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第 36 卷第 6 期 湖南农业大学学报(自然科学版) Vol.36 No.6
2010 年 12 月 Journal of Hunan Agricultural University (Natural Sciences) Dec．2010
DOI:10.3724/SP.J.1238.2010.00634
转基因枳橙中 rolABC 基因荧光定量表达分析方法的建立
袁飞荣 1,2,3，严佳文 1,2,3，罗坤 1,2,3，Alessandra Gentile4，王晓君 3，刘东波 1, 3，邓子牛 1,2,3*
(1.湖南农业大学 园艺园林学院，湖南 长沙 410128；2.国家柑橘改良中心 长沙分中心，湖南 长沙 410128；
3.湖南省作物种质创新与资源利用重点实验室，湖南 长沙 410128；4.卡塔尼亚大学 园艺与农产品加工系，意
大利，卡塔尼亚 95123)

摘 要：以转 rolABC 基因枳橙 B、D、E 系及野生植株为材料，制备标准品，采用 SYBR Green I 染料，构建 rol
基因和 β-actin 基因的双标准曲线，校正引物扩增效率后，用 2－∆∆Ct 法对 rol 基因在嫩茎、嫩叶、功能叶、树皮和
根中的 mRNA 水平进行相对定量，建立适合于 rolA、rolB、rolC 基因实时荧光定量 RT-PCR 分析方法．初步认为
rolC 基因在嫩茎、嫩叶、功能叶和树皮中表达量最高；其次是 rolA 基因，主要在嫩茎中表达；rolB 基因表达量
最低，主要在根系中表达．
关 键 词：实时荧光定量 RT-PCR；rolABC 基因；特洛亚枳橙；相对表达量；基因表达
中图分类号：Q78 文献标志码：A 文章编号：1007-1032(2010)06-0634-06

Establishment of fluorescence quantitative RT-PCR assay on
rolABC genes in transgenic Troyer citrange
YUAN Fei-rong1,2,3, YAN Jia-wen1,2,3, LUO Kun1,2,3, Alessandra Gentile4, WANG Xiao-jun3,
LIU Dong-bo1,3, DENG Zi-niu1,2,3*
(1. College of Horticulture and Landscape, HNAU, Changsha 410128, China; 2. Changsha Subcenter, National Center
of Citrus Improvement, Changsha 410128, China; 3. Hunan Provincial Key Laboratory of Corp Germplasm Innovation
and Utilization, Changsha 410128, China; 4. Dipartimento di Ortofloroarboricoltura e Tecnologie Agroalimentari,
Catania University, Catania 95123, Italy)

Abstract：B, D, E transgenic clones with rolABC genes and wildtype plants were used as materials to construct binary
standard curves of rol genes and β-actin gene with SYBR Green I fluorescent dye. After normalizing the influence of
amplification efficiency with different primers in qRT-PCR, comparative Delta-delta Ct method was applied to develop
suitable qRT-PCR method for analysising the expression of rolA, rolB, rolC genes in 5 tested tissues of B, D, E clones.
The primary result showed that rolC expressed highest among 3 rol genes in tender stem, tender leaf, functional leaf and
bark, rolA gene’s expression in the middle level and mainly in tender stem, and rolB expressed lowest and mainly in
root.
Key words：quantitative RT-PCR; rolABC genes; Troyer citrange; relative quantitation; gene expression

荧光定量 PCR(FQ-PCR)是近年来发展起来的
一种高效、准确、灵敏的核酸定量分析方法，在病
毒检测、转基因植物鉴定和基因定量表达分析等领
域已得到广泛应用[1-3]．荧光定量 PCR 根据所用试
收稿日期：2010-03-04
基金项目：国家科技支撑计划项目(2008BADB7B02)
作者简介：袁飞荣(1981—)，男，湖南永州人，博士研究生，从事植物矮化机理研究；*通讯作者，deng7009@163.com


