全 文 ：第 34卷 第 6期 生 态 科 学 34(6): 4247
2015 年 11 月 Ecological Science Nov. 2015

收稿日期: 2015-04-21; 修订日期: 2015-05-11
基金项目: 广东省海洋经济创新发展区域示范专项(GD2012-D01-002); 国家自然科学基金项目(21407030)
作者简介: 陈进林(1981—), 男, 从事生态毒理与环境安全评价研究, E-mail: timothy8922@sina.com
*通信作者: 曾国驱, 男, 博士, 研究员, 主要从事生态毒理与环境安全评价, E-mail: zengguoqu@163.com

陈进林, 梅承芳, 高亮, 等. 标准化测试中不同食物浓度对大型溞生长和繁殖的影响[J]. 生态科学, 2015, 34(6): 4247.
CHEN Jinlin, MEI Chengfang, GAO Liang, et al. Effect of food concentration on the growth and reproduction of Daphnia magna in a
standard test[J]. Ecological Science, 2015, 34(6): 4247.

标准化测试中不同食物浓度对大型溞生长和繁殖的
影响
陈进林 1, 2, 3, 梅承芳 1, 2, 3, 高亮 1, 2, 3, 梁笑婷 1, 2, 3, 林振姗 1, 2, 3,
曾国驱 1, 2, 3, *, 许玫英 1, 2, 3, 孙国萍 1, 2, 3
1. 广东省微生物分析检测中心, 生态毒理与环境安全实验室, 广州 510070
2. 广东省微生物研究所, 广东省菌种保藏与应用重点实验室, 广州 510070
3. 省部共建华南应用微生物国家重点实验室, 广州 510070

【摘要】 在标准化的大型溞繁殖试验中探讨食物浓度的合适表征指标和研究不同食物浓度对大型溞生长和繁殖的影响。
结果表明: 分别采用细胞计数法、光密度法和总有机碳分析法测定的斜生栅藻液细胞数量、吸光度和总有机碳浓度三者
两两之间的线性方程相关系数 r 均大于 0.917(P<0.01), 线性相关性显著, 三个指标有明显的可比性。从操作的角度考虑,
光密度法最为简便, 然而为体现不同种类食物提供的能量水平差异, 以总有机碳浓度表征食物的浓度最为合适。幼溞的
数量是反映亲溞繁殖能力的主要指标, 设置的 0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 和 0.30 mg C·(溞·d)–1 食物浓度组所产幼溞数
量的平均值和标准差分别为 33、6810、11816、16415、20522 和 23120, 表明随着食物浓度的增加, 亲溞繁殖幼
溞的数量也相应增加, 且在不同食物浓度组之间均存在显著性的差异(P<0.05)。当喂食浓度达到 0.05 mg C·(溞·d)–1 时, 亲
溞繁殖幼溞数量的平均值即能达到 60 只(大型溞繁殖试验的质量控制要求之一), 因此, 对于易吸附于藻细胞或被藻细胞
降解的化学物质, 大型溞繁殖试验中可调整食物浓度为 0.05—0.1 mg C·(溞·d)–1, 有利于受试物暴露浓度的维持。

关键词：大型溞; 斜生栅藻; 食物浓度; 生长; 繁殖
doi:10.14108/j.cnki.1008-8873.2015.06.007 中图分类号：X171.5 文献标识码：A 文章编号：1008-8873(2015)06-042-06
Effect of food concentration on the growth and reproduction of Daphnia
magna in a standard test
CHEN Jinlin1, 2, 3, MEI Chengfang1, 2, 3, GAO Liang1, 2, 3, LIANG Xiaoting1, 2, 3, LIN Zhenshan1, 2, 3,
ZENG Guoqu1, 2, 3, *, XU Meiying1, 2, 3, SUN Guoping1, 2, 3
1. Guangdong Detection Center of Microbiology, Laboratory of Ecotoxicity and Environmental Safety, Guangzhou 510070,
China
2. Guangdong Institute of Microbiology, Guangdong Province Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application,
Guangzhou 510070, China
3. State Key Laboratory of Applied Microbiology, South China, Guangzhou 510070, China
Abstract: Characteristic index for food (alga) concentration and the reproduction of Daphnia magna under different food
concentrations in a standardization test were analyzed. The results indicated that all of the correlation coefficients r with
6 期 陈进林, 等. 标准化测试中不同食物浓度对大型溞生长和繁殖的影响 43
paired comparison test within cell number, optical density and TOC of algal suspension were > 0.917 (P < 0.01), and the
three indexes were significantly comparable based on the linear relationship. Optical density method is more efficient in
testing than the two other methods, while TOC determination is the best characteristic index for describing the difference in
energy level supplied by different food. The number of offspring is an important parameter for the reproductive performance
of parent. Number of offspring (mean ± SD) in the groups of 0.01, 0.05, 0.10, 0.15, 0.20 and 0.30 mg C·(Daphnia·d)–1 were
3±2, 68±10, 118±16, 164±15, 205±22 and 231±20, respectively. Their offsprings increased significantly (P < 0.05) with
increasing food concentration among different groups. When the food concentration reached to 0.05 mg C·(Daphnia·d)–1, the
mean of offspring number was above 60 (one of the test validity requirements in Daphnia magna reproduction test).
