全 文 ：荜拔油不皂化物抑制 C57BL/6小鼠胆囊结石的形成
安国顺1 ,王海梅2 ,巴图乌拉2 ,吴京涛2 ,刘绍辉2 ,倪菊华1 ,李月廷2
首都医学发展科研基金(中医药)资助项目(2001年 III-19)
1.北京大学医学部生化与分子生物学系(北京 100083)
2.北京中医药大学附属北京市中西医结合医院
摘要　目的:观察荜拔油不皂化物对实验性 C57BL/ 6小鼠胆囊结石形成的抑制作用。方法:C57BL/ 6鼠 30 只 ,每组 10
只 ,模型周期 4 周 ,对照组喂饲普通饮食;模型组喂含 1%的胆固醇饮食;用药组喂含 1%的胆固醇饮食和荜拔油不皂化物(30
mg/ kg体重)灌胃 。结果:模型组 9 只出现胆囊结石 , 10 只出现胆固醇结晶;荜拔油不皂化物组 1 只出现胆囊结石和结晶;对
照组无结石和结晶形成。与模型组相比 ,荜拔油不皂化物组和对照组的肝氨肽酶 N(APN)mRNA及胆囊胆汁胆固醇饱和指数
(CSI)明显降低。结论:荜拔油不皂化物明显抑制高胆固醇饮食诱发的小鼠胆囊结石的形成 ,可能通过降低肝脏 APN mRNA
水平及胆囊胆汁胆固醇饱和指数发挥作用。
关键词:荜拔油不皂化物;C57BL/6 小鼠;胆囊结石形成;氨肽酶 N
中图分类号:R 657.4+2　　　文献标识码:　A　　　文章编号:1007-6948(2008)03-0235-04
Inhibitory Effect of Oil of Piper Longum Unsaponifiable Matter on Gallstone Formation in Mice　An Guoshun ,
Wang Haimei , Batu Wula , et al.　Department of Biochemistry and Molecular Biology , Beijing University Medical
School ,Beijing(100083), China
Abstract:Objective　To explore the effect of the oil of piper longum unsaponifiablc matter(OPUM)on experimen-
tal gallstone formation in the gallbladder of C57BL/6 mice.　Methods　3 dietary group of C57BL/6 with 10 each were
allocated as control (normal mice chow), lithogenic(l% cholesterol diet)and OPUM(1% cholesterol diet+30 mg/kg
body weight)group respectively for 4 weeks.　Results　Cholesterol crystals and stones were found in 10/10 and 9/10
gallbladder respectivcly in the lithogcnic group , 1/10 gallstone and 1/10 gallstonc crystal respectively in the OPUM
group , but none in thc control group.Comparing with the lithogenic group , the expression of aminopeptidase N(APN)
gene in liver tissue and cholesterol saturation index(CSI)in thc gallbladder bile were significantly decreased in OPUM
and control groups.　Conclusion　OPUM inhibits the experimental gallstone formation induced by high cholesterol feed-
ing in C57BL/6 mice , with simultaneous decreasing of APN gene expression in thc liver tissue and of the CSI values in
the gallbladder bile may be the cause.