第 36 卷第 6 期 袁荣飞等 转基因枳橙中 rol ABC 基因荧光定量表达分析方法的建立 635
剂不同可分为 SYBR Green I 法、Taqman 探针法及
分子信标等，数据分析主要有绝对定量和相对定量
两种方法[4-5]，在基因表达研究中，相对定量法应用
广泛，常用的相对定量方法有双标准曲线法和 2－∆∆Ct
法[6]．rolA、rolB、rolC 基因分别位于发根农杆菌
A4 菌株 Ri 质粒 T-DNA 区的第 10、11、12 开放阅
读框上，至今已经成功利用 Ri 质粒对包括 27 个科
55 个属的许多草本植物和一些林木、果树进行了转
化[7]，获得的转 rol 基因植物多数表现出节间变短、
分枝增多、大量毛状根生成、植株显著矮化等特异
性状[8-10]．不同的物种，基因表达具有特异性．笔
者选用 SYBR Green I 荧光染料，采用校正引物扩增
效率的 2－∆∆Ct 法分析 rolA、rolB、rolC 基因在转基
因枳橙 B、D、E 系中嫩茎、嫩叶、功能叶、皮和
根中的 mRNA 转录水平差异，建立了适合于 rolA、
rolB、rolC 基因荧光定量 RT-PCR 分析方法．
1 材料与方法
1.1 材 料
用包含双元质粒 pDN3514[11]的根癌农杆菌
C58C1[12]介导转化枳橙[13]，其中 T-DNA 区包括
CaMV 35S 启动子、gus 基因、nptⅡ基因和 rolA、rolB、
rolC 基因．经分子鉴定获得多个转基因株系，组织
培养繁殖 B、D、E 系及对照特洛亚枳橙自根苗作
为试验材料[14]，采集转 rolABC 基因枳橙 B、D、E
3 个株系的嫩茎、嫩叶、功能叶、树皮和根，立即
液氮冷冻，提取 RNA．RNA 定量采用日本岛津公
司 UV-1800；采用北京 Promega M-MLV Reverse
Transcriptase 反转录试剂盒合成 cDNA，采用 ABI
7500 荧光定量 PCR 仪，TaKaRa，SYBR® Premix
Ex TaqTM，Perfect Real Time 试剂盒进行定量 PCR
分析．
1.2 方 法
1.2.1 RNA 制备
采用 Trizol 法提取转 rolABC 基因枳橙 B、D、
E 3 个株系的嫩茎、嫩叶、功能叶、树皮和根的总
RNA，研磨后分装 3 管作为 3 个生物学重复，可见
紫外分光光度计测定 RNA 浓度，OD260/OD280 为
1.8~2.0 时，认为 RNA 质量达到要求，每管取 6 µg
RNA 用 DNase I 进行消化，消除 DNA 污染．
1.2.2 实时定量 PCR 标准品的制备
冻融法 [15]将包含 rolA、rolB、rolC 基因的
pDN3514 质粒转入大肠杆菌，挑取单菌落，转入
30 mL 含抗 50 mg/L 卡那霉素的 LB 液体培养基中，
37 ℃振荡过夜，采用小量质粒提取法提取质粒(天
根公司试剂盒 TIANprep Mini Plasmid Kit DP103)，
用作 rolA、rolB、rolC 基因定量分析的标准品．提
取样品的 RNA，反转录合成 cDNA 作为 β-actin 基
因定量分析的标准品，将标准品 10 倍梯度稀释作
为模板进行定量 PCR 分析，分别构建 rolA、rolB、
rolC 基因和 β-actin 基因定量表达分析的标准曲线．
1.2.3 cDNA 第一链的合成
用 Oligo DT18 随机引物，MMLV 反转录酶建
立体系合成 cDNA，依次添加 5×RT-Buffer 5 µL，1
µmol/L dNTP 5 µL 混合液和 4 µmol/L Oligo DT18 随
机引物 0.5 µL，RNase Inhibitor 0.5 µL 和 MMLV
RTase 0.5 µL，RNA 2 µg，加水补足体积到 25 µL，
95 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，最后，72 ℃下加热 10 min
终止反应．
1.2.4 标准曲线的建立与样品实时定量 PCR
根据 GenBank 中 rolA、rolB、rolC 和 β-actin
基因的序列，利用 ABI 公司 Primer Express 3.0 软
件设计引物(表 1)，用 SYBR Green I 法进行实时定
量 PCR 分析，20 µL 反应体系为：SYBR® Premix Ex
表 1 定量 RT-PCR 靶标基因及内参基因引物序列
Table 1 Primers sequence of target genes and reference gene used in quantitative RT-PCR
基因 上游引物 下游引物 扩增片段长度/bp
rolA (X64255) 5′GACCTTCGGAGTATTATGGC-3′ 5′-AAGTCATGGCCAAAGGAGTG-3′ 143
rolB (CAA45540) 5′-CTCGCCGCAGAAAGAAGGT-3′ 5′- ATCGCCATTTTCGCAAGTTC-3′ 100
rolC (X64255) 5′-TTCGGTTACGCGGATCCTAT-3′ 5′-GCCGATTGCAAACTTGCACTC-3′ 198
β-actin (CA824001) 5′-CACACTGGAGTGATGGTTGG-3′ 5′-ATTGGCCTTGGGGTTAAGAG-3′ 228



