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黄花水龙化感物质对铜绿微囊藻生长及藻毒素产生和释放的影响



全 文 :第 45卷 第 4期 海 洋 与 湖 沼 Vol.45, No.4
2 0 1 4 年 7 月 OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICA Jul., 2014

*国家自然科学基金青年科学基金项目, 21207036号; 浙江省自然科学基金青年科学基金项目, LQ12B07001号; 浙江省重点
科技创新团队项目, 2012R10026-14 号; 浙江省重大科技专项重大农业项目, 2010C02001 号。吴湘, 副教授, Email: wwxx1981
@126.com
收稿日期: 2013-07-22, 收修改稿日期: 2013-09-30
黄花水龙化感物质对铜绿微囊藻生长及
藻毒素产生和释放的影响*
吴 湘1 吴 昊2 叶金云1
(1. 浙江省水生生物资源养护与开发技术研究重点实验室 湖州师范学院生命科学学院 湖州 313000;
2. 湖州市环境保护监测中心站 湖州 313000)
提要 本文研究了黄花水龙化感物质对铜绿微囊藻生长的抑制作用及其最佳抑藻浓度范围, 以及
对微囊藻毒素(MC-LR)产生和释放的影响。结果表明: 黄花水龙化感物质在培养 7d内对铜绿微囊藻
(FACHB-905)具有较强的抑制作用, 半效应质量浓度(EC50,7d)值为 47mg/L, 但抑制效果会随时间的延
长而减弱。黄花水龙化感物质的最佳抑藻浓度范围为 50—75mg/L, 藻细胞培养 4—7d内相对抑制率
达 50%—95%。同时发现整个培养期间, 黄花水龙化感物质对 MC-LR的胞外释放无显著影响。培养
7d后, 单位藻细胞内 MC-LR的含量随黄花水龙化感物质浓度的增加而升高, 16d后无显著影响。藻
细胞培养液中 MC-LR总量不会增大。由此可知, 利用黄花水龙化感物质抑制铜绿微囊藻, 既能有效
控制藻细胞生长又不会促进藻毒素的释放, 生态安全性高, 可应用至实际水体水华处理中。
关键词 黄花水龙; 化感物质; 铜绿微囊藻; 微囊藻毒素; 生长抑制; 产生和释放
中图分类号 Q945 doi: 10.11693/hyhz20130700101
由富营养化引起的水华作为一种全球性环境问
题, 近年来受到人们越来越多的关注(de Figueiredo et
al, 2004), 利用水生植物产生的次生代谢物质(化感
物质)控制藻类水华已成为水环境研究领域的前沿和
热点课题 ( 啟鲜 鸣等, 2005; 胡洪营等, 2006)。这是一
种高效、安全、简便的生物抑藻技术, 具有抑藻作用
强、成本低、材料天然易得、无二次污染等优点。化
感物质通常在自然条件下易降解 , 在生态系统中不
会积累, 对特定的藻类具有显著的抑制作用。因此,
从水生植物中提取化感物质施入水体进行藻类控制
研究具有重要的环境和生态意义。
鉴于多数水华藻种均能产生一定量的藻毒素
(Codd et al, 2005), 因此在利用水生植物化感物质进
行藻类控制研究的过程中 , 化感物质的生态安全性
即其对含毒藻种产生和释放藻毒素的影响规律同样
值得研究和关注。根据Jones等(1994)的研究发现, 在
利用有机鳌合铜类的化学杀藻剂抑制铜绿微囊藻生
长过程中, 水体中的微囊藻毒素(MC-LR)含量明显上
升 , 维持14天后才因微生物的降解作用而被逐渐减
低。因此, 利用化学杀藻剂抑制产毒藻细胞生长极易
产生水质安全隐患 , 而利用水生植物的化感物质进
行藻类水华控制是否会引发同样的安全问题也必须
得到应有的重视和关注 , 但是目前相关方面的研究
十分有限, 仍有待系统、全面地研究。
本试验的研究对象为经作者前期研究(吴湘等 ,
2007)发现的高效脱氮除磷的水生浮叶植物黄花水龙
(Jussiaea stipulacea Ohwi), 它具有适应性强、生物量
大、次生代谢物质丰富等特点, 通过分离提取其中的
化感物质进行藻类控制研究具有良好的应用前景。由
于半数以上的水华藻种都能够产生藻毒素 , 且铜绿
微囊藻又是最为常见的水华优势藻种 (Chen et al,
2004; 王欣伊等, 2005), 因此本试验选用铜绿微囊藻
784 海 洋 与 湖 沼 45卷