Therefore, if the Daphnia magna reproduction test is performed on the chemical substances to be absorbed or biodegraded by
the alga cell, the food concentration can be decreased to the range from 0.05 to 0.1 mg C·(Daphnia·d)–1, which is good to
maintain the exposure concentration stable during the test processes.
Key words: Daphnia magna; Scenedesmus obliquus; food concentration; growth; reproduction
1 前言
大型溞(Daphnia magna)属节肢动物门(Arthropoda)、
甲壳动物纲(Crustacea), 在世界范围分布广泛[1], 处
在水生生态系统食物链的第二级 (初级消费者 ),
具有重要的生态学地位。大型溞体形小、易于实
验操作和繁殖、全年可获得, 主要以孤雌生殖方式
进行繁殖 , 易于得到基因型一致的单克隆个体 ,
对有毒物质敏感性高 [2], 被作为标准测试生物广
泛应用于有毒物质在生态毒理学上的急性和慢性
毒性研究[3]。
标准化的大型溞繁殖试验测试结果是欧盟
REACH(Registration, Evaluation, Authorization, and
Restriction of Chemicals)法规中产量超过10 吨·年 1
的化学品必需提供的慢性毒性数据, 也是我国新化
学物质注册登记中二级及以上申报应提交的慢性毒
性数据。经济合作与发展组织 (Organization for
Economic Co–operation and Development, OECD)经
过一系列的对比试验, 在1998年更新的化学品测试
指南-大型溞繁殖试验导则(OECD 211)中推荐使用
经过基因型鉴定的大型溞品系 (如来源于法国
IRCHA的品系A)作为受试生物 , 且要求在0.1—
0.2 mg C·(溞·d)–1的食物浓度下, 需满足试验期间空
白对照组存活亲溞所产幼溞的平均值不少于60只的
质量控制要求[4]。上述内容, 尽管经过2008年至2012
年的多次改版更新也一直维持不变[5–6]。
为大型溞提供碳源的食物通常为淡水藻类细
胞, 如小球藻(Chlorella sp.)、羊角月牙藻(Selenatrum
capricornutum)和栅藻(Scenedesums subspicatus)[6–7]。
食物浓度是影响溞类繁殖的重要因素之一[8–9], 在适
当的食物浓度范围内, 提供的食物浓度越高亲溞产
幼溞的数量就越多[8, 10], 更容易满足空白对照组亲
溞所产幼溞数量的质控要求。但是在化学品测试中,
藻细胞可吸附某些化学物质甚至对化学物质具有降
解性[11–16], 过高的食物浓度将导致受试物暴露浓度
下降, 无法在试验期间维持稳定。此外, 高浓度的食
物也会使试验溶液变得浑浊、减少了亲溞的活动空
间, 可能会影响亲溞的生长和繁殖。本研究以分离
自中国本土水生环境的大型溞作为受试生物, 通过
设计一组不同食物浓度水平的试验, 考察不同食物
浓度组中大型溞的生长和繁殖情况, 并将其与质控
要求进行对比, 对标准推荐的食物浓度范围进行验
证和优化。
过去, 国内外大型溞繁殖的相关研究中大多以
细胞数量·mL–1表示食物浓度[17–21], 而OECD、ISO和
国内的化学品测试方法[6, 22–23]中, 大型溞繁殖试验
均要求以mg C·(溞·d)–1来表示食物浓度。因此, 为了
提高来自不同地区和实验室的研究数据的可比性,