Keywords:oil of piper longum unsaponifiable mattcr(OPUM), C57BL/6 mice , gallstone formation , aminopeptidase
N(APN)
　　荜拔为胡椒科植物荜拔的未成熟果穗 ,近年研
究发现 ,其有效成份荜拔油不皂化物(oil of piper
longum unsaponifiable matter , OPUM)显著降低实验性
高脂血症大鼠血中的 S-TC 、升高 HDL-C 的作用 ,
本实验旨在进一步探讨其在 C57BL/6 小鼠胆囊结
石形成的过程中对胆汁中胆固醇含量和肝脏氨肽酶
N表达的影响 ,探讨其可能的作用机制。
1　材料和方法
1.1　实验动物　C57BL/6小鼠(30只),雄性 , 10周
龄 ,由北京大学医学部实验动物中心提供(动物饲养
合格证号:SCHK 京 2006 -2008)。控制光照 12 h
(06:00 AM ～ 18:00 PM),普通饲料饲养 2周。
1.2　实验用药和试剂　荜拔油不皂化物(北京宝泰
宁堂医药科技有限公司提供)胆固醇(北京化学试剂
公司)。
1.3　实验方法
1.3.1　实验分组及模型制备　随机分为 3组 ,对照
组 ,模型组和治疗组 ,每组 10只 。对照组:每日喂普
通颗粒饲料 ,同时给予等量吐温 -80 乳化液灌胃;
模型组:每日喂饲含 15%脂肪 , 1%胆固醇 , 0.5%胆
酸饲料 ,同时给予等量吐温-80乳化液灌胃;治疗
组:每日喂饲 15%脂肪 , 1%胆固醇 , 0.5%胆酸饲
料 ,同时给予吐温-80 乳化的荜拔油不皂化物 30
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mg/kg灌胃 ,实验周期 4周。
1.3.2　标本采集与处理　实验结束前 ,动物禁食
12 h ,3%戊巴比妥(35 mg/kg 体重)麻醉 ,剖腹 ,结扎
胆囊管 ,迅速取肝组织置液氮中冷冻 , -80°C 冰箱
内保存备用。摘取胆囊 ,观察成石情况 ,抽取胆汁 ,
观察结晶形成 ,剩余胆汁经 10 000 r/min高速离心
30 min 后 , 加 1%(v/v)1 mmol/L 苯甲基磺酰氟
(Phenylmethylsulfonyl fluoride , PMSF)和 0.02%叠氮
钠(NaN3)使其在胆汁中的终浓度为 2%(v/v),保存
于-20 ℃备用。
1.3.3　观察指标及方法
1.3.3.1　肝组织 APN mRNA 的 RT-PCR检测
1.3.3.1.1　总 RNA提取　利用 Trizol总 RNA提取
试剂盒(Invitrogen)提取 ,取 50 ～ 100 mg 肝脏 ,加入 1
mL Trizol试剂 ,匀浆后于 4 ℃, 12 000 r/min离心 10
min ,上清液经 1/5 体积氯仿抽提后 ,再以 1/2 体积
异丙醇沉淀 RNA ,沉淀经适量 75%乙醇洗涤后晾
干 ,溶于适量无 RNase水 , -70 ℃保存备用。
1.3.3.1.2　引物设计　根据 C57BL/6鼠 APN基因
的 cDNA 序列设计 PCR引物 ,上游引物:5 -CTC
CTC CAT TAG CAA CAA G-3 ,下游引物:5 -GCA
TAG TCA GCA CCC AGA-3 , PCR产物长度为 145
bp;同时扩增 GAPDH 作为内参 ,其上游引物为:5 -
ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3 , 下游引物为:
5 -TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3 , 其预期片
段长度为 451 bp。所有引物均由北京奥科生物公司
合成 。
1.3.3.1.3　RT -PCR　采用 Reverse Transcription
System试剂盒(Promega)进行 RT-PCR。(1)RT:向
0.5 mL 离心管内依次加入样品总 RNA 2 μl , 25
mmol/L MgCl2 4μl , 10×RT 缓冲液2μl , 10 mmol/L