(FACHB-905)为受试藻类, 以蓝藻毒素中最为常见、毒
性最大的微囊藻毒素(MC-LR)为代表。通过研究黄花
水龙化感物质对铜绿微囊藻生长的抑制作用 , 确定
其最佳抑藻浓度范围 , 同时阐明黄花水龙化感物质
对铜绿微囊藻藻细胞内外 MC-LR 产生或释放的影响
规律 , 从而为水生植物化感物质在实际抑藻应用时
的有效量化及其生态安全性评价提供一定的科学借
鉴和参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料
黄花水龙采自浙江省湖州市乡村河道 , 采集时
间为 7 月上旬, 选取个体均匀、生长良好的植株, 全
株洗净后于 60°C烘箱干燥 48h, 备用。实验所用铜绿
微囊藻(FACHB-905)购自中国科学院水生生物研究
所淡水藻种库, 实验前使用 BG-11 培养基(李锋民等,
2007)预培养 7—8d, 使之处于对数生长期。
1.2 实验设置与方法
1.2.1 黄花水龙化感物质的提取 称取 20g 黄花
水龙干植物体(粉碎至 50 目), 置于 500mL 锥形瓶中,
加入 400mL 乙酸乙酯, 超声波常温提取 1h。提取结
束后, 用滤纸滤去提取液中的残渣, 并通过 0.22μm
有机系滤膜除去颗粒物的干扰 , 之后利用旋转蒸发
(100r/min, 65°C) 除去溶剂, 获得浸膏并称重, 最后
用二甲基亚砜(DMSO)进行定容溶解, 使得最高浓度
组 DMSO浓度小于 1%, 此浓度对铜绿微囊藻生长无
影响 (洪喻等 , 2008)。浓缩液在无菌条件下 , 通过
0.22μm 无菌有机系滤膜除去微生物, 于 4°C 冰箱保
存备用。
1.2.2 黄花水龙化感物质的抑藻活性检测及最佳抑
藻浓度范围的确定 采用培养液检测法, 通过摇
瓶实验对黄花水龙化感物质进行抑藻活性检测 , 并
确定其最佳抑藻浓度范围。将总体积为 200mL 的藻
类培养混合液(含 5mL处于对数生长期的藻种液、一
定量的经 121°C 高温灭菌 30min 的 BG-11 培养液以
及黄花水龙的化感物质)加入 500mL 锥形瓶中, 其中
黄花水龙化感物质设置为 5 个浓度梯度, 分别为 0、
25、50、75、150mg/L, 每个浓度设 3 个平行。将上
述混合培养液置于温度 25°C, 相对湿度 70%, 光照强
度 50μmol/(m2·s), 光暗比 14h︰10h 的人工气候室中
培养 16d, 每天通过显微镜计数法测定藻细胞密度,
平行计 3次, 结果取均值。最后采用概率单位法拟合
计算黄花水龙化感物质的半效应质量浓度(EC50,7d),
