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Research Progress on Bio-ethylene

生物乙烯研究进展



全 文 :·综述与专论· 2016, 32(2):38-45
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
乙烯是重要的化工原料,主要用于生产聚乙烯、
环氧乙烯、二氯乙烷等,其生产规模、技术水平和
产量可衡量一个国家的化工工业水平[1]。目前,多
数国家通过石脑油、瓦斯油等裂解制备乙烯。近年,
中国乙烯生产量和自给率不断提高,但仍不及需求
的增长速度,并且,随石油资源的日益枯竭和价格
攀升,乙烯的传统生产成本日益增加,这为生物乙
烯提供了发展契机[2]。
乙烯生物合成以生物质为原料,利用生物体生
长代谢活动,通过直接或间接方法获得乙烯[3,4]。
间接合成以可再生生物质为原料,通过微生物发酵
生成乙醇,催化剂作用于乙醇脱水生成乙烯。间接
合成经多年发展已实现产业化,并有效缓解了能源
紧缺问题,但其存在弊端,如产力低、工艺不合理、
收稿日期 :2015-04-20
基金项目 :国家“863”计划项目(2012AA052103),国家自然科学基金面上项目(41276143),国家科技支撑项目(2013BAD22B00)
作者简介 :孙梦婷,女,硕士,研究方向 :生物化工 ;E-mail :374695153@qq.com
通讯作者 :范晓蕾,女,博士,副研究员,研究方向 :生物化工 ;E-mail :fanxl@qibebt.ac.cn
生物乙烯研究进展
孙梦婷1,2  范晓蕾1  郭荣波1  邱艳玲1  赵晓娴1
(1. 山东省沼气工业化生产与利用工程实验室 中国科学院青岛生物能源与过程研究所生物燃料重点实验室,青岛 266101 ;
2. 中国科学院大学,北京 100049)
摘 要 : 乙烯是世界需求量最大的化工原料,被广泛用于制造塑料制品、纺织品及其他化工产品。目前,最常用的生产乙
烯的方式是通过石油裂解制备乙烯,但其存在生产成本高、环境不友好等弊端,这为生物乙烯的发展带来契机。生物乙烯合成以
CO2 或生物质等可再生能源为原料,具资源节约、环境友好的优势。描述了生物乙烯合成的两种途径──间接和直接合成途径,
着重论述微生物通过乙烯合成酶(EFE)直接合成乙烯的原理,描述了 EFE 的结构、序列及催化机制,列举了数个工程菌异源合
成乙烯的成功案例,提出提高产量的策略,并对微生物制乙烯的发展前景进行展望。
关键词 : 生物乙烯 ;直接合成 ;微生物 ;乙烯合成酶 ;异源表达
DOI :10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.004
Research Progress on Bio-ethylene
SUN Meng-ting1,2 FAN Xiao-lei1 GUO Rong-bo1 QIU Yan-ling1 ZHAO Xiao-xian1
(1. Shandong Industrial Engineering Laboratory of Biogas Production & Utilization,Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology,
Chinese Academy of Sciences,Qingdao 266101 ;2. University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049)
Abstract: Ethylene is the chemical raw material of largest demand in the world, and is widely utilized for producing plastics, textiles
and other chemical products. Currently, the most common method of producing ethylene is steam cracking of fossil oil ;however, there exist
drawbacks of high cost and non-friendly to environment, which bring the opportunity for the development of bio-ethylene. Bio-ethylene is
produced from renewable resources of CO2 and biomass , which contributes to saving resources and protecting environment. In this review,
we introduce two pathways of bio-ethylene production—direct and indirect synthesis. Here we focus on the direct synthesis pathway of
microorganisms via an ethylene forming enzyme(EFE), describing the structure, sequence and catalytic mechanism of EFE, illustrating
several successful cases of engineered heterologous hosts synthetizing ethylene, presenting the strategies for improving yields, and prospecting
the development of producing ethylene by microorganisms.
