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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(6):60-68
收稿日期：2015-08-31
基金项目：国家高技术研究发展计划（“863”计划）（2012AA020101），国家星火计划（2014GA701007），浙江省重大科技专项重点社会发
展项目（2013C03045-1），宁波市科技创新团队项目（2015C110018），宁波大学学科项目（XKL14D2083）
作者简介：程蝶，女，研究方向：生物技术；E-mail ：17855822426@163.com
通讯作者：周前进，男，博士，讲师，研究方向：动物疫病诊断技术；E-mail ：mumu2325@163.com
环介导等温扩增联合横向流动试纸条可视化检测
哈维氏弧菌的研究
程蝶  柴方超  蔡怡  周前进  陈炯
（宁波大学生物与海洋科学系，宁波  315211）
摘 要 ： 以哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）为材料，利用环介导等温扩增技术（LAMP）进行核酸扩增，借助横向流动试纸条
（LFD）完成产物检测，旨在建立一种可用于哈维氏弧菌快速检测的 LAMP-LFD 新技术。以哈维氏弧菌的溶血素基因（vhhA）为检
测靶标设计了 3 对特异性引物（其中，上游内引物 vhhA-FIP 由生物素标记），进行由生物素标记的 LAMP 反应 ；同时设计 1 条异
硫氰酸荧光素（FITC）标记的探针，与获得的 LAMP 产物进行特异性杂交，杂交产物经 LFD 完成检测。经优化，LAMP 的反应条
件为 63℃反应 40 min，由 LFD 完成结果判读共需 50 min。结果表明，LAMP-LFD 方法能特异性地检出哈维氏弧菌，对创伤弧菌等
其他 9 种水产养殖重要病原菌的检测结果呈阴性。利用该方法，针对细菌纯培养物的检测灵敏度为 1.0×102 CFU/mL 或 2 CFU/ 反应，
针对污染有该菌的大黄鱼组织的检测灵敏度为 5×102 CFU/mL 或 20 CFU/ 反应，均是以 LAMP 外引物 vhhA-F3/vhhA-B3 的常规 PCR
方法的 100 倍。因此，该方法能够快速、准确地检出哈维氏弧菌，有望在海水养殖过程哈维氏弧菌的监测和即时检测中普及使用。
关键词 ： 哈维氏弧菌 ；溶血素基因 ；环介导等温扩增技术 ；横向流动试纸条 ；检测
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.010
Visual Detection of Vibrio harveyi Based on Loop-mediated Isothermal
Amplification Combined with a Lateral Flow Dipstick
CHENG Die  CHAI Fang-chao  CAI Yi  ZHOU Qian-jin  CHEN Jiong
（Department of Biology and Marine Science，Ningbo University，Ningbo 315211）
Abstract:  Based on nucleotide enrichment by a  loop-mediated isothermal amplification（LAMP）and chromatographic visualization 
by a lateral flow dipstick（LFD）assay，this work aims to develop a novel LAMP-LFD method for the rapid detection of Vibrio harveyi. Three 
pairs of primers were designed using the hemolysin gene（vhhA）of V. harveyi as detection target，and used in LAMP reaction，among which 
the forward inner primer vhhA-FIP was biotinylated. Similarly，a fluorescein isothiocyanate（FITC）-labeled probe vhhA-HP was designed to 
specifically hybridize with LAMP products. And then the hybridized LAMP products were visually detected by LFD. The optimized LAMP was 
performed at 63℃ for 40 min；and visual detection via LFD took 50 min. The results indicated that LAMP-LFD was able to specifically identify V. 
harveyi from other 9 pathogenic bacteria commonly existing in the aquatic animals，such as V. vulnificus. The detection limit of LAMP-LFD was 
1.0×102 CFU/mL for V. harveyi pure cultures（equivalent to 2 CFU per reaction），and 5×102 CFU/mL for V. harveyi contaminated tissues of 
large yellow croaker（equivalent to 20 CFU per reaction），both of which were 100 times lower than that of the conventional PCR method using 
both outer primers vhhA-F3/vhhA-B3. Therefore，this rapid and accurate LAMP-LFD method is a promising alternative in the surveillance and 
point-of-care test of V. harveyi in sea farming.