该数值越低, 说明其抑藻效果越好。
1.2.3 黄花水龙化感物质对 MC-LR产生和释放的影
响测定 在 1.2.2 实验的基础上, 分别测定培养对
数期(7d)和稳定期(16d)时胞外培养液和藻细胞中的
MC-LR 含量以及藻细胞密度。采用固相萃取(SPE)联
合高效液相色谱(HPLC)法测定微囊藻毒素MC- LR的
含量。在进行 MC-LR的 HPLC测定前, 先将待测的
铜绿微囊藻培养液参照宋立荣等(1999)方法进行预
处理。
1.3 数据处理方法
根据藻密度计算黄花水龙化感物质对藻细胞的
相对抑制率:
IR(%)=(1–N/N0)×100
其中 IR为相对抑制率, N为加入化感物质组的藻
密度(ind./mL), N0为对照组的藻密度(ind./mL)。采用
概率单位法拟合计算 EC50,7d。所有样品平行测定 3次,
实验结果取其均值。利用 Excel进行数据分析和绘图。
2 结果与讨论
2.1 黄花水龙化感物质对铜绿微囊藻(FACHB-905)
的生长抑制作用及其最佳抑藻浓度范围的确定
黄花水龙化感物质以不同浓度梯度(0、25、50、
75、150mg/L)分别投放到定量的铜绿微囊藻培养液中,
同时进行抑藻效果测定。图 1分别对应各浓度组每天
的藻密度变化及其相对抑制率(IR)。根据图 1a, 在 7d
的培养期内 , 化感物质对铜绿微囊藻的生长抑制作
用随着化感物质浓度的增加而逐渐增强。采用概率单
位法拟合计算求得黄花水龙化感物质的 EC50,7d 值为
47mg/L, 说明黄花水龙化感物质对铜绿微囊藻生长
具有较强的抑制作用。但在培养后期, 各浓度组的抑
制率均呈下降趋势 , 说明化感物质对藻细胞的生长
抑制作用会随着时间延长而逐渐减弱。这可能与化感
物质中有效抑藻成分存在降解或转化作用(洪喻等 ,
2009)有关, 具体机理有待进一步探讨。
图 1b 的结果表明, 不同浓度组的黄花水龙化感
物质对铜绿微囊藻生长的影响作用也不同。其中对照
组(0mg/L)随着时间延长藻细胞数目迅速增加(图 1a);
低浓度组(25mg/L)的化感物质在试验开始 1—2d内对
藻细胞生长反而起促进作用, IR在−6.7%—5.2%之间,
3d 后才逐渐表现出对藻细胞生长的抑制作用, 但是
IR始终低于 25%, 抑藻效果较差。整个培养期内, 除
低浓度组外 , 其余浓度组对铜绿微囊藻均呈现出较
显著的生长抑制作用, 这种低剂量促进、高剂量抑制
和先促进后抑制的趋势, 之前已有相关文献报道(何
池全等, 1999; 刘光涛等, 2011)。
4期 吴 湘等: 黄花水龙化感物质对铜绿微囊藻生长及藻毒素产生和释放的影响 785