Key words: bio-ethylene ;direct synthesis ;microorganism ;ethylene forming enzyme ;heterologous expression
2016,32(2) 39孙梦婷等:生物乙烯研究进展
规模小等[5]。直接合成是生物体以有机物或 CO2 为
原料在体内直接合成乙烯,通过生物工程手段将其
引入微生物来生产乙烯,投资小、环境友好、产品
纯度高,是切实可行的新型合成路线[6]。
目前,国内外生物乙烯研究多集中在间接合成
的成本降低和优化生产工艺上,并未足够重视直接
合成。本文在之前研究基础上,综述了生物制乙烯
技术现状,着重论述直接合成法生物学基础和异源
表达案例,并对生物乙烯发展前景进行展望。
1 生物乙烯合成
1.1 生物乙烯间接合成
间接合成起步较早,已具备较成熟的生产工艺
和流程,具体如图 1-A 所示,蔗糖、淀粉和纤维素
等水解生成葡萄糖等还原糖,经微生物糖酵解生成
乙醇,再在催化剂作用下脱水生成乙烯。生物乙醇
来源于玉米、甘蔗、甜高粱和甜菜等作物,由此带
来成本高和粮食安全问题,因此,近年来国内外研
究多集中于降低乙醇制造成本和非粮乙醇方面,将
植物秸秆中的纤维素、半纤维素降解并供给微生物
发酵生产乙醇,成为未来生物乙醇主要生产模式。
目前,间接合成法最成熟的催化剂是活性氧化铝,
其稳定性好、寿命长,但存在反应温度高、进料空速
低等不足,经改良的 HZSM-5、SAPO-34 分子筛类催
化剂及杂多酸催化剂等,性能优于前者,但仍无法
满足商业化需求。因此,开发高性能新型催化剂成
为间接合成法的关键所在。乙醇脱水生成乙烯有绝
热床和等温床两种工艺,均存在转化率低、能耗高
等不足,有待优化。
与石油裂解制乙烯相比,间接合成具以下优点:
(1)原料来源广,为可再生生物质;(2)反应条件温
和 ;(3)工艺流程简单 ;(4)能耗低 ;(5)投资小 ;
(6)环境友好。但其仍存在生物乙醇生产成本高、
生产规模小、催化剂性能有待提高、反应器设计不
合理、生产工艺待优化等劣势[7-9]。
1.2 生物乙烯直接合成
许 多 生 物 体 具 乙 烯 合 成 功 能, 包 括 一 些 植
物、微生物和动物,其分别采取不同的乙烯合成途
径[10-12]。直接合成法将适当的乙烯合成途径通过生
物工程手段引入微生物,使微生物以有机物或 CO2
为原料合成乙烯,与间接合成法相比,其具有显著
优势 :(1)设备少,不需催化剂 ;(2)成本低,原
料来源广 ;(3)能耗低,CO2 排放少,环境友好(光
合自养菌可通过光合作用固定 CO2 转化为乙烯);
(4)产物纯度高,副产物少 ;(5)产率受 O2 和营养
条件影响,生产过程可实现优化控制。
2 生物乙烯直接合成原理
2.1 植物合成乙烯
2.1.1 植物合成乙烯途径 在高等植物中,如图
1-b 所示,乙烯合成前体为甲硫氨酸(Methionine,
Met),关键酶为 ACS(ACC 合酶)和 ACO(ACC 氧
化酶)。反应过程如下 :Met 在 S-腺苷甲硫氨酸合成
酶(S-Adenosylmethionine synthetase,SAMS)作用下
生成 S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM),
ACS 催化 SAM 生成 5- 甲硫基核糖(5-methylthior-
