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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(4):128-136
收稿日期 ：2015-05-16
基金项目 ：云南省大学生创新训练项目（201411390001）
作者简介 ：张海晨，女，研究方向 ：植物分子生物学 ；E-mail ：1285290757@qq.com
通讯作者 ：张晓东，男，博士，副教授，研究方向 ：植物代谢基因工程 ；E-mail ：zxd95@126.com
滇龙胆 1-脱氧 -D- 木酮糖 5-磷酸合酶基因的克隆与
表达分析
张海晨1  李彩霞1  王元忠2  张晓东1
（1. 玉溪师范学院资源环境学院，玉溪 653100 ；2. 云南省农业科学院药用植物研究所，昆明 650223）
摘 要 ： 旨在克隆滇龙胆 1- 脱氧 -D- 木酮糖 5- 磷酸合酶基因 GrDXS，并进行表达分析。以滇龙胆转录组为基础，采用 RT-
PCR 技术从滇龙胆幼叶克隆 GrDXS 基因，并进行原核表达和组织特异性表达分析。滇龙胆 GrDXS 基因（登录号 ：KJ624995）全长
2 145 bp，编码 714 个氨基酸 ；GrDXS 蛋白相对分子质量 76.75 kD，pI 为 6.93 ；属于 DXS 家族成员，可能定位于叶绿体 ；主要由 α-
螺旋和无规则卷曲构成 ；具有 DXS 蛋白的 4 类保守结构域 ：焦磷酸硫胺素结合折叠域（IPR029061，69-425、366-555、87-268、
315-407、407-558）、类转酮酶嘧啶结合结构域（IPR005475，394-559、394-555）、转酮酶 C 端 / 丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶结
构域 II（IPR009014，568-704，572-704）、转酮酶 C 端结构域（IPR005476，573-696）和 1 个转酮酶结合位点（IPR020826，500-
516）；与长春花 CrDXS 蛋白亲缘关系最近；GrDXS 基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为 100 kD，与预期蛋白大小一
致 ；GrDXS 基因主要在叶中表达。
关键词 ： 滇龙胆 ；1- 脱氧 -D- 木酮糖 5- 磷酸合酶 ；生物信息学 ；表达模式
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.017
Cloning and Expression Analysis of Gene Encoding 1-Deoxy-D-
xylulose 5-Phosphate Synthase in Gentiana rigescens
ZHANG Hai-chen1 LI Cai-xia1 WANG Yuan-zhong2 ZHANG Xiao-dong1
（1. College of Resources and Environment，Yuxi Normal University，Yuxi 653100 ；2. Institute of Medicinal Plants，Yunnan Academy of
Agricultural Sciences，Kunming 650223）
Abstract: The aims of this study are to clone the gene GrDXS encoding 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase from Gentiana
rigescens，and to analyze its expression. Based on the transcriptome of G. rigescens，a GrDXS gene was cloned from young leaves of G. rigescens
by RT-PCR technology，and its prokaryotic and tissue-specific expression were also performed. The GrDXS gene（GenBank accession
number ：KJ624995）had a length of 2 145 bp coding for 714 amino acids，and the relative molecular weight of GrDXS protein was 76.75 kD
with its pI of 6.93. GrDXS protein belonged to the member of DXS superfamily，and may localize in chloroplast，GrDXS protein composed of
mainly random coil（47.06%）and α-helix（34.45%）. Four kinds of conserved domains: Thiamin diphosphate-binding fold（IPR029061，
69-425，366-555，87-268，315-407，407-558），Transketolase-like，pyrimidine-binding domain（IPR005475，394-559，394-555），
Transketolase C-terminal/Pyruvate-ferredoxin oxidoreductase，domain II（IPR009014，568-704，572-704），and Transketolase binding
site（IPR020826，500-516），were all existing in GrDXS protein. GrDXS protein was the closest with CrDXS in Catharanthus roseus. The
recombinant protein of GrDXS gene in Escherichia coli was approximately 100.00 kD（containing GST tag protein 26 kD），which was consistent
with the anticipated size. GrDXS gene was primarily expressed in leaf.