图 1 不同浓度的黄花水龙化感物质对铜绿微囊藻藻密度(a)和相对抑制率(b)的影响
Fig.1 Influence of different concentrations of J. stipulacea allelochemicals on the algae density (a), the inhibition ratio (b) of M.
aeruginosa

中浓度组(50mg/L)的黄花水龙化感物质在藻细
胞培养4d时对藻细胞的IR就已达到60%, 但是培养后
期IR下降较快, 藻细胞生长恢复明显。Nakai等(1999)
研究发现 , 在一次性投加大型植物浸提液抑制铜绿
微囊藻生长时, 藻细胞在培养8d后即开始恢复生长,
抑藻作用明显减弱, 这与本研究得到的结果类似。而
较高浓度组(75mg/L)和高浓度组(150mg/L)的黄花水
龙化感物质对铜绿微囊藻的生长抑制变化趋势相类
似, 藻细胞培养3d时IR都已大于85%, 培养后期IR虽
有下降, 但是较其他浓度组缓慢, 化感物质仍发挥较
好的抑藻作用。由此可知, 虽然浓度越高对藻细胞生
长的抑制作用越显著, 但是当浓度达到一定值时, 浓
度增加对提高IR影响不大, 75mg/L和150mg/L的抑藻
效果差异不显著, 出现了阈值效应, 因此从节约原材
料的角度考虑, 75mg/L即可达到最好的抑藻效果。
综上所述 , 黄花水龙化感物质的最佳抑藻浓度
范围应为 50—75mg/L, 铜绿微囊藻在培养 4—7d 内
其相对抑制率可达 50%—95%。化感物质之所以能够
抑制藻细胞生长 , 估计与其能提高藻细胞的呼吸速
率, 降低光合作用速率, 降低叶绿素 a含量有关( 啟鲜
鸣等, 2005)。同时根据李锋民等(2007)的研究报道,
化感物质在较低浓度时可以提高铜绿微囊藻的过氧
化物酶、超氧化物歧化酶和脱氢酶的活性, 而高浓度
的化感物质则显著降低了这些酶的活性。抑制铜绿微
囊藻的抗氧化酶体系并促进藻类叶绿素的降解可能
是化感物质的抑藻机理之一(Qian et al, 2009)。本实验
同样发现, 随着黄花水龙化感物质浓度的增加, 且达
到一定浓度范围后 , 铜绿微囊藻单位藻细胞的叶绿
素 a含量迅速减少, 与藻密度的变化趋势一致, 而叶绿
素 a 含量与光合作用有关, 从另一角度间接反映了化
感物质的投加可以抑制藻类的光合作用 , 且化感物
质浓度的高低与其抑藻活性显著相关。
2.2 黄花水龙化感物质对铜绿微囊藻(FACHB-905)
MC-LR产生和释放的影响
2.2.1 黄花水龙化感物质对MC-LR释放的影响 投
加黄花水龙化感物质 7d后胞外培养液中MC-LR的浓
度参见表 1, 而 16d后培养液中的MC-LR浓度均未被
检出, 因此未列入表 1。从表 1 可以看出, 不论是对
照组(0mg/L), 还是其他浓度组(25—150mg/L), 7d 时
胞外培养液中 MC-LR 浓度都很低, 小于 WHO 推荐
的饮用水体中 MC-LR 的最高限值 1μg/L(Codd et al,
2005); 而藻细胞在培养 16d 后开始进入生长稳定期,
胞外培养液中 MC-LR浓度均低于检测下限。这说明,
在本试验 16d的培养期内, 黄花水龙化感物质的投加
对铜绿微囊藻 MC-LR 的释放无显著影响。即使黄花
水龙化感物质的浓度达到最大值 150mg/L时, 整个培
养期内藻细胞向胞外释放的藻毒素的量还是很少 ,
有时甚至无法检出。
Robilllot 等(2000)研究认为, 无任何外界干扰情
况下的藻细胞在培养前期胞外藻毒素浓度很低 , 可

表1 投加黄花水龙化感物质7d后胞外MC-LR的浓度
Tab.1 Concentrations of extracellular MC-LR after adding J.
stipulacea allelochemicals for 7 days
化感物质投加
浓度(mg/L)
MC-LR浓度(μg/L)
平行样1 平行样2 平行样3
0 ND 0.43 0.50
25 ND 0.33 ND
50 0.45 ND ND
75 0.48 0.42 ND
150 ND 0.36 0.39
ND表示小于检出下限0.3μg/L
786 海 洋 与 湖 沼 45卷