提高风险评估时数据的可利用性, 本研究对国内广
泛采用作食物的斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)液
的细胞数量、吸光度和总有机碳(TOC)浓度之间的相
互关系也作出有意义的探讨。
2 材料和方法
2.1 供试生物
大型溞(Daphnia magna), 引自沈阳化工研究院
安全评价中心, 分离于国内的水生环境。大型溞在
实验室进行长期的培养和繁殖, 试验前, 在试验条
件下驯养了 3 代以上。驯养过程中, 采用 Elendt M4
培养基, 每周更换 3 次, 并投以浓缩的斜生栅藻液
作为食物。选择出生小于 24 h 的幼溞作为试验的亲
溞用于试验。
44 生 态 科 学 34 卷
2.2 食物
斜生栅藻(Scenedesmus obliquus), 购自中国科
学院野生生物种质库——淡水藻种库。在经过灭菌
的 OECD 201 培养基[11]中接入斜生栅藻种, 在 23 ±℃
2 ℃、约 5000 lx 连续光照的条件下培养, 收集处
于对数生长期或稳定期的藻液, 经过 8000 r·min–1
离心 5 min, 收集藻细胞, 再用去离子水悬浮, 定量
投喂于大型溞驯养容器中。
2.3 试验用水
试验用水为 OECD、ISO 和国内的化学品测试
方法[6, 22–23]推荐的 Elendt M4 培养基。pH 值范围在
7.59—8.65 之间、总硬度(以 CaCO3 计)范围在 220—
270 mg·L–1 之间、溶解氧浓度范围在 9.0—9.7 mg·L–1
之间。
2.4 试验条件
温度: 20 ±1℃ ; ℃ 光照周期: 16 h光照/8 h黑暗;
光照强度: 600 lx—1200 lx; 承载量为 1 只亲溞·80 mL
培养基–1。
2.5 藻液中细胞数量、吸光值与总有机碳(TOC)的
测定方法
离心收集获得的藻细胞, 加入去离子水悬浮和
洗涤 2—3 次, 最后加入适量的去离子水悬浮得到藻
细胞浓缩液。
用去离子水稀释藻细胞浓缩液, 得到 5 个不同
稀释倍数的藻细胞稀释液, 标记为 1—5。以去离子
水调零, 采用 T6 紫外–可见分光光度计测定各样品
在波长 440 nm 下的吸光值和采用 Liqui TOCⅡ型
总有机碳/总氮分析仪测定各样品的 TOC 浓度, 同
时, 在光学显微镜下对各样品中藻细胞的数量进
行计数。
2.6 大型溞繁殖试验方法
依据 OECD、ISO 和国内的化学品测试方法的
大型溞繁殖试验方法[6, 22–23], 试验设置 6 个食物浓
度组, 分别为 T1 0.01 mg C·(溞·d)–1、T2 0.05 mg
C·(溞·d)–1、T3 0.10 mg C·(溞·d)–1、T4 0.15 mg C·(溞·d) –1、
T5 0.20 mg C·(溞·d)–1和 T6 0.30 mg C·(溞·d)–1。每个
食物浓度组设置 10 个平行(容器), 每个平行含 1 只
亲溞和 80 mL Elendt M4 培养基。
试验期间, 各食物浓度组每天投喂相应浓度的
藻细胞浓缩液, 每 2 天更新一次 Elendt M4 培养基。
试验期间, 每天观察亲溞的外观和存活情况,
及时移除产生的幼溞并计算存活幼溞的数量, 记
录亲溞的死亡率、所产幼溞的数量、初次生殖时
间和总生殖胎数。试验结束时, 测定所有存活亲溞
的体长。
2.7 数据处理
采用 Office Excel 2007 软件进行线性回归的分
析。采用 SPSS 16.0 软件进行单因素方差分析和多
重比较(LSD 法), 统计显著水平设定为 P<0.05。
3 结果
3.1 藻液细胞数量、吸光度与总有机碳(TOC)浓度
之间的线性关系分析
结果见表 1 和表 2。各线性方程的相关系数 r
均大于 0.917(P<0.01), 说明采用细胞计数法、光密
度法和总有机碳分析法测定的藻液细胞数量、吸光