Key words:  Vibrio harveyi ；hemolysin ；loop-mediated isothermal amplification ；lateral flow dipstick ；assay detection
2016,32(6) 61程蝶等：环介导等温扩增联合横向流动试纸条可视化检测哈维氏弧菌的研究
哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）是一种革兰氏阴性
的嗜盐弧菌，普遍分布于近岸的海水环境中，是海
洋水体和许多海生动物的正常菌群［1，2］。同时，哈
维氏弧菌又是一种重要的机会致病菌，可感染鱼、虾、
贝类等多种海洋动物，引发死亡率较高的弧菌病［3］。
在东南亚地区，哈维氏弧菌是虾养殖产业的主要细
菌性病害之一［4，5］；该弧菌也曾给大洋洲各国斑节
对虾的养殖带来毁灭性的打击［6，7］。哈维氏弧菌可
使鲍鱼养殖大面积减产，该菌感染被认为是自 1998
年以来法国养殖和野生的欧洲鲍螺出现季节性大面
积死亡的主要原因［8］。在我国，虾的早期死亡综合
征（early mortality syndome，EMS）已成为虾养殖产
业的重要掣肘［9］，而研究表明哈维氏弧菌即是该新
发病的主要细菌性病原之一［9，10］，同时也是对虾白
尾病的重要诱因［11］。此外，该病原也是我国多种养
殖鱼类、贝类和蟹类的重要病原［12-15］。
哈维氏弧菌与其他多种致病弧菌（如副溶血弧
菌、溶藻弧菌等）在表型和基因型非常相似［16］，这
给种型水平上细菌的鉴定带来了一定的困难。例如，
利用传统的细菌分离培养和生化鉴定或借助鉴别培
养基不能将哈维氏弧菌与其他弧菌进行有效区分，
而 16S rRNA 的序列分析也只能将其鉴定至科属水
平［17，18］。基于多位点序列分析（MLSA）或基因组
测序的方法可有效区分不同弧菌，但仅限于实验室
的弧菌分类学研究［18，19］。因此，许多研究致力于哈
维氏弧菌其他标志性基因的鉴定和筛选，并在此基
础上建立了多种快速检测方法，如聚合酶链式反应
技术（PCR）［20，21］、多重 PCR 技术［22，23］、环介导
等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification， 
LAMP）等［24，25］。这些方法因其高灵敏度和特异
性、检测快速等特点，在哈维氏弧菌的检测领域获
得了广泛应用。但是，在对这些方法获得的产物进
行检测分析时，要么通过琼脂糖凝胶电泳的方式完
成，需要接触 EB等有毒试剂，要么借助于荧光染料，
容易造成结果的假阳性。LAMP-LFD技术是将 LAMP
的反应产物与特异性的探针杂交，在横向流动试纸
条（lateral flow dipstick，LFD）以显色的方式呈现
实验结果，通过肉眼即可快速完成结果判读。该方
法完全摒弃了 EB 等有毒试剂，也摆脱了对电泳装
置和凝胶成像系统等的依赖，整个检测时程也仅在
LAMP 反应的基础上增加了 8-10 min，而且由于特
异性探针的引入，使得结果更加特异，因此，在微
生物的基层检测和现场快速检测中展现了重大潜力。
目前，该技术已成功运用于传染性脾肾坏死病毒
（infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV）、
传染性肌肉坏死病毒（infectious myonecrosis virus，
IMNV），以及创伤弧菌（Vibrio vulnificus）等水产病
原微生物的检测［26-28］。本研究根据哈维氏弧菌溶血
素基因 vhhA 的保守区设计多条引物和 1条异硫氰酸
荧光素标记的探针，条件优化后建立 LAMP-LFD 检
测方法，并通过少量的样本检测，分析该方法在实
际检测应用中的可行性，为哈维氏弧菌引发的弧菌
病的快速诊断和早期检测提供更加可靠、便捷的技
术手段。
1 材料与方法
1.1  材料
迟缓爱德华菌（Edwardsiella tarda MCCC235）
中国海洋微生物菌种保藏管理中心；创伤弧
菌（V. vulnificus ATCC 27562）、 哈 维 氏 弧 菌（V.