dNTP Mixture 2 μl , RNA 酶抑制剂 0.5 μl ,AMV 逆转
录酶 15 u ,Oligo(dT)15Primer 0.5μg , RNase Free H2O
至总体积为20μl ,按 42 ℃15 min , 95 ℃5 min ,冰
浴 5 min 条件完成逆转录反应 。(2)PCR:向 PCR管
内依次加入 cDNA模板适量 ,10×RT 缓冲液 2.5 μl ,
10 mmol/L dNTP Mixture 0.5μl ,25 mmol/L MgCl2 3.8
μl ,Taq DNA聚合酶 0.5 μl ,50 μm上下游引物各 0.5
μl , RNase Free H2O适量至总体积为 25μl。扩增APN
的 PCR反应条件为94 ℃预变性 5 min;94 ℃30 s ,
52 ℃30 s ,72 ℃45 s , 35个循环 ,最后于 72℃延伸
10 min。PCR产物用 1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定 ,采
用VDS 凝胶成像系统(Pharmacia)成像并测定 PCR
产物的积分吸光度(IA),APN/GAPDH 代表APN mR-
NA的相对含量 。
1.3.3.2　胆汁成分测定 　胆汁中的总胆固醇 、磷
脂 、胆汁酸应用日本东京第一化学药品株式会社生
产的试剂盒 ,在 HITACHI 7170A型全自动生化分析
仪上测定。胆固醇饱和指数(Cholesterol saturation in-
dex ,CSI)通过Carey 表计算。
1.3.3.3　结石观测　结石判断标准:肉眼观察胆汁
内成形粗大颗粒 ,光镜见致密大团块胆固醇结晶。
结石成分用红外光谱分光光度计定性 。
1.4　统计学分析　数据以均数±标准差表示 ,采用
SPSS 10.0统计软件程序 ,多个样本均数间比较和样
本均数间的多重比较采用单向方差分析 ,多个样本
率比较采用 R×C表资料的χ2 检验 。P<0.05为显
著性差异标准。
2　结果
2.1　成石情况　实验周期内 ,各组动物无死亡 ,生
长良好 ,模型组的成石率为 90%, 100%出现结晶;
治疗组的成石率和结晶形成率均为 10%,对照组无
结石和结晶 ,各组比较:χ2=21.17 , P =0.000 ,模型
组的成石率明显高于其他组 。溴化钾压片红外光谱
结果显示 ,在波长 2 856.5 、2 927.3 、3 383.6 cm-1处 ,
见到胆固醇特征吸收峰 ,未见明显的胆色素吸收峰 ,
证实为胆固醇结石(图 1 ,表 1)。
图 1　模型组胆囊内致密大团块胆固醇结晶(左),结石红外光谱(右)
236 中国中西医结合外科杂志 2008年 6月第 14卷第 3期
表 1　各组动物成石和胆固醇结晶情况
n 成石率(n , %) 结晶形成率(n , %)
对照组 10 0(0)　 0(0)　
模型组 10 9(90)＊ 10(100)＊
治疗组 10 1(10)# 1(10)#
　　注:与模型组比较 , #P <0.05;对与对照组比较 , ＊P <0.05
2.2　胆脂水平　模型组和治疗组胆囊胆汁中的胆
固醇含量均升高 ,与对照组相比 ,差异有显著意义
(P<0.01),治疗组的胆固醇含量明显低于模型组
(P<0.05);模型组和治疗组的胆囊胆汁均为胆固
醇过饱和胆汁(CSI>1),与对照组比较差异显著(P
<0.01),治疗组的胆固醇饱和指数低于模型组(P
<0.05);模型组和治疗组的胆汁酸 、磷脂和总脂的
含量均明显高于对照组(P <0.05),治疗组和模型
组的胆汁酸 、磷脂和总脂的含量差异不大(P >
0.05),见表 2。
表 2　胆囊胆汁中胆脂含量和 CSI 的比较( x±s)
n 总胆固醇(mmol/ L) 磷脂(mmol/L) 胆汁酸(mmol/ L) 总脂(g/ dl) 胆固醇饱和指数
对照组 10 3.03±0.36 17.16±2.14 53.25±14.25 4.06±0.81 0.48±0.06
模型组 10 10.43±0.98＊＊ 40.21±3.82＊ 90.65±11.51＊ 8.27±0.66＊ 1.36±0.15＊＊
治疗组 10 7.86±0.87＊＊# 36.61±3.78＊ 88.97±18.83＊ 7.51±1.13＊ 1.04±0.12＊＊#