ibose,MTR)和 1- 氨基 -1- 羧基环丙烷(1-aminocy-
clopropane-1-carboxylic acid,ACC),MTR 通 过 甲 硫
氨酸循环参与 Met 再生,ACC 则在 ACO 催化下生成
氰化物并放出乙烯[13]。
2.1.2 植物合成乙烯的调控 植物合成乙烯关键酶
是 ACS 和 ACO。ACS 催化 SAM 转化为 ACC,是限
速步骤。ACS 以磷酸吡哆醛为辅基,由多基因家族
编码,其基因表达和催化活性响应于内外部各种刺
激,乙烯积累可抑制 ACS 基因表达,自身 mRNAs
积累增强 ACS 催化活性。ACO 催化 ACC 生成乙烯,
其需要抗坏血酸和氧作辅助底物,Fe2+ 和 CO2 作辅
助因子,解偶联剂和自由基清除剂能抑制乙烯生成。
ACO 由多基因家族编码,乙烯、Cu2+、NaCl、ACC
等可诱导 ACO 表达[14,15]。Hamilton 等[16] 使用番
茄植株 ACO1 基因转化酿酒酵母后,可将 ACC 转化
为乙烯。乙烯合成还受信号转导通路调节,拟芥南
中存在 5 个乙烯受体 :ETR1、ERS1、ETR2、ERS2
和 EIN4,它们均是乙烯合成的负调控因子[17]。植
物合成乙烯途径调控机制复杂,易受干扰,为产业
化生产带来困难。
2.2 微生物合成乙烯
2.2.1 微生物合成乙烯途径 微生物合成乙烯途径
分为两条 :一是 KMBA 途径,发生在大肠杆菌(E.
coli)、浅白隐球酵母(C. albidus)等细菌中,如图 1-C
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.240
所示,Met 通过转氨作用生成中间产物 2- 酮 -4- 甲基
硫 代 丁 酸(2-keto-4-methylthiobutyric acid,KMBA),
KMBA 被氧化裂解放出乙烯[18]。二是 EFE 途径,
发生在丁香假单胞杆菌(P. syringae)、青霉菌(P.
digitatum)等微生物中,如图 1-D 所示,谷氨酸(Glu)
脱氨生成 α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,AKG),AKG
在乙烯合成酶(ethylene-forming enzyme,EFE)作用
下生成乙烯。由于后者的乙烯合成速率远高于前者,
因此 EFE 途径是微生物直接合成乙烯的研究重点。
残基取代 His 残基,使其在大肠杆菌中表达,分离
纯化 EFE 后进行试管实验,检测其 Km 值、kcat 值及
热稳定性。实验结果表明,His305 和 His335 位点发生
突变的酶,活性分别减少至原活性水平的 40% 和
60%,His189 和 His233 位点发生突变的酶则完全失活,
表明这两个位点在络合铁离子时起关键作用,在
His268 位点突变的酶未完全失活,但活性急剧下降,
表明此位点突变破坏了 EFE 活性部位。除此之外,
EFE 还含有两个保守的氨基酸残基 Asp191 和 Arg277,
对酶催化活性起重要作用[22]。
上述实验将丁香假单胞菌 efe 基因在大肠杆菌
中克隆并表达,观测到乙烯生成,这表明在不同菌
株中,单个 efe 基因是产生乙烯的充分条件,因此,
是否具 efe 基因可确定待测菌株是否具产乙烯能力。
Sato 等[23]分离丁香假单胞菌突变株 P. syringae pv.