harveyi ATCC 33866）、河流弧菌（V. fluvialis ATCC 
33809）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila ATCC 
7966）购自中国普通微生物菌种保藏中心；单增
李 斯 特 菌（Listeria monocytogenes ATCC 19115） 购
自广东省微生物菌种保藏中心；副溶血弧菌（V.
parahaemolyticus ATCC 33847）由浙江省疾控中心张
严峻研究员惠赠；海豚链球菌（Streptococcus iniae
ATCC 29178）、 溶 藻 弧 菌（V. alginolyticus ATCC 
17749）购自美国菌种保藏中心；鳗弧菌香鱼分离株
（V. anguillarum ayu-H080701）由本实验室保存。
1.2  方法
1.2.1  细菌培养和基因组 DNA 的制备  研究涉及
的弧菌划线接种于 TCBS 固体培养基，28-30℃培养
12-24 h 后，挑取单菌落于碱性蛋白胨水中震荡培养
至所需浓度；迟缓爱德华菌、嗜水气单胞菌、海豚
链球菌，以及单增李斯特菌划线接种于 LB 或 BHI
固体培养基，30 或 37℃培养后，挑取单菌落于 LB
或 BHI 液体培养基中震荡培养至所需浓度。
细菌基因组 DNA的制备参考王耀焕等［28］的方
法，具体操作：取新鲜培养的细菌液体培养悬液 1 
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.662
mL 12 000 r/min 离心 2 min，弃上清；菌体沉淀使用
100 μL 的细菌裂解液（Tris-HCl 0.1 mol/L，蛋白酶
K 0.2 μg/μL，Triton X-100 2.0%）充分悬浮，沸水浴 
10 min，立即冰浴 7 min ；重复上一步操作 1 次；
12 000 r/min 离心 2 min，取上清定容至 100 μL， 
-30℃贮存，用作 LAMP 和 PCR 扩增的模板。
1.2.2  引物设计  选择 NCBI 上公布的哈维氏弧菌
溶血素（vhhA，登录号：AF293430）基因，通过序
列比对分析后，依次选择 8 个高度保守的基因区段
设计 3 对特异性引物（外引物 vhhA-F3 和 vhhA-B3、
内引物 vhhA-FIP 和 vhhA-BIP、环引物 vhhA-LF 和
vhhA-LB）用于 LAMP 反应；同时设计 1 条探针
vhhA-HP，可与 LAMP 产物进行特异性杂交，用于
LFD 检测（表 1，图 1）。其中，内引物 vhhA-FIP 的
5 端进行生物素标记，探针 vhhA-HP 的 5 端进行
异硫氰酸荧光素标记。上述引物和探针由英潍捷基 
（上海）贸易有限公司合成。另外，将外引物
vhhA-F3 和 vhhA-B3 也作为 PCR扩增的特异性引物，
表 1 根据哈维氏弧菌 vhha 基因序列设计的 LAMP-LFD 扩增引物序列和探针
引物 类型 长度 序列（5-3）
vhhA-F3 上游外引物 20-mer AACCAATACATCGCTCTGAC
vhhA-B3 下游外引物 19-mer TCATTTCCACGATCTTCGC
vhhA-FIP a （F1c+TTTT+F2）上游内引物 45-mer 
（F1c ：20-mer F2 ：21-mer）
GGCACGCTACGGTTGTAGTTttttAACTACAAGCCTGCTAATACC
vhhA-BIP （B1c+TTTT+B2）下游内引物 46-mer 
（B1c ：21-mer B2 ：21-mer）
GACTACGCGGAAGCCTTGATTttttTCTGGTAGTGTCATCAACAAC
vhhA-LF 上游环引物 22-mer AGACCAAACTCAAGGGTAAACA
