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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(2):146-151
偶氮染料是目前使用量最大的一类合成染料，
因其成本低廉和染色性能突出等优点被广泛应用于
纺织、皮革、食品和化妆品等行业。偶氮染料具抗光、
抗氧化能力，故能稳定存在于水体，造成水体色度
增加，并影响水生生物的生存［1，2］。据报道，多数
偶氮染料及其代谢的中间产物具致癌、致畸和致突
变等毒害作用［3，4］。因此，偶氮染料引起的水污染
问题一直是国内外关注的焦点。
废水的生物处理法具有高效、安全、低能耗以
及环境友好等特点［5，6］。迄今为止，已分离筛选出
许多可使偶氮染料降解脱色的微生物，其中一些成
功应用于染料废水的生物修复［7-9］。而有关偶氮染
收稿日期 ：2015-04-09
基金项目 ：国家自然科学基金项目（21107002）
作者简介 ：陈亮，男，硕士研究生，研究方向 ：偶氮类染料的微生物降解 ；E-mail ：1028383665@qq.com
通讯作者 ：王莉，女，副教授，研究方向 ：染料的微生物降解 ；E-mail ：642012688@qq.com
一株新的染料甲基红降解菌株 Paracoccus sp. L-4 的
分离、鉴定及其脱色特性研究
陈亮 王莉
（安徽建筑大学环境与能源工程学院，合肥 230601）
摘 要 ： 从副球菌属首次分离到一株有较强甲基红降解能力的菌株 Paracoccus sp. L-4，在 LB 培养基中，16 h 内使 100 mg/L
培养液甲基红降解掉 91.74%，2 d 内可使甲基红降解率近达 100%。该菌株降解甲基红适宜的温度和 pH 值范围分别为 25-30℃、
pH6.0-7.0，Zn2+、Co2+、Cu2+、Ag+、Al3+、Fe3+、Fe2+ 对甲基红的降解有明显抑制作用。菌株 L-4 在好氧和缺氧条件均能较好降解甲
基红，装液量≤ 100 mL 时脱色率随装液量增加而减少，装液量≥ 125 mL 时，12 h 时降解率仍大于 40%。菌株 L-4 在染料废水的
生物处理方面有一定的应用价值。
关键词 ： 甲基红 ；Paracoccus sp. L-4 ；分离 ；鉴定 ；降解特性
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.019
Isolation，Identification and Decolonization Characteristics of a New
Methyl Red Degrading Bacterial Strain Paracoccus sp. L-4
CHEN Liang WANG Li
（College of Environment and Energy Engineering，Anhui University of Architecture，Hefei 230601）
Abstract: The strain Paracoccus sp. L-4 was isolated from Paracoccus sp. at first time, and it had the strong ability to degrade methyl
red. In LB medium, methyl red in the concentration of 100 mg/L was degraded 91.74% in 16 h, and approximately 100% in 2 d. Furthermore,
the optimal conditions for degrading methyl red were 25-30℃ and pH6.0-7.0, respectively. And Zn2+, Co2+, Cu2+, Ag+, Al3+, Fe3+ and Fe2+ had
an significant inhibitory effects on the degradation of methyl red. The degradation and decolorization of methyl red by strain L-4 was performed
well in both aerobic and anoxic conditions. When the volume of liquid was ≤ 100 mL, the ratio of decolorization decreased with the increase of
volume of liquid. However, when the amount of liquid was ≥ 125 mL, the degradation rate of methyl red was still over 40% at 12 h, indicating
that strain L-4 has a potential application value in biological treatment of dye wastewater.