以忽略 ; 进入稳定期前胞外藻毒素浓度都会维持在
较低水平。本试验在藻细胞培养 16d时即进入稳定期,
对照组依然未能检测出胞外 MC-LR, 意味着藻类在
正常环境下向周围水体释放藻毒素的量并不多 , 而
之所以目前存在许多藻毒素污染水体的问题 , 主要
原因还是人们在施加化学杀藻剂时 , 引起死亡藻细
胞内藻毒素的大量释放。有研究发现, 当使用硫酸铜
化学杀藻剂处理铜绿微囊藻水华时, 水体中的 MC-
LR(即胞外 MC-LR)含量明显升高, 严重威胁水域生
态安全(Jones et al, 1994)。而在本试验中, 黄花水龙
化感物质既能有效抑制铜绿微囊藻的生长 , 又不会
引起藻细胞的胞内藻毒素向外释放, 生态安全性高,
因此可将黄花水龙化感物质应用至实际水华水体的
处理中。
2.2.2 黄花水龙化感物质对MC-LR产生的影响 根
据图 2a, 对照组(0mg/L)的单位藻细胞 MC-LR 含量
(用 106单位个数藻细胞内 MC-LR 的质量来表示)与
Wiedner等(2003)的测定结果在同一水平。培养 7d后,
随着黄花水龙化感物质浓度的增加 , 铜绿微囊藻培
养液中单位藻细胞 MC-LR 含量也随之增加, 当化感
物质浓度为 50—150mg/L 时, 单位藻细胞 MC-LR 含
量显著升高。



图 2 不同浓度的黄花水龙化感物质对铜绿微囊藻的胞内 MC-LR含量(a)、MC-LR产生总量(b)的影响
Fig.2 Influence of different concentrations of J. stipulacea allelochemicals on the intracellular MC-LR (a) and total MC-LR (b)
contents in M. aeruginosa
*表示差异显著, P<0.05, **表示差异极显著, P<0.01

培养7d后, 除低浓度组外, 黄花水龙化感物质对
铜绿微囊藻产生了较强的化感抑制作用 , 藻细胞生
长速率明显减缓, 藻密度一直维持在较低水平, 且胞
内MC-LR含量显著升高。由此可知, 为了抵御化感物
质产生的胁迫作用 , 存活下来的藻细胞会合成更多
的藻毒素(Jang et al, 2003)。Kearns等(2000)研究认为,
藻细胞的内部能量一方面用于合成自身生长所需的
营养物质 , 另一方面还可用于抵御外界环境胁迫的
影响 , 例如铜绿微囊藻藻细胞在化感物质的作用下
会将更多的能量用于藻毒素的合成 , 从而导致自身
生长速率变缓。
培养16d后, 黄花水龙化感物质对铜绿微囊藻的
生长抑制作用减弱, 藻细胞开始恢复生长, 此时单位
藻细胞中MC-LR含量的变化受化感物质浓度的影响
不显著。因此可以认为, 培养16d后, 黄花水龙化感物
质对培养液中铜绿微囊藻胞内MC-LR产生的促进作
用减弱, 基本恢复到对照组水平。这可能与之前讨论
中提到的化感物质存在天然降解和转化作用有关。
根据表1所示, 铜绿微囊藻在整个试验期内向胞
外释放的MC-LR含量极少 , 因此可不计入藻细胞
MC-LR产生总量的计算中。单位藻细胞内MC-LR含
量与相应藻密度的乘积即可作为MC-LR产生总量的
结果。图2b的结果表明, 随着黄花水龙化感物质浓度
的增加, 培养7d后藻细胞MC-LR产生总量逐渐降低,
这可能是由于随着化感物质浓度的增加 , 虽然单位
藻细胞内MC-LR的含量会有所升高 , 但是同时藻密
度也在迅速降低 , 因而使得两者结合产生的MC-LR
总量依然呈现下降趋势 , 可见影响MC-LR产生总量
的主要因子应为藻密度测定值。培养16d后, 除最高
浓度组外 , 培养液中MC-LR的产生总量随化感物质
浓度的增加变化不显著 , 和图2a反映的结果一致。
150mg/L处理组在培养7d、16d时MC-LR产生总量都
是所有浓度处理组中最低的 , 这可能是因为化感物
质浓度越大, 有效抑藻成分含量越多, 即使到了16d,
剩余的有效抑藻成分依然较其他浓度组多 , 对藻细
胞生长还能发挥一定的抑制作用 , 从而使得MC-LR
产生总量较其他浓度组要低。因此, 在本实验投加黄
花水龙化感物质抑制铜绿微囊藻生长过程中 , 随着
4期 吴 湘等: 黄花水龙化感物质对铜绿微囊藻生长及藻毒素产生和释放的影响 787