Key words: Gentiana rigescens ；1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase ；bioinformatics ；expression pattern
2016,32(4) 129张海晨等：滇龙胆 1-脱氧 -D- 木酮糖 5-磷酸合酶基因的克隆与表达分析
滇龙胆 Gentiana rigescens Franch. ex Hemsl. 是云
南特色药材，也是 200 多种中药的主要原料［1］。近
年来，随着龙胆需求量逐年递增，导致其野生资源
遭到大肆破坏［1］。为此，2013 年云南省启动了龙胆
草航天育种工程，其主要目标是培育高产、高抗、
高龙胆苦苷含量、适合机械化种植和扩大种植范围
的龙胆草新品种［2］。滇龙胆主要活性成分为龙胆苦
苷，要从根本上解决龙胆药源问题和提高其龙胆苦
苷含量，首先必须探明龙胆苦苷生物合成途径及其
调控机理，为通过现代生物技术手段生产龙胆苦苷
奠定基础。
龙胆苦苷属于裂环环烯醚萜类化合物。在植物
中，裂环环烯醚萜类骨架部分主要是通过质体 2-C-
甲基 -D-赤藓糖醇 -4-磷酸（MEP）途径合成的［3］。
1-脱 氧 -D-木 酮 糖 5-磷 酸 合 酶（1-deoxy-D-xylulose
5-phosphate synthase，EC ：4.1.3.37）是 MEP 途径中
的第一个催化酶，在焦磷酸硫胺素的存在下，能够
将丙酮酸与 D-甘油醛 3-磷酸缩合生成 1-脱氧 -D-木
酮糖 5-磷酸（DXP），同时释放二氧化碳，该反应
依赖于 Mg2+ 或 Mn2+ 等二价阳离子［4-6］。研究表明
DXS 催化丙酮酸的脱羧速率能够被甘油醛 3-磷酸所
加速［7］。采用 LC-MS-MS 方法，通过检测 DXP 的产
生而测定植物粗提取物中 DXS 酶活性的方法已被报
道［8］。目前，1-脱氧 -D-木酮糖 5-磷酸合酶基因已
从水稻［9］、玉米［10］、苜蓿［11］、云杉［12］、沉香［13］、
熊胆草［14］、甜瓜［15］、印度人参［16］等多种植物中分离。
DXS 基因的表达具有组织特异性，并被生物和非生
物因素诱导。在生物诱导剂（100 mg/mL 酵母提取
物）和非生物诱导剂（30 mmol/L Ag+）共同诱导 36 h，
丹参 SmDXS 基因在诱导后其表达量逐渐升高，在
36 h 时表达量达到最高［17］。在葡萄中，VvDXS 基因
与麝香葡萄香味相关联，其表达受染色质状态和不
同发育时期的影响［18］。
在日本，龙胆是重要的鲜切花，其研究主要集
中于花色改良方面［19，20］。在中国，龙胆是重要的
大宗药材，其研究主要集中于种子萌发［21，22］、DNA
条码［23］、育种［2］等方面，尚未对滇龙胆 GrDXS 基
因进行研究。本研究根据滇龙胆转录组中 GrDXS 基
因序列，设计一对特异性引物，通过 RT-PCR 技术
从滇龙胆幼叶中扩增到 GrDXS 基因，并进行序列分
析、原核表达和组织表达特异性分析，以期为滇龙
胆 GrDXS 基因功能和龙胆苦苷生物合成途径的解析
奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
滇龙胆无菌组培苗和盆栽苗均采自于玉溪师
范学院分子生物学实验室，由云南省农业科学院
药用植物研究所金航研究员鉴定为滇龙胆 Gentiana
rigescens Franch. ex Hemsl.。基因克隆所用材料为滇