Key words: methyl red ；Paracoccus sp. L-4 ；isolation ；identification ；degradation characteristics
2016,32(2) 147陈亮等 ：一株新的染料甲基红降解菌株 Paracoccus sp. L-4 的分离、鉴定及其脱色特性研究
料甲基红的降解脱色菌株的研究一直较少有人涉及。
本研究报道一株对甲基红有较好降解能力的菌株副
球菌属 Paracoccus sp. L-4，详细摸索菌株 L-4 的生理
生化和降解特性，以期为该菌株应用偶氮染料废水
的处理提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
污泥取自江苏常熟某染料化工厂排污口。
LB（Luria-Bertani） 培 养 基 ：10.0 g 蛋 白 胨，
5.0 g 酵母浸粉，10.0 g NaCl，1 000 mL 水，pH 7.0-
7.2。1/10 LB 培养基 ：1.0 g 蛋白胨，0.5 g 酵母浸粉，
1.5g NaCl，1.0 g NH4NO3，1.5 g K2HPO4·H2O，0.5 g
KH2PO4，0.2 g MgSO4·7H2O，1 000 mL 水，pH 7.0-
7.2。无机盐培养基（Mineral salt medium，MSM）：1.0
g NH4NO3，1.5 g K2HPO4·H2O，0.5 g KH2PO4，0.5 g
NaCl，0.2 g MgSO4·7H2O，1 000 mL 水，pH 7.0-7.2。
甲基红为分析纯，购自天津市化学试剂三厂。二氯
甲烷为分析纯，购自上海中试化工总公司。
1.2 方法
1.2.1 菌株的富集与分离 将 5.0 g 污泥置于 50 mL
含20 mg/L甲基红的1/10 LB培养基中，30℃、170 r/min
振荡培养。每隔 1 周转接 1 次，甲基红逐渐提高的
浓度至 100 mg/L。经测定，连续 3 代能降解甲基红
达 85% 以上的即为稳定富集液。将富集液梯度稀释
后涂布于含 100 mg/L 甲基红的 LB 平板。挑取有无
色透明圈的单菌落接种到液体 LB，采用紫外可见分
光光度法检测其甲基红的降解脱色能力。
1.2.2 菌株的鉴定 降解菌株的形态和生理生化特
性参照文献［10］进行。菌株总 DNA 的提取采用高
盐法，并以此作为模板进行 16S rDNA 基因的扩增。
PCR 产物经上海生工生物工程有限公司测序，测序
结果通过在线分析，与 GenBank 中的其他 16S rRNA
基因序列进行相似性比较，构建系统进化树。
1.2.3 菌 株 L-4 对 甲 基 红 的 降 解 在 50 mL LB、
MSM 中分别添加 100 mg/L 甲基红，接种 0.5 mL 预
培养的 L-4 种子液（OD600 nm=1.0），观察 L-4 对甲基
红的降解。30℃、170 r/min 摇床振荡培养，间隔时
间取样，测定培养液中甲基红的残留量。菌株的生
长用 OD600 nm 表示。
1.2.4 环境条件对菌株 L-4 降解甲基红的影响在
50 mL LB 中添加 100 mg/L 甲基红，接种 L-4 后，分
别在不同条件下 170 r/min 振荡培养后测定甲基红的
降解脱色情况，观察温度、初始 pH 值、通气量和
金属离子对菌株 L-4 甲基红脱色的影响。12 h 后取
样，测定培养液中甲基红的残留量。所有处理设 3
个重复。
1.2.5 染料浓度对菌株 L-4 降解甲基红的影响 在
50 mL LB 中添加甲基红至终浓度分别为 50、100、
150、200、250、300、350 和 400 mg/L，30℃、170
r/min 摇床振荡培养。接种菌株 2 d 后，测定培养液
中甲基红的残留量。所有处理设 3 个重复。
1.2.6 甲基红含量的测定 培养液以 12 000 r/min 离
心 5 min，收集上清液。加入 3 倍体积的二氯甲烷，
剧烈振荡 5 min，静置 10 min 分层。用尖嘴吸管吸
取下层有机相，加入少量无水硫酸钠。取 1.0 mL 置 1.5
mL 离心管，室温氮气吹干。加入 3 mL 二氯甲烷溶解，
于岛津 UV-1800 紫外可见分光光度计检测培养液中
的甲红红残留量。甲基红检测波长分别为 420 nm。
2 结果
2.1 降解菌株L-4的分离和鉴定
采用富集培养的方式，从长期受染料污染的
污泥中分离到一株能够较好对甲基红降解脱色的细
菌菌株，命名为 L-4。该菌株在含有 100 mg/L 甲基
红的 50 mL 1/10 LB 中，2 d 对甲基红的降解率近达
100%。
菌株 L-4 在 LB 平板上生长 2 d 后，菌落呈乳白色、
圆形、光滑、黏稠。菌株 L-4 为革兰氏阴性菌，不
运动，不能形成芽孢，呈短杆状（0.8-0.9 μm×0.9-
1.1 μm）。菌株 L-4 氧化酶、过氧化氢酶、α-葡糖苷酶、
硝酸盐还原反应阳性，α-半乳糖苷酶、α-甘露糖苷
酶和脲酶阴性。能利用 L-阿拉伯糖、L-岩藻糖、D-
葡萄糖、D-甘露糖醇、D-核糖和 D-蔗糖作为唯一碳