　　注:与对照组比较:＊P <0.05 , ＊＊P<0.01;与模型组相比:#P<0.05
2.3　APN mRNA的表达　采用 RT -PCR方法检测
对照组 、模型组和治疗组肝 APN mRNA 的表达 ,以
GAPDH为内参。结果显示:治疗组和对照组肝 APN
mRNA的水平明显低于模型组(P <0.05)(图 2 ,表
3)。
图 2　RT-PCR方法检测肝组织中 APN的表达
A:对照组;B:模型组;C:治疗组:GAPDH 为内参
表 3　肝组织中 APN mRNA 水平比较( x±s)
n 积分吸光度值(IA)
对照组 10 0.354±0.15　
模型组 10 0.861±0.21＊
治疗组 10 0.363±0.13#
　　注:与对照组比较:＊P <0.05;与模型组比较:#P <0.05
3　讨论
胆结石的形成是多因素 ,多步骤的复杂病理生
理过程。胆囊胆固醇结石的形成与胆囊胆汁中胆固
醇过饱和 、胆汁中成核因子的活性异常 、胆道动力学
改变和遗传等因素有关 , C57BL/6小鼠为遗传性胆
结石易感小鼠 ,本实验给 C57BL/6 小鼠喂饲 1%的
高胆固醇饮食4 周后 ,小鼠胆囊胆汁中的胆固醇含
量明显增高 ,模型组 90%出现胆囊结石 , 100%出现
胆固醇结晶;当给小鼠喂饲高胆固醇的同时 ,用荜拔
油不皂化物灌胃 ,结果发现治疗组的胆囊结石的发
生率仅为 10%,胆固醇结晶的出现率亦为 10%,明
显低于模型组(P <0.05)。进一步的分析发现 ,治
疗组胆囊胆汁中的胆固醇含量和胆固醇饱和指数也
明显低于模型组(P <0.05)。胆固醇可通过 2个途
径从肝细胞运往胆道 , 其中一种需依赖细胞骨架/
Golgi体介导;另一条不需细胞骨架/Golgi体 ,而由固
醇载体蛋白2(Sterol carrier protein 2 ,SCP2)直接运输。
我们以前的研究发现[ 1] ,荜拔油不皂化物明显抑制
模型组 C57BL/6小鼠肝 SCP2 mRNA的表达 ,推测治
疗组胆汁胆固醇的含量降低可能与抑制 SCP2 直接
运输过量的胆固醇到胆汁中 ,减少了胆结石形成的
基础条件有关。李东华[ 2]的研究发现 ,茵陈和复方
中药能通过下调 SCP2 mRNA的表达 ,降低胆固醇结
石的发生率 。荜拔油不皂化物的作用是否还与下调
肝脏胆固醇合成限速酶(HMG-CoA 还原酶)的活
性 ,抑制胆固醇的合成 ,或者上调胆汁酸合成的限速
酶(胆固醇 7α-羟化酶)的活性 ,促进胆固醇转化成
胆酸等其它机制有关 ,还有待进一步的研究。
胆汁中的氨肽酶N为分子量为 130 000的非黏
液性糖蛋白 ,体外实验显示有明显促成核活性 ,胆固
醇结石病人胆囊胆汁中的 APN 活性比无石者高 ,在
手术前服用熊脱氧胆酸的胆石病人随着胆固醇饱和
指数的下降 ,其 APN活性也下降;新西兰兔的动物
模型也取得相似的结果[ 3] ;Hussain等[ 4]给大鼠喂饲
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高胆固醇饮食的同时给予胡椒素 ,胡椒素组胆汁中
提取的低分子量蛋白质显示明显的抗成核作用。我
们以前的实验发现[ 5] ,高胆固醇饮食诱发的新西兰
兔胆囊结石形成过程中肝脏APN mRNA与胆汁中氨
肽酶 N活性密切相关 ,服用胡椒碱后 ,二者均降低 。
本实验研究证示荜拔油不皂化物明显降低治疗组
C57BL/6小鼠肝脏 APN mRNA 的水平 ,推测其抑制
成石的作用可能通过降低肝脏 APN mRNA 的表达 ,
减少氨肽酶N 的合成 ,降低氨肽酶 N 的活性有关 。
氨肽酶 N是重要的成核因子 ,在结石的形成中发挥
重要作用 ,中药的作用是通过多靶点 、多途径 、多层
次发挥作用[ 6] ,荜拔油不皂化物降低胆汁中氨肽酶
N的活性是通过抑制酶的活性 ,还是促进其降解或
者其它的机制 ,目前还不清楚 ,深入研究其对胆系氨
肽酶N的作用机制 ,有实际意义。
参考文献:
[ 1]王海梅 ,巴图乌拉 ,王俊峰 , 等.荜拔油不皂化物抑制 C57BL/6 小
鼠胆囊结石的形成[ J] .北京中医 , 2006 , 10(10):630.