龙胆无菌苗幼叶，基因组织特异性表达分析所用材
料为盆栽 3 年生滇龙胆的根和叶，采样日期为 2014
年 5 月 17 日。
1.2 方法
1.2.1 叶 片 总 RNA 提 取 及 GrDXS 基 因 ORF 的 克
隆 按照多糖植物组织提取试剂 RNAiso（TaKaRa，
大连）说明书提取滇龙胆幼叶总 RNA ；按照逆转
录试剂盒（TaKaRa，大连）说明书合成 cDNA。根
据原核表达载体 pGEX-4T-1 多克隆酶切位点和滇
龙胆转录组中 GrDXS 基因序列，设计一对特异引
物 GrDXSBamHI-F ：5-GGATCCATGGCAGTTTC
AGGATCTCTC-3（ 下 划 线 为 BamH I 酶 切 位 点 ），
GrDXSXhoI-R ：5-CTCGAGTTACTTAAGCTGAAGAG
CTTCTTTAGG-3（下划线为 Xho I 酶切位点，引物
由上海捷瑞生物工程有限公司合成）。以 cDNA 为
模板进行 PCR 扩增，反应体系为 ：PrimeSTAR Max
Premix（2×）（TaKaRa，大连）25 μL，正反向引物
（10 μmol/L）各 1 μL，cDNA 模板 3 μL，加 ddH2O 补
足 50 μL。PCR 反应条件为 ：98℃变性 10 s，55.4℃
退火 15 s，72℃延伸 10 s，30 循环。PCR 产物经 1.0%
琼脂糖凝胶电泳分离、割胶，使用胶回收试剂盒
（Qiagen，德国）对目的片段进行回收 ；使用 dATP
（TaKaRa，大连）和 Taq DNA Polymerase（天根，北
京）进行加尾，72℃反应 30 min ；加尾产物经 1.0%
琼脂糖凝胶电泳分离、割胶，使用胶回收试剂盒
（Qiagen，德国）对目的片段进行回收，然后将其连
接到 pMD19-T 载体（TaKaRa，大连）。转化大肠杆
菌 DH5α（TaKaRa，大连）后进行蓝白筛选，挑取
12 个白斑摇菌 ；使用碱裂解法提取质粒，经酶切检
测正确后选取 3 个克隆进行测序（上海生工，上海），
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4130
获得重组质粒 pMD19-GrDXS。
1.2.2 GrDXS 基 因 原 核 表 达 载 体 构 建 对 质 粒
pGEX-4T-1（Amersham，瑞典）和 pMD19-GrDXS 分
别进行 BamH I（TaKaRa，大连）和 Xho I（TaKaRa，
大连）双酶切，回收载体片段和目的基因，按摩尔
比 1∶4 进行过夜连接，然后转化大肠杆菌 DH5α 感
受态细胞（TaKaRa，大连），涂布于添加 100 mg/L
氨苄青霉素（TaKaRa，大连）+ IPTG（TaKaRa，大
连）+ X-gal（TaKaRa，大连）的 LB 固体平板，12 h
后挑取克隆 ；摇菌后，提取质粒，经酶切检测正确
后，获得原核表达载体 pGEX-4T-1-GrDXS。
1.2.3 GrDXS 基因的生物信息学分析 使用 NCBI
网站 BLAST 程序进行序列比对，应用 Genetyx 6.1.8
进行翻译，使用 DNAMAN 7 进行多序列比对 ；使用
Clustal X2.1 进行比对，然后使用 MEGA6.0 软件内置
的 NJ 法构建系统进化树，设置 Bootstrap=1 000 ；利
用在线数据库（http://molbiol. edu.ru/eng/scripts/01_11.