度和总有机碳浓度之间的线性相关性极显著, 三种
测定结果有明显的可比性。
3.2 大型溞繁殖试验结果
3.2.1 亲溞的死亡率
试验结果见表 3。各组亲溞的死亡率均满足
≤20%的试验有效性要求。经过 Cochran–Armitage
表 1 藻液细胞数量、吸光值与总有机碳(TOC)浓度的测
定值
Tab. 1 Measurements of cell number, optical density and
total organic carbon content of algal suspension
样品编号 藻细胞数量/(104·mL–1) 吸光度 A
总有机碳浓度
/(mg·L–1)
1 0.718 0.047 1.70
2 4.49 0.105 2.90
3 14.8 0.203 7.20
4 27.7 0.425 13.2
5 61.5 0.825 27.5
表 2 藻液细胞数量、吸光度与总有机碳(TOC)浓度之间的
线性方程
Tab. 2 Linear relationship between cell number, optical
density and total organic carbon content of algal suspensions
X 和 Y 变量 线性方程 相关系数
吸光度 A(X)与
细胞数量(Y) Y=87.415X – 3.4212 r = 0.999
吸光度 A(X)与
有机碳(TOC)浓度(Y) Y = 23.038X + 0.942 r = 0.997
细胞数量(X)与
有机碳(TOC)浓度(Y) Y = 0.2638X + 1.8383 r = 0.998
6 期 陈进林, 等. 标准化测试中不同食物浓度对大型溞生长和繁殖的影响 45
表 3 大型溞繁殖试验(22d)各项观察指标结果汇总
Tab. 3 Summary of observation parameters in Daphnia magna reproduction test for 22 days
组别 食物浓度/ [mg C·(溞·d)–1]
亲溞
死亡率/%
初次
生殖时间/d*
总生殖
胎数/胎*
平均
幼溞数量/只*
变异
系数/% 幼溞总数/只
存活亲溞
体长/mm*
T1 0.01 10 17.4±0.6 a 0.8±0.5 a 3±3 a 74.9 28 2.65±0.11 a
T2 0.05 0 8.1±0.3 b 4.8±0.5 b 68±10 b 13.8 667 3.22±0.11 b
T3 0.10 0 8.0±0.0 b 5.0±0.0 b 118±16 c 13.0 1178 3.68±0.08 c
T4 0.15 0 8.0±0.0 b 5.0±0.0 b 164±15 d 8.7 1640 4.07±0.06 d
T5 0.20 20 8.0±0.0 b 5.0±0.0 b 206±22 e 10.5 1643 4.26±0.26 e
T6 0.30 0 8.0±0.0 b 5.0±0.0 b 232±20 f 8.4 2314 4.33±0.18 e
注: *列内数据为平均值±标准差; 同一列内具有相同上标字母表示数据之间差异不显著(p>0.05)。

趋势检验, 结果显示, 各组的亲溞死亡率不遵循浓
度–效应模型, 也就是说在 0.01—0.30 mg C·(溞·d)–1
的食物浓度范围对亲溞的死亡并无造成显著影响[6]。
可判断 T1和 T5组的亲溞死亡为偶然因素引起的, 因
此, 在亲溞所产存活幼溞数量的结果分析中排除死
亡亲溞所产的幼溞数[6]。
3.2.2 存活亲溞的体长
试验结果见表 3 和图 1。经方差分析和多重比
较(LSD 法), 表明除了 T5与 T6组之间存活亲溞体长
的平均值无显著性差异(P>0.05)之外, 其余各组之
间存活亲溞体长的平均值均存在显著性差异
(P<0.05)。说明食物的浓度也可显著地影响大型溞的
