameelM.Al-Khayri,AbdulazizM.Al-Bahrany.Invitromicro-
propagationofCitrusaurantifolia(lime)[J].CurentScience,2001,
81:1242～1246.
[7]CasanovaE,TrilasM,MoyssetL,etal.Influenceofrolgenesin
floriculture[J].BiotechnolAdv,2005,23(1):37～39.
[8]Ben-HayyimG,DamonJP,martin-TanguyJ,etal.Changingroot
systemarchitecturethroughinhibitionofputrescineandferuloylpu-
trescineaccumulation[J].FEBSLet,1994,342(2):145～148.
[9]RadiaAyadi,Jocelyne.RootformationfromtransgeniccaliofGink-
gobiloba[J].TreePhysiology,2003,23:713～718.
[10]CHENSC,ZHANGJR,HUANGZR,etal(陈善春,张进任,黄
自然,等).StudiesonAgrobacterium-mediatedAntibacterialPep-
tideDgenetransferincitrus[J].ScientiaAgriculturaSinica(中国农
业科学),1997,30(3):7～13.(inChinese)
144