html） 进 行 稀 有 密 码 子 分 析。 使 用 ChloroP 服 务
器 v1.1 进行叶绿体转运肽预测 ；Interpro 软件进行
保守结构域预测 ；ProtScale 软件进行疏水性分析 ；
PredictProtein 对二级结构进行预测 ；Swiss-Model 自
动 模 式 对 三 级 结 构 进 行 预 测 ；利 用 ExPASy 中 的
TMHMM 工具预测蛋白的跨膜螺旋区 ；利用在线工
具 WOLF PSORT 预测蛋白的亚细胞定位情况。
1.2.4 GrDXS 基因的原核表达 使用热激法将重组
质粒 pGEX-4T-1-GrDXS 转化大肠杆菌 Rosetta（DE3）
感受态细胞（全式金，北京），挑取单菌落接种于
3 mL 含 100 mg/L 氨苄青霉素的 LB 液体培养基中，
37℃、250 r/min 培 养 12 h。 然 后 以 1∶100 比 例 接
种到无抗生素的 LB 液体培养基中，37℃、250 r/min
培养 3 h（OD600≈0.8），在 37℃、终浓度为 1 mmol/L
IPTG 诱导下进行表达，同时以相同条件的 pGEX-
4T-1 转化菌作对照 ；分别诱导 0、2、4 和 6 h 后，
收 集 菌 液 2 mL。4℃、10 000 r/min 离 心 1 min 集
菌，弃上清，加入 100 μL ddH2O、25 μL 的 5×SDS-
PAGE 上样缓冲液，震荡悬菌，沸水煮 5 min。4℃、
13 000 r/min 离心 5 min。取 20 μL 上清上样，进行
SDS-PAGE（5% 浓缩胶和 12% 分离胶）电泳检测。
4℃、6 000 r/min 离心 10 min，将诱导表达 6 h 的菌
液 50 mL 进行收集，使用 1×PBS 对菌体进行洗涤
1 次。然后加入 5 mL 1×PBS 进行悬菌，使用 JY92-
IIDN 型超声细胞破碎仪（新芝，宁波）进行细胞破碎。
条件为 ：冰浴，超声时间 30 min，工作 3 s，间隔 3
s，能量 30%。4℃、18 000 r/min 离心 30 min，分离
上清和沉淀。使用 SDS-PAGE 检测目的蛋白。
1.2.5 GrDXS 基因的实时定量分析 分别取 3 年生
滇龙胆的根和叶，提取总 RNA，使用 DNase I 处理
除去基因组 DNA。使用反转录试剂盒（TaKaRa，大
连）合成第一链 cDNA。以转录组中 GrGAPDH 基
因（GenBank 登录号 KM061807）作为内参设计引物
GrGAPDH-F（5-AAGGGAGGTGCGAAGAAAGT-3）
和 GrGAPDH-R（5-AAGGAGCAAGACAGTTGGTT-
GT-3），PCR 反 应 条 件 为 ：95℃ 3 min，95℃ 15 s，
60℃ 31 s。根据 GrDXS 基因的 cDNA 序列设计特异
性 引 物 GrDXS-F（5-TGATAGTGATGGCACCTTCT-
GA-3） 和 GrDXS-R（5-TTCTTCCCTTACCAACCTC-
AAA-3）。使用 SuperReal PreMix Plus 试剂盒（天根，
北京）进行 qPCR，PCR 反应条件为 ：95℃ 3 min，
95℃ 15 s，60℃ 31 s。每个反应重复 3 次。反应在
ABI7000 荧光定量 PCR 仪（Applied Biosystems，美国）
上进行扩增，扩增曲线、熔解曲线、标准曲线由定
量 PCR 仪软件自动生成。使用内参基因 GrGAPDH
表达校准后，计算根茎叶中 GrDXS 基因相对表达量。
采用比较 Ct 值的“2- △△ Ct”的方法进行定量数据的
分析处理。
2 结果
2.1 滇龙胆GrDXS基因序列的克隆
以滇龙胆幼叶 cDNA 为模板，使用特异性引物
扩增出约 2 000 bp 的片段（图 1）。通过 TA 克隆获
得重组质粒 pMD19-GrDXS，酶切检测结果表明双酶
切获得的两片段大小之和等于单酶切片段大小，与
预期结果相符。
2.2 GrDXS基因的生物信息学分析
利 用 Genetyx 和 DNAMAN 软 件 对 GrDXS 基 因