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TaqTM (2×)10.0 µL，上游引物(2.5 µmol/L) 1.5 µL，下
游引物(2.5 µmol/L) 1.5 µL，ROX Reference Dye
(50×) 0.4 µL，cDNA 1.5 µL，ddH2O 5.1 µL，每样本
设置 3 个重复．定量 PCR 反应条件：95 ℃预变性
30 s，95 ℃变性 5 s，55 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 31 s，
进行 40 个循环，在 72 ℃延伸步骤收集荧光信号，
最后添加熔解曲线．同样反应体系和定量 PCR 反应
条件，101~105 倍稀释标准品，构建 rolABC 基因的
标准曲线，设置 105 稀释的 DNA 起始模板值为 10，
其他梯度的 DNA 模板数依次递增．PCR 扩增效率
通过标准曲线的斜率计算[16]．
1.2.5 数据分析
利用 7500 SDS system software 2.0 软件，经 2
次自动设置荧光阈值和扩增效率获得 Ct 值，根据
2-∆∆Ct 法计算 rolA、rolB、rolC 基因表达值，比较各
基因在不同组织中的表达值．采用 SPSS 15.0 软件
进行统计分析．
2 结果与分析
2.1 标准曲线
取 rolA、rolB、rolC 和 β-actin 基因标准品，10
倍稀释做为模板，进行实时荧光定量 PCR，设置 3
个同水平重复，构建标准曲线，获得 cDNA 浓度的
对数值与 Ct 值的关系(图 1)．rolA、rolB、rolC、β-actin
基因的相关系数均达到 0.98 或以上，扩增效率 E 值
分别为 119.4%、94.5%、73.3%和 89.3%．
















1、2、3、4 分别代表 rolA、rolB、rolC 和 β-actin 基因标准曲线．
图 1 rolA、rolB、rolC 基因及内参基因 qRT-PCR 标准曲线
Fig. 1 Standard curves of rol genes and reference gene were established for quantitative RT-PCR analysis

2.2 引物扩增特异性验证
1%琼脂糖电泳和 qRT-PCR 产物熔解曲线确认，
电泳均获得单一目标条带，片段大小正确(图 2)，



rolA、rolB、rolC 及 β-actin 基因熔解曲线都呈单峰
型 (图 3)，说明设计的引物均能达到荧光定量
RT-PCR 的要求．
y = -2.929 9x + 30.089
R 2 = 0.979 7
0
10
20
30
0 1 2 3 4 5 6
lg R 0
C
t值
1
0

y = -3.460 2x + 28.589
R 2 = 0.997 0
0
10
20
30
0 2 4 6
lg R 0
C
t值
2
0
y = -4.189 5x + 33.614
R 2 = 0.996 5
0
10
20
30
40
0 2 4 6
lg R 0
C
t值
3
0
y = -3.608 8x + 41.703
R 2 = 0.989 2
0
10
20
30
40
0 2 4 6
lg R 0
C
t值
4
0


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1、2、3、4 分别代表 rolA、rol B、rolC 和 β-actin 基因 qRT-PCR 扩增产物 1%琼脂糖凝胶电泳；+为 rolABC 阳性质粒正对照；CK 为非转基因枳
橙；B、D、E 为转 rolABC 基因枳橙 B、D、E 系．
图 2 1%琼脂糖凝胶电泳验证 qRT-PCR 产物大小及特异性
Fig.2 Evaluating the specificity of qRT-PCR primers and amplified fragment size with 1% agarose gel electrophoresis
















温度/℃ 温度/℃
1、2、3、4 分别为 rolA 基因、rolB 基因、rolC 基因、β-actin 基因 qRT-PCR 扩增产物的的熔解曲线．
图 3 熔解曲线评价 qRT-PCR 引物的特异性
Fig.3 Evaluating the specificity of primers used in qRT-PCR

2.3 2-∆∆Ct法计算 rol基因在转基因枳橙 3个株系组
织中相对表达的稳定性
在 ABI 7500 SDS2.0 软件中输入各基因扩增效
率校正 Ct 值，用 2－∆∆Ct 法分析 rolA、rolB、rolC 基
因表达，总体上，rolC 基因表达最强，其在嫩茎、
嫩叶、树皮、功能叶中均高水平表达，在根中不表
达(图 4-3)．rolA 基因主要在嫩茎中表达(图 4-1)．rolB
基因表达量最低，主要在根中表达，在其他组织中
表达值很低(图 4-2)．不同株系、不同组织外源基因