phaseolicola PK2(Kudzu 菌株,产乙烯菌株)efe 基
因作引物,对 P. syringae pv. cannabina 和 P. syringae
pv. sasemi 两种菌株基因进行 PCR 扩增,它们的 PCR
产物均包含大小与 efe 基因相似的片段,以 Kudzu 菌
株 efe 基因作 DNA 探针与其 PCR 产物杂交,结果显
示产物中均含 efe 同源基因,据此表明两菌株均具产
乙烯能力。
2.2.3 EFE 催化机制和化学计量分析 对青霉菌和
丁香假单胞菌的 EFE 进行试管实验,测反应化学计
量数,得化学方程式如下 :
3 AKG+3O2 + L-Arg → 2 乙 烯 + 琥 珀 酸 盐 +7
CO2+ 胍 +P5C
反应底物 AKG 和 L-Arg 比例为 3∶1,产物乙
烯、琥珀酸盐和 P5C 比例为 2∶1∶1。EFE 同时催
化两个反应发生,主反应是 2 分子 AKG 被氧化生
成 2 分子乙烯和 6 分子 CO2,副反应是 1 分子 AKG
转化为琥珀酸盐和 CO2 各 1 分子的同时,Arg 转化
为胍类和 P5C。如果 EFE 是可催化两个反应的复合
酶,并且两反应可分离,那么利用工程化手段改造
EFE,使其仅催化主反应,不催化副反应,不生成
副产物,将会大大提高产率和反应物利用率。因此,
关于 EFE 功能结构及催化机制应当深入研究。
2.2.4 EFE 反应与胞内碳流分析 对 EFE 反应所涉
及的新陈代谢通路进行分析,优化反应途径,使反
应产物与底物摩尔比最大化,降低副产物量、能量
Arg+O2
CO2+CH2SH
O2
Glu
α-䞞ᠺҼ䞨
҉✟
҉✟MetSAMS
҉✟
㭇㌆ǃ⏰㊹ㅹ䘈৏㌆≤䀓 ҉䞷TCA ҉✟㝡≤ A
Met
SAM
ACC B
ATP
PPi+Pi
ASC
ACO
O2
CO2+CN
-
MTR
޽⭏ KMBA
Glu
α-䞞ᠺҼ䞨 C D NH3⩕⧰䞨ⴀ+L-Arg+CO2+㛽+P5C
A. 间接合成途径 ;B. 植物体内直接合成途径 ;C. KMBA 途径 ;D. EFE 途径
图 1 生物乙烯间接与直接合成途径
2.2.2 EFE 的发现、结构和 efe 基因 1940 年,Yang
和 Biale 等[19,20] 首 次 报 道 青 霉 菌(P. digitatum)
产乙烯,青霉菌成为首个被鉴定的产乙烯微生物。
自 青 霉 菌 提 纯 EFE, 测 得 EFE 是 相 对 分 子 质 量
为 42 kD 的单体蛋白,在 Fe2+ 和 O2 存在下,催化
AKG 和精氨酸(Arg)生成琥珀酸盐、胍类、吡咯
啉 -5- 羧酸(P5C)、CO2 和乙烯。丁香假单胞菌(P.
syringae)是目前已知的产乙烯效率最高的微生物。
提取丁香假单胞菌的 EFE 进行检测,其相对分子质
量为 42 kD 且为单体蛋白,在 Fe2+、O2、Arg 和 AKG
存在下催化乙烯生成,这与青霉菌中 EFE 性质基本
一致[21]。
实验表明,青霉菌和丁香假单胞菌的 EFE 的
N 端序列不同,但两者具一整段相似保守序列,推
测这段序列是 EFE 催化功能所必需的。EFE 功能域
相对保守,定向诱变丁香假单胞菌 efe 基因,以 Glu
2016,32(2) 41孙梦婷等:生物乙烯研究进展
和辅因子消耗,从而使 EFE 反应有序高效进行成为
可能。
乙烯的碳来源大体可分为 3 类 :一是 CO2 固定,
存在于光合自养型生物中,CO2 被核酮糖 1,5- 二磷