源生长。菌株 L-4 能耐 4% 的 NaCl。
提 取 降 解 菌 基 因 组 DNA， 用 16S rDNA 通 用
引物对降解菌的 16S rDNA 进行扩增，得到长度约
为 1 329 bp 的 片 段。 将 测 序 结 果 提 交 至 NCBI 数
据库获得登录号。根据 L-4 与相关属种 16S rRNA
序列构建系统进化发育树（图 1），比较发现，菌
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.2148
株 L-4 与 Paracoccus limosus 同 源 性 达 97.8%， 与 该
属 Paracoccus denitrificans、Paracoccus marinus 和
Paracoccus aminophilus 也 分 别 有 97.7%、97.7% 和
97.4% 的相似性。因此，结合菌株形态和生理生化
Paracoccus aminophilus ATCC 49673T AY014176
70
51
45
52
11
27
24
100
6
43
24
100
54
24
0.005
Paracoccus homiensis DD-R11T DQ342239
Paracoccus saliphilus YIM 90738T DQ923133
Paracoccus aestuarii B7T EF660757
Paracoccus isoporae SW-3T FJ593906
Paracoccus marinus KKL-A5T AB185957
Paracoccus bengalensis JJJT AJ864469 Paracoccus pantotrophus ATCC 35512T Y16933 Paracoccus denitrificans ATCC 17741T Y16927 Paracoccus sulfuroxidans LW36T DQ512861 Paracoccus aminovorans JCM 7685T D32240 Paracoccus yeei G1212T AY014173
Paracoccus limosus NB88T HQ336256 Strain L-4 Paracoccus caeni MJ17T GQ250442 Paracoccus chinensis KS-11T EU660389
特征，将 L-4 归属到副球菌属（Paracoccus sp.）。
2.2 菌株L-4对甲基红的降解脱色
由图 2 可知，菌株 L-4 不能以甲基红为唯一的
碳源生长和降解甲基红，36 h 时 MSM 培养基中 L-4
的 OD600 nm 值未见明显增加，甲基红质量浓度也未见
明显减少。但在 LB 培养基中，L-4 表现出较强的降
解能力，16 h 时培养液甲基红质量浓度已从 97.11
mg/L 下降至 8.02 mg/L，降解率达 91.74%，相应菌
液的 OD600 nm 值也从 0.02 上升至 1.24。
图 1 降解菌株 L-4 的系统发育树
2.3 温度对菌株L-4降解甲基红的影响
菌株 L-4 在不同温度降解甲基红结果（图 3）
显示，当温度为 25、30℃时，菌株对甲基红有较好
的脱色能力，12 h 时培养液甲基红的降解率分别为
65.84%、78.89%，30℃为最适温度。在 20℃及以下
和 35℃及以上，脱色效果较差，脱色率小于 37%。
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36
0
20
40
60
80
100
൘LBѝ䱽䀓൘MSMѝ䱽䀓⭢ส㓒⎃ᓖ mg·L-1 ᰦ䰤/h 0.00.40.8
1.2
1.6
2.0
2.4
൘LBѝ⭏䮯൘MSMѝ⭏䮯 OD 600nm
图 2 L-4 以甲基红为碳源的生长和降解
0
20
40
60
80
100
3735302520
⭢ส㓒⎃ᓖ mg·L-1 ᓖ/ć15
图 3 温度对 L-4 降解甲基红的影响
2.4 初始pH值对菌株L-4降解甲基红的影响
菌株 L-4 在不同 pH 下降解甲基红结果（图 4）
显示，该菌在过酸（pH4-5）或过碱（pH8-9）条件
2016,32(2) 149陈亮等 ：一株新的染料甲基红降解菌株 Paracoccus sp. L-4 的分离、鉴定及其脱色特性研究
下都不能很好地降解甲基红，12 h 时甲基红降解脱
色率小于 21%。菌株 L-4 降解甲基红适宜 pH 值范围
为 6.0-7.0，12 h 时甲基红降解率超过 80%，pH6.0
的降解效果最佳，脱色率达 88.08%。
6 所 示。 本 实 验 观 察 Zn2+、Co2+、Cu2+、Ag+、Al3+、
Fe3+、Fe2+、Mg2+、Ca2+ 和 Mn2+ 几种离子对菌株 L-4
降解脱色效果的影响，金属离子浓度为 1 mmol/L。
结 果 表 明，Zn2+、Co2+、Cu2+、Ag+、Al3+、Fe3+、Fe2+
7 种金属离子对甲基红的降解有较强地抑制作用，
几种金属离子下的甲基红降解率小于 40%。而 Mg2+、