cDNA 序 列 进 行 分 析， 结 果 显 示 GrDXS 基 因 ORF
全 长 2 142 bp， 编 码 713 个 氨 基 酸。 值 得 注 意 的
是，本研究中克隆到的 GrDXS 基因与转录组拼接
的 GrDXS 核苷酸序列不完全一致，二者相似性为
99.53%。将该序列上传至 GenBank 数据库，获得登
2016,32(4) 131张海晨等：滇龙胆 1-脱氧 -D- 木酮糖 5-磷酸合酶基因的克隆与表达分析
bp
4500
3000
2000
1200
800
500
200
M 1
M ：DNA Marker III ；1 ：GrDXS 基因扩增结果
图 1 GrDXS 基因的 PCR 扩增
录号 KM974886。
使 用 GenBank 数 据 库 中 的 BLASTp 程 序 对
GrDXS 蛋白进行比对分析，结果表明滇龙胆 GrDXS
与长春花 CrDXS 蛋白序列相似性最高（87.96%），
与高良姜（Alpinia officinarum）AoDXS（AEK69519.1）
蛋 白 相 似 性 稍 低（74.40%）。 利 用 DNAMAN 7 将
GrDXS 蛋白序列与从 NCBI 中挑选的相似性较高的
部分序列进行多序列比对分析，结果（图 2）表明
GrDXS 蛋白与已知蛋白相似性很高。利用 Mega 6.0
将 GrDXS 蛋白序列与已发表文献中相似性较高的序
列进行系统发育分析，结果（图 3）显示，编码滇
龙胆 GrDXS 蛋白与长春花 CrDXS2a 处于同一进化枝，
表明二者亲缘关系较近。
使用 ExPASy ProtParam tool 对 GrDXS 蛋白进行
理化性质分析，结果表明 GrDXS 蛋白单体相对分
子质量为 76.75 kD，pI 为 6.93 ；带正电氨基酸残基
（Arg+Lys）为 74，带负电氨基酸残基（Asp+Glu）为
76。不稳定指数为 35.27，属于稳定蛋白 ；脂肪指数
为 90.90，总平均疏水性（GRAVY）为 -0.072，为亲
水蛋白。GrDXS 蛋白含有 20 种基本氨基酸，其中丙
氨酸含量最高，为 10.40% ；其次是亮氨酸和甘氨酸，
分别为 9.70% 和 9.40% ；色氨酸含量最低，为 0.3%。
利 用 SSpro 方 法 对 GrDXS 蛋 白 进 行 二 级 结 构
分析，结果表明该蛋白二级结构中 α-螺旋（H）占
34.45%，无规则卷曲（C）占 47.06%，延伸带（E）
占 18.49%。 利 用 Swiss-Model Workspace 使 用 自 动
模式预测 GrDXS 蛋白的三级结构，结果如图 4 所
示，该模型是以耐辐射球菌 1-脱氧木酮糖 -5-磷酸
合酶［2o1x.1］为模板，在第 69-705 位氨基酸处建
模，序列相似度为 41.50%，其二聚体配基为 Mg2+
或焦磷酸硫胺素。使用 InterPro 在线工具对 GrDXS
蛋白的保守结构域进行分析，结果表明 GrDXS 蛋
白包含 4 类保守结构域 ：焦磷酸硫胺素结合折叠域
（IPR029061，69-425、366-555、87-268、315-407、
407-558）、类转酮酶嘧啶结合结构域（IPR005475，
394-559、394-555）、 转 酮 酶 C 端 / 丙 酮 酸 铁 氧 还
蛋白氧化还原酶结构域 II（IPR009014，568-704，
572-704）、 转 酮 酶 C 端 结 构 域（IPR005476，573-
696） 和 1 个 转 酮 酶 结 合 位 点（IPR020826，500-
516）。
利 用 SignalP 4.1 服 务 器 分 析 GrDXS 蛋 白， 未
发现信号肽，表明该蛋白为非分泌型蛋白。利用
TMHMM 工具预测 GrDXS 蛋白的跨膜螺旋区，结果
表明 GrDXS 蛋白不含跨膜螺旋区域，为非膜蛋白。
使用 ChloroP 1.1 Server 对 GrDXS 蛋白的叶绿体转运
肽进行预测，结果表明 GrDXS 蛋白含 35 氨基酸组
成的叶绿体转运肽，因此该蛋白定位于叶绿体。
对 GrDXS 基因进行稀有密码子分析，结果表明
GrDXS 基因中稀有密码子仅占 0.84%，且无二联或