vhhA-LB 下游环引物 18-mer TGCAGGTGCGAAGAACTT
vhhA-HPb 杂交探针 19-mer GCCAGAAGTGAAATCAGAC
   注 ：a ：上游引物 VhhA-FIP 的 5 端进行生物素标记；b：VhhA-HP 的 5 端进行异硫氰酸标记
下划线：LAMP 反应所需引物及 LFD 检测所需探针序列，其中，vhhA-B1c、
vhhA-B2c、vhhA-B3c 是下游引物 vhhA-B1、vhhA-B2、vhhA-B3 的互补序列
图 1 哈维氏弧菌溶血素基因 vhhA LAMP-LFD 引物序列
和探针设计示意图
扩增的预期片段大小约为 310 bp。
1.2.3  LAMP 反应条件的优化  LAMP 反应的体系参
考 Ding 和王耀焕等［26，28］的方法，具体组成如下（25 
μL）：MgSO4 6.5 mmol/L，KCl 10 mmol/L，（NH4）2SO4 
10 mmol/L，Tris-HCl 20 mmol/L（pH 8.8），Triton X- 
100 0.1%，甜菜碱 1.6 mol/L，dNTPs 1.4 mmol/L，外
引 物 vhhA-F3 和 vhhA-B3 各 0.2 μmol/L， 内 引 物
vhhA-FIP 和 vhhA-BIP 各 1.6 μmol/L，环引物 vhhA-
LF 和 vhhA-LB 各 0.4 μmol/L，Bst DNA 聚合酶（New 
England BioLabs，美国）8 U，哈维氏弧菌基因组
DNA模板 2 μL。阴性对照不加任何模板 DNA。
取新培养的哈维氏弧菌，经平板计数法获得菌
液浓度为 2.4×108 CFU/mL，使用液体培养基（碱性
蛋白胨水）将该菌液浓度调整为 1.0×108 CFU/mL，
并定为起始浓度。将该原始菌液进行连续 10 倍
浓度梯度稀释，获得 1.0×108 CFU/mL、1.0×107 
CFU/mL、1.0×106 CFU/mL、1.0×105 CFU/mL、1.0×104 
CFU/mL、1.0×103 CFU/mL、1.0×102 CFU/mL 和
1.0×101 CFU/mL 等 8 个浓度的菌液，按 1.2.1 所述
的方法分别提取其基因组 DNA。选择较低模板浓度
（相当于 1.0×104 CFU/mL），分别在 61、63和 65℃
条件下温育 60 min，每个温度下，平行制备 3个样品，
然后经 80℃热激 5 min 终止反应，利用 1.5% 的琼脂
2016,32(6) 63程蝶等：环介导等温扩增联合横向流动试纸条可视化检测哈维氏弧菌的研究
糖凝胶电泳检测产物，确定 LAMP 的最佳反应温度。
选择 2个浓度的菌液（较高模板浓度相当于 1.0×108 
CFU/mL，较低模板浓度相当于 1.0×104 CFU/mL）
作为反应时间优化的模板，在优化的温度下进行温
育，温育时间分别为 0、10、15、20、25、30、40
和 50 min，通过 1.5% 的琼脂糖凝胶电泳检测产物，
确定最佳反应时间。
1.2.4  利用横向流动试纸条（LFD）检测  本研究
使用的横向流动试纸条（LFD）购自 Milennia Biotec 
GmbH（Milenia GenLine HybriDetect by Milenia Biotec 
GmbH，Germany，http://www.milenia-biotec.de/）， 其
检测线位置标记有生物素抗体，可特异性地与生物
素标记的 LAMP 产物结合而在检测线上呈现颜色变
化。内引物 vhhA-FIP 经生物素标记后，利用优化后
的 LAMP 反应体系进行 LAMP 反应；反应结束后不
使用高温致使反应终止，而是向反应体系中 20 pmol 