酸加氧酶(Rubisco)固定,通过卡尔文循环进入
EFE 反应,消耗 ATP 和还原剂转换为乙烯 ;二是糖
酵解,己糖在 NAD(P)+ 依赖性的甘油 -3- 磷酸脱
氢酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶等催化下分
解,其中 3 个碳进入 EFE 反应生成乙烯;三是磷酸戊
糖途径,木糖或混合糖通过磷酸戊糖途径进入 EFE
反应产生乙烯,还原产物和碳产量与糖酵解相近。
3 条途径中,CO2 固定途径虽需大量 ATP 和还
原剂,但为碳负过程,另两种途径虽所需辅因子较
少,但代谢过程中存在碳丢失,因此,应当找到有
效策略来挽救丢失的碳原子[24]。
除确定最佳代谢途径外,阻碍途径和竞争途径
也应当被纳入研究范畴,通过流量平衡分析(FBA)
和代谢流分析(MFA)找到影响乙烯产量的因素。
Larsson 等[25]对 efe 基因转化的酿酒酵母进行 FBA,
研究表明添加外源脯氨酸(Pro)、使用 NAD 依赖型
谷氨酸脱氢酶(NAD-GDH)代替 NADH 依赖型谷氨
酸脱氢酶(NADH-GDH)、使用谷氨酸盐代替铵盐作
氮源均可增加乙烯产量。另外,通过改变 O2 量来限
制其呼吸作用,同样会影响乙烯产量。
2.3 动物合成乙烯
哺乳动物可合成少量乙烯,有报道显示,大鼠
肝脏中存在 KMBA 途径合成乙烯。由于动物合成乙
烯量少,其对产业化生产乙烯并无太大价值。
3 生物乙烯异源合成案例
已有研究表明,细菌 efe 基因在大肠杆菌(E.
coli)、 酿 酒 酵 母(Saccharomyces cerevisiae)、 蓝
细 菌 聚 球 藻 属(Synechococcus)、 蓝 细 菌 集 胞 藻 属
(Synechocystis)和木霉(Trichoderma)等菌株中实
现了异源表达,并使转化后的工程菌株获得乙烯合
成能力。
3.1 假单胞菌合成乙烯
目前已知产乙烯微生物中,丁香假单胞菌产量
最高,其中 Kudzu 菌株和丁香假单胞菌大豆致病突
变株(P. syringae pv. glycinea)是研究最多的菌株。
为进一步提高乙烯产量,Ishihara 等[26]构建了高拷
贝数、广谱宿主质粒载体 pMEFE1,其上携带来源
于 Kudzu 菌株的 efe 基因,将 pMEFE1 质粒分别导
入丁香假单胞菌(P. syringae)、恶臭假单胞菌(P.
putida)、 大 肠 杆 菌 JM109 后, 重 组 细 胞 均 具 EFE
合成能力,并且乙烯产量比亲代丁香假单胞菌分别
高出 41 倍、20 倍和 5.3 倍。Wang 等[27] 将丁香假
单胞菌 efe 基因重组至恶臭假单胞菌 KT2440 的 16S
rRNA 位点,PCR 结果显示转化后菌株 DC1、DC2、
DC3 分别具有 3、4 和 5 个 efe 基因拷贝,其乙烯产
量分别为 36.2、47.2、53.8 mg/(h·g),与亲代丁香
假单胞菌 14.7 mg/(h·g)的产量相比大幅增加。将
携带 efe 基因的 pBBR1MCS2 质粒载体转入 DC3 菌
株 以 继 续 增 加 efe 拷 贝 数, 乙 烯 合 成 量 达 到 80.2
mg/(h·g),进一步说明 efe 基因拷贝数与乙烯合成
量呈正相关。对重组菌乙烯合成动力曲线进行分析,
乙烯产量随时间逐渐增高,7 h 达到峰值,之后开始
下降,继续培养至 17 h 添加 0.25% 葡萄糖溶液,产