三联稀有密码子连续出现的情况，因此可选用大肠
杆菌表达菌 BL21 或 Rosetta（DE3）进行原核表达。
2.3 GrDXS基因原核表达载体的构建
使 用 BamH I 和 Xho I 双 酶 切 质 粒 pGEX-4T-1-
GrDXS，可获得目的片段和载体（图 5），表明 GrDXS
基因已成功插入载体 pGEX-4T-1 中。
2.4 GrDXS基因的原核表达
将 重 组 质 粒 pGEX-4T-1-GrDXS 转 化 大 肠 杆 菌
Rosetta（DE3） 后， 使 用 IPTG 进 行 诱 导 表 达。 在
37℃、终浓度为 1 mmol/L IPTG 下，分别诱导表达 0、
2、4 和 6 h 后，提取细菌总蛋白进行 SDS-PAGE 分
析。结果表明，与对照相比，pGEX-4T-1-GrDXS 转
化菌经 IPTG 诱导后，在相对分子质量约 100 kD（含
GST 蛋白 26 kD）处有 1 条蛋白条带，并且随诱导时
间增加其蛋白含量逐渐增加，表明重组质粒 pGEX-
4T-1-GrDXS 在大肠杆菌 Rosetta（DE3）中成功诱导
表达了 GrDXS 蛋白。当温度为 37℃、诱导时间为 6
h 时，蛋白表达量最大（图 6）。为检测 GrDXS 融合
蛋白的存在形式，对诱导表达 6 h 的菌体进行超声
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4132
黑色 ：相似性为 100% ；粉红色 ：75%≤相似性 <100% ；浅蓝色 ：50%≤相似性 <75%。蛋白 GenBank 登录号 ：长春花 Catharanthus
roseus，CrDXS（CAA09804.2）；杜仲 Eucommia ulmoides，EuDXS（AFU93069.1）；烟草 Nicotiana tabacum，NtDXS（AFM78321.1）；
番茄 Solanum lycopersicum，SlDXS（CAZ66649.1）
图 2 GrDXS 蛋白与其它植物 DXS 蛋白的多序列比对结果
2016,32(4) 133张海晨等：滇龙胆 1-脱氧 -D- 木酮糖 5-磷酸合酶基因的克隆与表达分析
破碎，然后使用 SDS-PAGE 检测，结果（图 7）表
明 GrDXS 蛋白全部以包涵体形式存在。
2.5 GrDXS基因的组织表达分析
取 3 年生滇龙胆的根和叶，通过 qRT-PCR 分析
GrDXS 基因在不同组织中的表达情况。结果（图 8）
表明，GrDXS 基因在叶中表达量远高于其在根中表
达量。
3 讨论
代谢途径中终产物的量取决于该途径的流量，
而流量本身又取决于转换相应中间产物的每个酶反
应步骤的速率［8］。鉴定对代谢通量起重要作用的酶，
将有助于对萜类化合物生物合成调控机制的阐明［8］。
滇龙胆的主要药效成分龙胆苦苷属于裂环环烯醚萜
类，主要通过 MEP 途径合成。在植物中，1-脱氧
所涉及蛋白的 GenBank 登录号为：青蒿 Artemisia annua，AaDXS2（ABK35283.1），AaDXS1（AAD56390.2）；金鱼草 Antirrhinum majus，AmDXS2（AAW28999.1）；
穿心莲 Andrographis paniculata，ApDXS1（AAP14353.1）；白木香 Aquilaria sinensis，AsDXS3（AFU75320.1）；拟南芥 Arabidopsis thaliana，AtDXL1（ACI49774.1），
AtDXS3（At5g11380）；砂仁 Amomum villosum，AvDXS1（ACR02668.1）；白菜 Brassica rapa，BrDXS1（ABE60813.1）；辣椒 Capsicum annuum，CaDXS1（CAA75778.1）；
香 瓜 Cucumis melo，CmDXS2（BAE79547.1）； 长 春 花 Catharanthus roseus，CrDXS2a（CAA09804.2），CrDXS2b（ABI35993.1）； 巴 豆 Croton stellatopilosus，