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究[ J] .中华肝胆外科杂志 , 2004, 10(11):726.
[ 4] Hussain MS , Chandrasekhara N.Biliary proteins from hepatic bile of rats
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[ 5] 李月廷 ,祝学光.胡椒碱抑制兔胆结石形成的作用和机制[ J] .中
华肝胆外科杂志 , 2003, 9(7):426.
[ 6]左予桐 ,高文远 ,贾　伟 ,等.中药防治胆石症的研究进展[ J] .中
国中药杂志 , 2004 ,29(9):831.
(收稿:2007-09-11　修回:2008-03-11)
(责任编辑　刘洪斌　田在善)
急性胰腺炎大鼠血清 、
腹水对离体胰腺腺泡细胞的损伤
陆新元 ,李永渝 , 李学晋 ,李艳娜 ,李　琨 ,巩　倩
国家自然科学基金资助项目(30570845)
同济大学医学院消化系疾病研究所 ,
病理生理学教研室(上海 200092)
摘要　目的:观察急性胰腺炎(AP)大鼠血清 、腹水对大鼠离体胰腺腺泡细胞的损伤作用 , 探讨 AP细胞钙超载的可能机
制。方法:采用大鼠胰胆管逆行注射 3%去氧胆酸钠复制 AP模型 ,分别在 1 、5、10 h 取动物的血清 、腹水备用。胶原酶法分
离 、培养正常大鼠胰腺腺泡细胞 , 给予 1、5 、10 h AP大鼠血清 、腹水刺激;采用MTT法检测胰腺腺泡细胞的存活率;用荧光染料
Fura-2/AM 负载后 ,给予 1、5、10 h AP大鼠血清 、腹水刺激 ,采用钙离子成像系统 ,观察单个胰腺腺泡细胞游离钙水平的变化。
结果:AP模型复制后 1 h ,血清淀粉酶活性即明显升高 ,同时胰腺组织破坏严重;经 AP腹水 、血清刺激的胰腺腺泡细胞 ,其存
活率降低;胰腺腺泡细胞内游离钙浓度明显升高(P <0.05), 且随 AP 病程时间延长 , AP腹水 、血清的刺激作用越明显。结
论:在 AP 大鼠血清 、腹水刺激下 , 胰腺腺泡细胞存活率下降 , 同时有细胞钙超载发生。
关键词:急性胰腺炎;血清;腹水;胰腺腺泡细胞;钙超载
中图分类号:R 657.5+1　　　文献标识码:　A　　　文章编号:1007-6948(2008)03-0238-05
Injury of Serum or Ascites of Rats with Acute Pancreatitis on Pancreatic Acinar Cells　Lu Xinyuan ,Li Yongyu ,Li
Xuejin , et al.　Dept of Pathophysiology ,Medical School of Tongji University , Shanghai(200092), China
Abstract:Objective　To investigate the injury of thc serum and ascites of rats with acute pancreatitis(AP)on the
free calcium levcl in the pancreatic acinar cells and the possible mechanism.　Methods　The AP animal model was in-
duced by retrograde injection of 3%deoxygenatcd sodium dcoxycholatc into thc pancreatico-biliary duct of SD rats , and
thc serum and ascites were collected from these rats at 1 h , 5 h and 10 h after injection.The pancreatic acinar cells ,
prepared from normal rats by collagenasc method , were stimulated with the AP serum and ascites , respectively.The sur-
vival rate of the pancreatic acinar cells was measured using
MTT method.The intracellular free - calcium change in
pancreatic acinar cells that were previously stimulated by the
AP serum and ascites was detected by using fluorescent dyes
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