Ca2+ 和 Mn2+ 对甲基红的降解无明显抑制作用，脱色
率分别为 78.92%、79.46% 和 78.79%。
4 5 6 7 8 9
0
20
40
60
80
100
⭢ส㓒⎃ᓖ mg·L-1
pH
图 4 pH 值对 L-4 降解甲基红的影响
2.5 通气量对菌株L-4降解甲基红的影响
本实验以不同的装液量来反映通气量对菌株
L-4 降解甲基红的影响，结果如图 5 所示。当装液
量≤ 125 mL 时，脱色率随着装液量的增加而减少，
且装液量对 L-4 降解甲基红影响较大 ；装液量为 25
mL 时，降解率达到 88.2%，而在 125 mL 处仅达到
47.14%。但装液量继续增大时，培养液甲基红残留
量未见明显增加，12 h 时几组的甲基红降解率仍大
于 40%。
25 50 75 100 125 150 175 200
0
10
20
30
40
50
60
⭢ส㓒⎃ᓖ mg·L-1 㻵⏢䟿/mL
图 5 通气量对 L-4 降解甲基红的影响
2.6 金属离子对菌株L-4降解甲基红的影响
菌株 L-4 在不同 pH 下降解甲基红的结果如图
0
20
40
60
80
Mn2+Ca2+Mg2+Fe2+Fe2+Al2+Ag2+Cu2+Co2+Zn2+
⭢ส㓒⎃ᓖ mg·L-1 䠁ᆀሩ➗
图 6 金属离子对 L-4 降解甲基红的影响
2.7 初始浓度对菌株L-4降解甲基红的影响
不同初始浓度对菌株 L-4 降解甲基红的影响
如图 7 所示。菌株 L-4 对甲基红的脱色率随甲基红
的初始浓度的升高而降低。当初始质量浓度≤ 200
mg/L，24 h 时， 甲 基 红 脱 色 率 达 到 90% 以 上，50
mg/L 时脱色率最高，达到 98.53%，300 mg/L 时，脱
色率仍能达到 43.35%。与其他偶氮染料降解微生物
相比［11-13］，菌株 L-4 对于高质量浓度甲基红，具有
良好的脱色能力。但当浓度为 400 mg/L 时，脱色效
果不佳，脱色率仅为 12.51%，说明此时染料质量浓
度可能已经超过了该菌株的耐受能力，降解酶活性
受到了较强的抑制作用。
3 讨论
随着印染、纺织等行业的迅速发展，染料废水
逐年增加，其中偶氮染料废水产量最大。生物法被
认为是目前最有前途的一种废水处理法［5，6］，而生
物处理法的关键是高效的降解微生物的筛选。到目
前为止有大量的偶氮染料脱色微生物从各种环境中
被分离出来，而甲基红降解脱色菌株却较少见到报
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.2150
道［14-16］。本实验在长期受染料污染的污泥中分离获
得一株高效降解甲基红的菌株 L-4，该菌株能在 16
h 内使培养液 100 mg/L 甲基红降解率达 91.74%，2 d
内可使甲基红的降解率近达 100%。
根据形态学、生理生化特性实验，将菌株 L-4
初步归属到副球菌属（Paracoccus sp.），这是首次从
副球菌属分离到有甲基红降解能力的菌株，因此该
菌株的分离丰富了甲基红降解的菌种资源。已报道
的偶氮脱色细菌有好氧菌也有厌氧菌，但即便是好
氧菌，脱色仍需厌氧环境［17，18］。本实验中，菌株 L-4
的生长和对甲基红的降解脱色都是在好氧条件下，
这可能是因为菌株 L-4 的细胞存在好氧性的偶氮染
料降解脱色酶的缘故，因此，菌株 L-4 的分离将有
助于进一步揭示偶氮染料的好氧脱色机制。
环境条件对菌株降解甲基红的影响实验表明，
该菌株降解甲基红的适宜温度 25-30℃，适宜 pH 值
为 6.0-7.0，Zn2+、Co2+、Cu2+、Ag+、Al3+、Fe3+、Fe2+
对甲基红的降解有较强地抑制作用。但通气量对菌
株 L-4 影响较小，缺氧条件也可较好地降解甲基红，
12 h 时装液量≥ 125 mL 实验组降解率仍大于 40%，
提示菌株 L-4 在缺氧条件也可较好的对甲基红降解
脱色。
4 结论
分离筛选得到一株能够有效降解甲基红的菌株
L-4，初步鉴定该菌株为副球菌属（Paracoccus sp.）。
该菌株不能以甲基红为唯一碳源生长和降解甲基
红，在 LB 培养基中，16 h 内使 100 mg/L 培养液甲
基红降解掉 91.74%，降解甲基红的适宜温度为 25-
50 100 150 200 250 300 350 400
0
50
100
150
200
250
300
350
400
⭢ส㓒⎃ᓖ mg·L-1 ࡍḃᯉ⎃ᓖ mg·L-1
图 7 甲基红初始质量浓度对 L-4 降解甲基红的影响
30℃，适宜 pH 值为 6.0-7.0，装液量≤ 100 mL 时，
脱色率能达到 60%，装液量 >100 mL，也在 40% 以
上，L-4 对高质量浓度甲基红具有良好的脱色能力，
24 h，50 mg/L 时，脱色率最高，达到 98.53%。部
分金属离子对该菌株降解甲基红有抑制作用，其中
其中 Cu2+ 抑制最明显，12 h，甲基红的降解率仅为
30.07%。
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（责任编辑 李楠）