力比 7 h 时提高 40%,这说明碳源葡萄糖是乙烯合
成的限制性因子。
3.2 大肠杆菌异源合成乙烯
efe 基因最早在大肠杆菌中异源表达。来自丁香
假单胞菌 Kudzu 菌株的 efe 基因被克隆,通过高拷贝
pUC19 载体在大肠杆菌中表达。实验将转化后的大
肠杆菌分别在 25℃和 30℃下培养,结果表明,25℃
下乙烯产量较高,推测 37℃时 EFE 易形成包含体从
而活性降低。另外,将转化后的大肠杆菌在添加外
源底物的试管内反应,测得乙烯生成量为相同条件
下细胞内反应(即底物仅来自于胞内)的 5 倍,这
表明底物利用率与乙烯产量呈正相关。
3.3 酿酒酵母异源合成乙烯
2008 年,Pirkov 等[28] 将 丁 香 假 单 胞 菌 efe 基
因转入酿酒酵母中,使其利用葡萄糖为碳源合成乙
烯, 产 量 达 到(320±90)μg/g 葡 萄 糖。2011 年,
Larsson 等[25]对酿酒酵母乙烯合成进行代谢流分析,
结果表明,使用 NAD-GDH 代替 NADH-GDH 可有效
提高乙烯产量,这是由于谷氨酸脱氢酶(GDH)催
化谷氨酸盐脱氨产生乙烯合成底物 AKG,GDH 分
为 NAD 和 NADP 依赖型两种,NADPH 主要来源于
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.242
磷酸戊糖途径,该途径存在碳丢失,使碳源减少,
AKG 水平下降,从而使乙烯产量减少。实验以半乳
糖替代葡萄糖作碳源,产量急剧下降,说明酵母合
成乙烯的最佳碳源是葡萄糖。除此之外,由于乙烯
合成副产物 P5C 是 Pro 合成的中间体,添加外源脯
Pro 可使 P5C 转而合成 Glu,提高乙烯产量。为确
认影响乙烯产量因素,2013 年,Johansson 等[29]对
酿酒酵母在不同条件下乙烯产量进行测定。分析表
明,O2 量影响乙烯产量,由于 O2 维持细胞呼吸作
用,并重新氧化 NADH 用于乙烯合成,是重要限制
性因子。实验以谷氨酸盐代替铵盐作氮源,乙烯合
成速率大大提高。2014 年,Johansson 等[30]继续对
酵母乙烯合成的氮代谢进行分析,以铵盐、谷氨酸盐、
Arg、谷氨酸盐 /Arg 分别作氮源。结果表明,以谷
氨酸盐作氮源乙烯产量最高,这是由于谷氨酸盐在
GDH 作用下转化为乙烯合成底物 AKG ;以 Arg 作氮
源产量减少,但 Arg 缺陷型突变株完全没有乙烯生
成,表明虽然 Arg 作氮源产量较少,但却是乙烯合
成所必需。因此,高浓度 AKG 和一定数量 Arg 是乙
烯产量最大化所必需。综上可得,利用酵母合成乙烯,
其产量受到碳源、氮源、O2 量、底物浓度、辅因子
NADP 等影响。
3.4 木霉异源合成乙烯
木霉是一种丝状真菌,其内富含丰富的纤维素
酶系,能将纤维素降解为葡萄糖,这意味着,一旦
木霉具乙烯合成能力,便能利用农业废弃物中的纤
维素为碳源生产乙烯。2008 年,Tao 等[31]首次将
丁香假单胞菌 efe 基因转入绿色木霉菌(Trichoderma
viride)中,得到具乙烯合成能力的转化菌株 Y2,速
率达 1 059.7 nL/(L·h)。同样,乙烯产量受碳源和
氮源影响 :以纤维素作碳源,Y2 菌株乙烯合成速
率最高,以羧甲基纤维素钠或乳糖做碳源,产量减
少 ;以蛋白胨作氮源,乙烯产量升高。另外,用包
含小麦秸秆的固体培养基培养 Y2 菌株,可获得较
高乙烯产量。2011 年,Chen 等[32]将丁香假单胞菌