表达差异明显，rolA 基因在 B、D 系嫩茎中表达显
著强于 E 系，rolB 基因在 B、D 系根中表达水平同
样显著高于 E 系．rolC 基因在嫩茎中 B 系最高，B、
D 系 rolC 基因在嫩叶、功能叶、皮中表达无明显差
异，但在 E 系嫩叶、功能叶中 rolC 基因表达量显著
高于 B、D 系．3 次重复结果比较稳定，说明所建
立的相对定量方法可靠，可进一步用于 rolA、rolB、
rolC 基因时空表达研究．
M + CK CK B D E + CK B D E M CK B B D D E E M M CK CK B D E
1 2 3 4
1 2
3 4
derivative
derivative


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1 2 3
1 rolA 基因表达；2 rolB 基因表达；3 rolC 基因表达；非转基因枳橙(CK) rolABC 表达值检测为 0．
图 4 rol 基因在 3 个株系中的 qRT-PCR 相对定量分析
Fig.4 Relative quantitative RT-PCR analysis of rol genes in 5 tested tissues of 3 different transgenic Troyer citrange clons

3 讨 论
管家基因(house keeping genes)在生物体内持
续稳定表达，实时荧光定量 PCR 技术的核心是应用
管家基因作为内参基因对样品细胞数进行归一化，
定量一定细胞数的靶标核酸的含量．然而，内参基
因的稳定性易受物种、组织器官、发育阶段、环境
条件影响[17-18]，因此，对内参基因评价和选择，是
荧光定量 PCR 对核酸准确定量的关键．目前，常用
的内参基因有甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因、β-actin、
28S 和 18S rRNA 基因，但不同物种中管家基因的稳
定性并不一致，因而，必须选择和评价内参基因的稳
定性[19]．评价内参基因选择有严格的程序[16-19]，所
设置的参数能较好评价内参基因的稳定性，在数据
处理上，可以利用优化的内参基因组合对样品 Ct
值进行归一化处理，其定量结果更加可靠，多内参
基因的应用已成为荧光定量 PCR 研究基因表达的
趋势[20-23]．
在基因表达研究中，相对定量法常用 2－∆∆Ct 法，
计算方便，适合于大量样品的分析，但由于 Ct 值
受引物扩增效率影响很大，用此法计算不能消除扩
增效率的误差，定量准确性受到影响，在引物扩增
效率处于 90%~110%之外[24]，通常需引入扩增效率
对 Ct 值进行归一化，不少定量 PCR 仪自带软件包
含此项功能，如 7500 SDS2.0 软件，可输入特异引
物的扩增效率对 Ct 值进行校正，然后通过 2－∆∆Ct
法计算相对定量结果，从而消除扩增效率的误
差．双标准曲线法因为需要制备标准品，同时建立
内参基因和靶标基因的标准曲线，程序变得复杂，
适合于多基因但小量样品的核酸定量分析，定量方
法的稳定性、可靠性通常采用设置试验重复来验
证．标准品在核酸定量分析、引物扩增效率的计算
上均有应用，DNA 常用的标准品有插入靶标基因的
质粒、PCR 扩增回收产物，高丰度靶标基因的 DNA
样品，RNA 常用的标准品有插入靶标基因的质粒、
PCR 扩增回收产物和高丰度的 RNA 合成的 cDNA，
以及体外转录的获得 RNA，最佳的标准品是最能体
现样品荧光定量 PCR 扩增动力学的模板[25]．
此外，PCR 反应体系的稳定性也影响定量结
果．为调控反应体系的稳定性，核酸样品在定量分
析前必须进行纯化、浓度归一化，DNA 样品可进行
浓度测定、计算、稀释归一化，RNA 样品在反转录
时必须控制加入的 RNA 量，之后再进行 cDNA 浓
度的归一化．这样可以更好地保证 PCR 反应体系的
稳定性，避免不同样品因模板量不同和反应体系改
变而影响扩增效率，从而影响到最终定量结果．
本研究方法以包含 rol 基因质粒作为靶标基因
定量分析的标准品，提取样品 RNA，采用 Oligo DT18
合成 cDNA 作为内参基因定量分析的标准品，通过
梯度稀释标准品，构建靶标基因和内参基因定量分
析双标准曲线．标准品与样品用作模板扩增动力学
曲线有较好的一致性，通过建立标准曲线，较好的
消除了扩增效率的影响，对样品浓度进行归一化，
建立稳定的反应体系，定量分析高效，结果可靠．
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0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
嫩茎 嫩叶 功能叶 树皮 根
ro
lA
基
因
相
对
表
达
值
CK B系 D系 E系
0
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嫩茎 嫩叶 功能叶 树皮 根
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基
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相
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CK B系 D系 E系
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嫩茎 嫩叶 功能叶 树皮 根
ro
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CK B系 D系 E系


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责任编辑：罗慧敏
英文编辑：胡东平