CsDXS1（BAF75640.1）；耐辐射球菌 Deinococcus radiodurans，DrDXS（NP_295198）；油棕 Elaeis guineensis，EgDXS1（AAS99588.1）；橡胶树 Hevea brasiliensis，
HbDXS1（AAS94123.1），HbDXS2（ABF18929.1）； 海 岛 棉 Gossypium barbadense，GbaDXS1（ABN13970.1）； 银 杏 Ginkgo biloba，GbDXS1（AAS89341.1），
GbDXS2（AAR95699.1）；大豆 Glycine max，GmDXS1（ACO72582.1），GmDXS3（XP_003527796.1）；海巴戟 Morinda citrifolia，McDXS2（AAL32062.1）；欧洲
薄 荷 Mentha piperita，MpDXS2（AAC33513.1）；蒺 藜 苜 蓿 Medicago truncatula，MtDXS1（CAD22530），MtDXS2（CAN89181.1），MtDXS3（XP_003603440.1）；
水仙 Narcissus pseudonarcissus，NpDXS2（CAC08458.1）；烟草 Nicotiana tabacum，NtDXS1（CBA12009.1）；烟草 Narcissus tazetta var. Chinensis，NtDXS2（ADD82535.1）；
水 稻 Oryza sativa Japonica，OsDXS1（NP_001055524.1），OsDXS2（NP_001059086.1）；挪 威 云 杉 Picea abies，PaDXS1（ABS50518），PaDXS2a（ABS50519），
PaDXS2b（ABS50520），PdDXS1（ACC54557.1）；赤松 Pinus densiflora，PdDXS2（ACC54554.1）；越南葛藤 Pueraria montana var. Lobata，PmDXS1（AAQ84169.1）；
小立碗藓 Physcomitrella patens subsp. Patens，PpDXS2（XP_001756357.1）；火炬松 Pinus taeda，PtaDXS2a（ACJ67020.1），PtaDXS1（ACJ67021.1）；杨树 Populus
trichocarpa，PtDXS1（XP_002312717.1），PtDXS3（XP_002308644.1）； 蓖 麻 Ricinus communis，RcDXS1（XP_002516843.1），RcDXS2（XP_002533688.1），
RcDXS3（XP_002514364.1）； 高 粱 Sorghum bicolour，SbDXS3（XP_002437810.1）； 多 毛 番 茄 Solanum habrochaites，ShDXS2（AY687353）； 丹 参 Salvia
miltiorrhiza，SmDXS1（ACF21004.1），SmDXS2（ACQ66107.1）； 番 茄 Solanum lycopersicum，SlDXS1（CAZ66648.1），SlDXS2（CAZ66649.1）； 甜 叶 菊 Stevia
rebaudiana，SrDXS2（AJ429232）；万寿菊 Tagetes erecta，TeDXS2（AAG10432.1）；葡萄 Vitis vinifera，VvDXS1（XP_002271585.1），VvDXS3（XP_002277919.1）；
玉米 Zea mays，ZmDXS1（ACG27905.1），ZmDXS2-2（DAA59892.1），ZmDXS2-1（ABP88135.1）
图 3 GrDXS 蛋白与植物中其它 DXS 蛋白的系统发育分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4134
木酮糖 5-磷酸合酶被认为是 MEP 途径的一个限速
酶［14，24］。因此，滇龙胆中 GrDXS 基因的表达情况
直接或间接影响龙胆苦苷的生物合成。本研究对滇