efe 基因转入里氏木霉菌(Trichoderma reesei)中,观
察到乙烯合成量随 efe 表达量增加而增加,以稻草
秸秆为碳源培养转化菌株,乙烯合成量达到 4 012
nL/(L·h)。以上两项研究均表明,efe 基因转化的木
霉菌可利用植物废弃物转化成乙烯,这使乙烯低碳
环保生产成为可能。
3.5 蓝细菌异源合成乙烯
与大肠杆菌、酵母、木霉等产乙稀工程菌株相
比,产乙稀工程蓝细菌具有明显的优势 :第一,乙
烯合成速率较高 ;第二,蓝细菌可通过光合作用
将 CO2 转化为乙烯,将乙烯生产与 CO2 减排有机结
合,真正实现了乙烯的绿色合成 ;第三,可利用海
水培养基对蓝细菌进行培养,培养基廉价易得,资
源友好。因此,我们认为蓝细菌光合产乙稀将是
最具发展前景的生物乙烯生产方式。早在 1997 年,
Sakai 和 Fukuda 等[33] 将丁香假单胞菌 Kudzu 菌株
的 efe 基因转入蓝细菌聚球藻 Synechococcus sp. PCC
7942 中,使其具有产乙烯能力,但随着细胞分裂,
由于质粒 pEXE3 和宿主染色体 psb AI 位点发生同
源重组,efe 基因拷贝数减少,使得菌株乙烯合成
量急剧下降。2003 年,Takahama 等[34]将丁香假单
胞菌 efe 基因直接插入蓝细菌聚球藻 Synechococcus
elongatus PCC 7942 的 psb AI 位点,使转化菌株获得
451 nL/(mL·h·OD730)的乙烯合成能力,但聚球藻
生长和代谢速率随时间减慢,相应乙烯合成量也减
少。2012 年,Ungerer 等[35] 将 Kudzu 菌 株 efe 基 因
修饰后转入蓝细菌集胞藻 Synechocystis sp. PCC 6803
中,EFE 稳定性大幅提高,使菌株能够持续合成乙
烯,最高乙烯合成速率达 5 650 μL/(L·h),并观察
到高达 5.5% 的碳进入乙烯合成途径。代谢途径优化
是提高蓝细菌产乙烯能力的另一重要途径。本研究
单位朱涛等[36]前期研究表明,经过 TCA 循环途径
的修饰和优化,在抑制 α-酮戊二酸脱羧酶(OGDC)
和琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH)表达的同时,将大
肠杆菌中编码 α-酮戊二酸透过酶(KgtP)的基因
导入蓝细菌 phaAB 位点,从而增加细胞内底物 α-
酮戊二酸的量,结合过量表达 EFE,能够大大提高
蓝细菌工程菌株的乙烯合成能力,合成速率达到了
9.7 mL/(L·h)。
4 产物乙烯的分离与纯化
产物分离与纯化是乙烯生产的关键步骤。在传
统石油化工领域,乙烯分离技术有深冷分离法、吸
附分离法、膜分离法、膨胀机法、金属络合分离法
2016,32(2) 43孙梦婷等:生物乙烯研究进展
及联合工艺等。生物制乙烯与石油裂解制乙烯的产
物组分不同,通常,前者的产物中除乙烯外,还存
在 CO2,水蒸气、N2、O2 等,但不存在石油裂解过
程中产生的金属及其他污染物。另外,光合自养产
乙烯微生物通过光合作用产生 O2,乙烯在一定浓度
O2 中具可燃性,这也是分离生物乙烯时必须考虑的
因素[6,27]。因此,在设计生物乙烯分离与纯化工艺
过程中,不仅要运用和借鉴石油裂解制乙烯的分离、
纯化工艺,还要充分考虑生物制乙烯的产物组分和
性质,从而设计出安全、高效的分离与纯化技术。
4.1 深冷分离法
该技术的分离流程包括气体净化系统、压缩冷
却系统和精馏分离系统,具体过程是利用产物混合