体长增长。
3.2.3 亲溞所产幼溞的数量
试验结果见表 3 和图 2。试验期间, 各组亲溞所
产幼溞都没有出现死亡的现象。经方差分析和多重
比较(LSD法), 结果表明, 各组所产幼溞的数量之间
均存在显著性差异(P<0.05)。说明在本研究的食物浓

图 1 试验结束时各食物浓度组存活亲溞的体长
Fig. 1 The body length of living parent in different test
groups at the end of the test

图 2 试验结束时各食物浓度组所产存活幼溞的数量
Fig. 2 The mean of the number of living offspring in
different test groups at the end of the test
度范围内, 随着食物浓度的增加, 亲溞繁殖幼溞的
数量也相应增加。当喂食浓度达到 0.05 mg C·(溞·d)–1
时, 亲溞繁殖幼溞数量的平均值即能达到大于 60 只。
另外, 除了 T1 组, 其它组亲溞所产幼溞数量的
平均值的变异系数范围为 8.4%—13.8%, 均小于
25%, 说明整个试验体系的运行良好[6, 23]。
3.2.4 亲溞的体色、初次生殖时间和总生殖胎数
试验结果见表 3。
为了让低食物浓度组(如 T2)亲溞的总繁殖胎数
尽可能达到 5 胎, 试验延长了 1 天, 总试验天数为
22 天。
试验期间, T1组亲溞体色变白, 生长缓慢, 怀卵
量少或不怀卵, 表明食物严重缺乏导致大型溞的代
谢、生长和生殖异常[24–25], 而 T2–6 组亲溞的体色均
正常。同时, T1 组亲溞的初次生殖时间和总生殖胎数
与 T2–6 组相比存在显著性差异(P<0.05), 但是, T2–6
组亲溞的初次生殖时间和总生殖胎数之间无显著性
46 生 态 科 学 34 卷
差异(P>0.05)。说明当食物浓度低于 0.05 mg C·(溞·d)–1
可能会显著延迟大型溞的生殖时间间隔[24]。
4 讨论
4.1 食物浓度的合适表征指标和定量分析方法
基于生态系统的能量流动理论[26], 在大型溞繁
殖试验体系中, 大型溞的繁殖能力与试验体系中的
能量输入直接相关, 也就是说食物提供的能量决定
了大型溞的繁殖能力。细胞计数法是藻类生物量的
基本测定方法, 是确定其它测定方法是否有效的依
据[27–28]。但是, 不同藻种的细胞大小不同, 营养组成
和含量也会存在差异[29], 因此, 细胞数量并不能准
确表征不同种类食物的能量差异[30]。藻液的总有机
碳浓度被认为是表征藻液能量水平差异的合适指
标[7, 30]。
藻液的总有机碳浓度测定需要较高的成本和消
耗较长的时间。在本研究中, 斜生栅藻液不同稀释
倍数的稀释液中的细胞数量、吸光度和总有机碳浓
度三者两两之间的线性方程具有良好的线性相关性,
表明可用细胞计数法和光密度法准确、间接地测定
藻液的总有机碳浓度。但是, 细胞计数法易受人为
因素的影响, 且在细胞密度过低或过高时误差较
大 , 相比较而言 , 光密度法比细胞计数法更为简
便、准确和高效, 这与孙欣、黄美玲研究的结论是
一致的[27–28]。另外, 由于不同藻种的细胞形状、大
小不同, 营养组成和含量也会存在差异 [29], 因此,
不同藻液的细胞数量或吸光度与总有机碳浓度的线
性方程也应该会不同[30]。
根据本研究中斜生栅藻的细胞数量与总有机碳
浓度之间的线性方程, 可以比较同样以斜生栅藻为
食物的大型溞慢性毒性研究之间由于食物浓度的不
同而带来的差异。如熊勤犁等以每天投放浓度为
90000 个·mL–1 的斜生栅藻[以方程 Y = 0.2638X +
1.8383 计算, 相当于 0.33 mg C·(溞·d)–1的食物浓度]
研究大型溞的慢性毒性, 空白对照组每只亲溞产幼
溞数量的平均值和标准差为 161±19[31], 与本研究结