龙胆 GrDXS 基因进行克隆和生物信息学分析，结果
表明所克隆的 GrDXS 基因 ORF 全长 2 142 bp，编
码 713 个 氨 基 酸，pI 为 6.93， 这 分 别 与 印 度 人 参
WSDXS 蛋白和牛巴贝斯虫 BbDXS 蛋白类似［16，25］；
GrDXS 蛋白具有 DXS 蛋白中 4 类保守结构域 ：焦磷
酸硫胺素结合折叠域、类转酮酶嘧啶结合结构域、
转酮酶 C 端 / 丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶结构域
II、转酮酶 C 端结构域，与长春花 CrDXS 蛋白序列
相似性高达 87.96%，因此所克隆基因为 GrDXS 基因。
在植物中，DXS 基因是以家族形式存在的［26］。
根据系统发育分析、生化特征和基因表达特征，
DXS 蛋白可分为 3 类 ：第 I 类是在绿色组织中组成
型表达，能够为持家代谢物或光合作用代谢物如类
胡萝卜素和叶绿素的合成提供前体 ；第 II 类是在特
定组织中表达，如与菌根共生累积前胡萝卜素的根
或小蠹或真菌感染针叶松树脂道表皮细胞 ；第 III 类
是最近几年才提出的，其功能还未被最终确定［15］。
在本研究中，系统发育分析结果表明 GrDXS 蛋白属
红色 ：α-螺旋 ；黄色 ：β-折叠 ；绿色 ：环
图 4 GrDXS 蛋白二聚体的三维结构预测
bp
4500
3000
2000
1200
800
500
200
M 1 2 3
M：DNA Marker III；1，2：质粒 pGEX-4T-1-GrDXS 的 BamH I 和 Xho I 双酶切、
Xho I 单酶切结果 ；3 ：质粒对照
图 5 质粒 pGEX-4T-1-GrDXS 酶切检测
kD
120
100
80
60
50
M 1 2 3 4 5 6
M ：蛋白 Protein Ruler II ；1-4 ：37℃、IPTG 终浓度为 1 mmol/L 下融合表达
菌 pGEX-4T-1-GrDXS 分别诱导 0、4、2 和 6 h 的总蛋白 ；5，6 ：相同条件下
pGEX-4T-1 空载体转化子分别诱导 0 和 6 h 的总蛋白
图 6 37℃下诱导时间对 GrDXS 蛋白表达量的影响
kD
120
100
80
60
50
40
M 1 2 3
M ：蛋白 Protein Ruler II ；1 ：总蛋白破碎后的上清 ；2 ：总蛋白破碎后的沉淀 ；
3 ：细菌总蛋白
图 7 GrDXS 融合蛋白存在形式的检测
32
24
16
8
0
⴨ሩ㺘䗮/DXS/GAPDH ṩ ਦ
以根为参照，设定其中的表达量为 1
图 8 GrDXS 基因在根和叶中的相对表达
2016,32(4) 135张海晨等：滇龙胆 1-脱氧 -D- 木酮糖 5-磷酸合酶基因的克隆与表达分析
于第 II 类 DXS 蛋白，由于其又包含 35 个氨基酸的
叶绿体转运肽，推测其在叶绿体中参与 MEP 途径。
DXS 基因的表达具有组织和时空特异性，并与
萜类的生物合成相关联。在熊胆草中，CbDXS 基因
的表达水平与其药效成分二萜苦蒿素的浓度高度相
关［14］， 而 在 拟 南 芥 中 AtDXS 能 够 通 过 MEP 途 径
控制二氧化碳的代谢流量［6］。在烟草中，过表达
SlDXS 和香叶基焦磷酸合成酶基因 NtGPPS2 导致二
萜产量加倍［27］。在滇龙胆中，龙胆苦苷是在植物绿
色组织（叶和茎）合成，然后通过茎转运到根中进
行储藏的［28］。对滇龙胆 GrDXS 基因组织表达特异
性检测结果表明，GrDXS 基因在叶中的表达量远远
高于根，这与上述报道相一致。
本研究为滇龙胆 GrDXS 基因功能的解析奠定基
础。下一步将对 GrDXS 蛋白进行纯化和多克隆抗体
制备、通过过表达或互补实验研究 GrDXS 基因的功
能，为龙胆苦苷生物合成途径的阐明奠定基础。
4 结论
本研究成功克隆滇龙胆 GrDXS 基因，并可表达
出 gst-DXS 蛋白，且该基因在叶中表达量远远高于
根中。
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（责任编辑 马鑫）