化感物质浓度增加 , 不会使培养液中MC-LR产生的
总量增大。
3 结论
(1) 黄花水龙化感物质对铜绿微囊藻 (FACHB-
905)具有较强的生长抑制作用, EC50,7d值为 47mg/L。培
养 1 周内, 随着黄花水龙化感物质浓度的增加, 其抑
藻效果逐渐增强 , 但是随着时间延长其抑藻效果也
会逐渐减弱。黄花水龙化感物质的最佳抑藻浓度范围
应为 50—75mg/L, 在此浓度下培养 4—7d 对铜绿微
囊藻生长的相对抑制率可达 50%—95%。此浓度范围
可作为黄花水龙化感物质实际抑藻应用时一个有效
剂量的参考值。
(2) 整个培养期间, 黄花水龙化感物质对铜绿微囊
藻MC-LR的胞外释放无显著影响。培养 7d后, 单位藻
细胞内 MC-LR 的含量随化感物质浓度的增加而升高,
16d 后无显著影响。由此可知, 黄花水龙化感物质既能
有效抑制铜绿微囊藻的生长, 又不会引起藻毒素的向
外释放, 生态安全性高, 可应用至实际水体处理中。

致谢 衷心感谢中国科学院水生生物研究所、湖州
市环境保护监测中心站在提供铜绿微囊藻藻种
(FACHB-905), 以及微囊藻毒素(MC-LR)测定方面提
供的一切指导与帮助!
参 考 文 献
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788 海 洋 与 湖 沼 45卷

INFLUENCES OF ALLELOCHEMICAL EXTRACTED FROM JUSSIAEA STIPULACEA
OHWI ON GROWTH, MICROCYSTINS PRODUCTION, AND RELEASE OF
MICROCYSTIS AERUGINOSA
WU Xiang1, WU Hao2, YE Jin-Yun1
(1. Zhejiang Province Key Laboratory of Aquatic Resources Conservation and Development, College of Life Sciences, Huzhou Teachers
College, Huzhou 313000, China; 2. Huzhou Environmental Protection Monitoring Centre Station, Huzhou 313000, China)
Abstract The inhibition of allelochemicals extracted from Jussiaea stipulacea Ohwi on the growth of Microcystis
aeruginosa and the optimal dose range for allelochemicals’ anti-algal effect were investigated, and their impact on
production and release of microcystin-LR (MC-LR) tested. The experimental results indicate that, the allelochemicals had a
significant inhibitory effect on the algae growth and the half-effect concentration was 47mg/L within 7 days of culture.
However, the inhibition declined with the cultivation time. The allelochemicals showed the maximum inhibitory effect on
the algae growth in dose range 50—75mg/L; and the relative inhibitory ratio (IR%) reached 50%—95% in algae cell
cultures in 4—7 days. In addition, the extracted allelochemical compounds demonstrated no significant impact on the
extracellular release of MC-LR during the whole culture period. The amount of intracellular MC-LR per 106 algal cells
increased dependent on the increasing dose of the allelochemicals after 7 days of culture and then stayed after 16 days.
There was no increase in the total amount of MC-LR in the algal cell culture medium. Therefore, applying the
allelochemicals extracted to inhibit M. aeruginosa is a good practice and ecologically safe for treating water in algae bloom.
The treatment can inhibit the proliferation of algal cells effectively without generating cyanotoxin.
Key words Jussiaea stipulacea Ohwi; allelochemical; Microcystis aeruginosa; microcystin-LR; growth
inhibition; ecological safety