气中各组分相对挥发度的差异,低温下将各组分按
工艺要求冷凝下来,再用精馏法将各类产物逐一分
离,从而实现乙烯的分离与纯化。此方法乙烯回收
率较高,可用于大规模生产。
4.2 吸附分离法
该方法利用吸附剂对混合气中各组分的吸附选
择性不同,通过改变压力或温度来实现分离,分为
变压吸附法、变温吸附法和变温变压吸附法。按所
用载体不同,吸附剂分为分子筛类、树脂类、A1203
类、SiO2 类、活性炭类和粘土类等,对于生物乙烯
来讲,开发适用、高效的新型吸附剂是运用此方法
分离乙烯的关键。
4.3 膜分离法
该方法利用混合气各组分在膜中渗透速率的差
异对乙烯进行分离。用于分离乙烯的膜主要有平片
膜和中空纤维膜,膜中金属离子有 Na+、Ag+ 和 Cu2+
等,各组分与膜中离子形成络合物,进行迁移从而
得到分离。目前,膜分离法在乙烯分离中还处于研
究阶段,进一步的研究可根据生物合成乙烯方式与
传统石油生产方式的混合气组分的差异变换膜材料,
有望实现乙烯的高效分离。
4.4 膨胀机法
该法的核心是膨胀制冷技术,利用高压气体通
过膨胀机在近似等熵膨胀的同时输出外功,产生比
节流更大的温降,使混合气中露点较高的组分冷凝,
达到分离乙烯的目的。其优点是能耗小、操作灵活、
对进料要求不太严格,但是膨胀制冷技术在国内尚
未得到解决。
4.5 金属络合分离法
该法采用溶于芳烃溶剂中的一种双金属盐类四
氯化亚铜铝络合物,从混合气中有选择性地络合吸
附乙烯组份,乙烯分子与络合物所形成较弱的键,
可在缓和条件下进行汽提解吸,从而得到纯度较高
的聚合级乙烯。此方法的局限性是络合物的制备难
度较大,且国内目前尚无法掌握其关键技术。
4.6 联合工艺
采用联合工艺会改善分离效果以及经济性,如
变压吸附法与蒸馏联合、变压吸附法与膜分离联合
等,均使乙烯的选择性大大提高[37]。
5 展望
乙烯作为重要化工原料,其产量与国民生产生
活息息相关。随着化石能源枯竭,传统合成成本升
高,且产量已无法满足我国对乙烯的需求,因此降
低生产成本、提高产量、开辟新型合成途径成为乙
烯生产的重点研究方向。微生物合成乙烯具低成本、
低能耗、环境友好、易控制等优势,特别是蓝细菌,
可直接利用太阳能将二氧化碳合成乙烯,显示出极
大的发展潜力,因此我们认为蓝藻乙烯是最具发展
前景的生物乙烯生产方式之一。但受限于包括 EFE
的结构功能关系,以及转基因微生物乙烯合成代谢
机制等在内的许多基础问题仍未清晰,生物乙烯的
直接合成技术仍处于发展的萌芽期,面临产量低、
EFE 不稳定、未实现产业化等问题。因此,对微生
物合成乙烯的研究,依然任重道远。鉴于此,笔者
认为,今后微生物合成乙烯研究重点可集中于以下
几个方面 :第一,EFE 的结构功能关系研究。DNA
改组技术是揭示其结构功能关系及提高催化效率的
有效手段,通过非理性分子设计结合定向筛选,可
赋予 EFE 特殊的结构与功能。第二,代谢通路研究。
通过深入分析来得到各代谢物更为精确的化学计量
关系,利用合成生物学代谢途径改造手段设计出高
产量通路,使乙烯高效合成成为可能。第三,工艺
技术研究。通过培养系统条件优化以及发展低成本
高效率的产物分离技术等,从系统集成上促进微生
物合成乙烯技术体系的发展。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.244
参 考 文 献
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(责任编辑 狄艳红)