果存在有一定的差异, 可能与试验条件不完全相同
或者采用的溞种基因型存在差异相关[32]。
4.2 食物浓度与大型溞的生长和繁殖的关系
4.2.1 不同食物浓度对大型溞体长的影响
本研究表明, 随着食物浓度的增加, 大型溞的
体长也相应地增长[24–25]。但是, 当食物物浓度达到
0.2 mg C·(溞·d)–1 时, 大型溞的体长就基本达到最大
值 4.26 mm 左右, 此时, 即使再提高食物浓度也不
会使其体长显著增长。此结果, 与罗晓霞和刘正文
研究的在同一个 100 mL 试验体系中以食物浓度范
围为 0.25—20 mg C·L–1【相当于 0.0025—0.20 mg
C·(溞·d)–1】饲养 10 只对拟同形溞(Daphnia similoides)
得到的体长变化结果[24]是一致的。
4.2.2 不同食物浓度对大型溞繁殖的影响
幼溞的数量是反映亲溞繁殖能力的主要指标[6–7]。
在本研究中, 0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 和 0.30 mg
C·(溞·d)–1 食物浓度组所产幼溞数量的平均值和标准
差分别为 3±3、68±10、118±16、164±15、205±22
和 231±20, 统计学分析结果表明各食物浓度组所产
幼溞数量的平均值之间均存在显著性差异(P<0.05),
表明食物浓度越高, 大型溞生殖幼溞的数量就越
多[8, 10]。罗晓霞和刘正文的研究表明食物浓度过高
或过低均不利于溞类的繁殖[24]。在本研究中, 高食
物浓度组中并未出现造成大型溞生殖幼溞的数量下
降的情况, 可能是设置的食物浓度还未足够高; 而
当食物浓度低至 0.01 mg C·(溞·d)–1 时, 大型溞生殖
幼溞的数量急剧下降, 与 Sims[8]的研究结果也相
一致。
4.2.3 大型溞繁殖试验中食物浓度的选择
在本研究中, 当食物浓度为 0.05 mg C·(溞·d)–1
时, 亲溞生殖幼溞的数量的平均值为 68 只, 就能满
足 OECD、ISO 和国内的大型溞繁殖试验方法[6, 22–23]
对每只亲溞所产存活幼溞的平均值≥60 只的有效性
要求 , 但是食物浓度低于其推荐的 0.1—0.2 mg
C·(溞·d)–1 范围。因此, 对于能吸附于藻细胞或被藻
细胞降解的化学物质[11–16]的大型溞繁殖试验测试,
可调整食物浓度在 0.05—0.1 mg C·(溞·d)–1 范围, 有
利于受试物暴露浓度的维持。
此外, 在本研究中, 0.20—0.30 mg C·(溞·d)–1 的
食物浓度会使试验溶液比较浑浊, 但是并未发现对
亲溞的繁殖能力造成影响。但是, 由于食物浓度达
到 0.2 mg C·(溞·d)–1 时, 大型溞的体长增长就基本达
到最大值, 因此在大型溞繁殖试验中也不建议采用
高于 0.2 mg C·(溞·d)–1 的食物浓度。
4.3 国内本土大型溞品种的遗传学信息
采用分离自中国本土的大型溞品种作为试验生
6 期 陈进林, 等. 标准化测试中不同食物浓度对大型溞生长和繁殖的影响 47
物, 严格按照 OECD 的大型溞繁殖试验方法[6]的条
件开展试验, 是完全能满足试验有效性的要求的。
然而, OECD 建议对大型溞的遗传学信息进行鉴
定 [6]。国外已有不少研究鉴定了不同品系的大型溞
的遗传学信息存在差异[32], Baird 等的研究也表明大
型溞的遗传学信息差异会影响大型溞对毒物的敏感
性[32]。但是, 国内对大型溞遗传学的研究报道较少,
因此, 鉴定国内大型溞品种的遗传学信息并与国外
的相关研究数据相比较, 可能可以获得更多有意义
的信息。

致谢：感谢仲恺农业工程学院的曾梓浩同学在
本研究的试验准备和部分操作中所作的贡献。
参考文献
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