的经 FITC 标记的探针 vhhA-HP，继续反应 5 min ；
取 5 μL 反应液加入到 100 μL 检测 buffer 中混匀；将
LFD试纸条的检测端竖直浸入buffer溶液中，静置3-5 
min，肉眼判断结果。
1.2.5  LAMP-LFD 的特异性实验  用于 LAMP-LFD
特异性实验的细菌种类主要包括弧菌（创伤弧菌、
河流弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌和鳗弧菌）、迟缓
爱德华菌、单增李斯特菌、海豚链球菌，以及嗜水
气单胞菌等 9种水产养殖或水产品中的常见病原菌。
将各菌株的新培养物调整浓度至 1×105 CFU/mL，按
1.2.1 所述提基因组 DNA，并以此为模板，利用优化
的反应条件，进行有生物素标记的 LAMP 反应，产
物经 LFD 检测；同时利用 1.5% 的琼脂糖凝胶电泳
的方法判断实验结果。
1.2.6  LAMP-LFD 的灵敏度实验  分别取 1.2.3 所
述的不同稀释浓度的哈维氏弧菌菌液提取的基因组
DNA 2 μL 为模板，每个浓度平行制备 3个样品。利
用优化的反应条件进行有生物素标记的 LAMP 反应，
产物经 LFD 检测；同时利用 1.5% 的琼脂糖凝胶电
泳的方法判断实验结果。
同样，取上述各稀释度的基因组 DNA 为模板，
以外引物 vhhA-F3 和 vhhA-B3 作为引物，进行 PCR
反应。PCR 反应体系（25 μL），包括：10× PCR 
buffer 2.5 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）（TaKaRa，
日本）0.15 μL，dNTPs（2.5 mmol/μL）2 μL，vhhA-F3 
（10 pmol/μL）1 μL，vhhA-B3（10 pmol/μL）1 μL，
基因组 DNA 模板 2 μL。PCR 反应程序：94℃预变
性 3 min ；94℃变性 30 s，52℃退火 30 s，72℃延伸
30 s，30 个循环；最后，72℃延伸 10 min。反应产
物利用 1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.7  LAMP-LFD 的重复性实验  取 1 mL 新鲜培
养的哈维氏弧菌菌液，计数并调整浓度至 1.0×108 
CFU/mL，连续 10 倍浓度梯度稀释至 LAMP-LFD 检
测的最低浓度，平行制备 3个样品。按 1.2.1 所述提
取基因组 DNA，并以此为模板，采用优化的 LAMP
反应体系进行扩增，验证方法的可重复性。
1.2.8  哈维氏弧菌人工污染大黄鱼组织实验及田间
样本的检测  取 1 mL 新鲜培养的哈维氏弧菌菌液，
计数并调整浓度至 1.0×108 CFU/mL，10 倍浓度梯
度稀释后，选取浓度 1.0×105、1.0×104、1.0×103、
1.0×102 及 1.0×101 CFU/mL 的菌液各 1 mL 与等体
积的大黄鱼肌肉组织匀浆液混匀。每个浓度平行制
备 3个样品。取 1 mL 细菌污染的肌肉组织样品，采
用动物组织基因组 DNA 提取试剂盒（宝生物工程
（大连）有限公司，中国）提取细菌污染样品的基因
组 DNA，溶解于 50 μL 的 ddH2O 中，用作 LAMP 和
PCR 测试的模板。健康大黄鱼的肝脏组织匀浆液作
阴性对照。
收集具有一定临床症状的养殖动物 22 份，包
括大黄鱼样品 8份，南美白对虾 14 份。首先对各样
品进行细菌分离，通过鉴别培养基筛选结合生化实
验的方法对病原进行分离、鉴定；同时分别取适量
动物组织，利用动物组织基因组 DNA 提取试剂盒
（宝生物工程（大连）有限公司，中国）提取基因组
DNA，采用 LAMP-LFD 和 PCR 方法进行检测。
2 结果
2.1  LAMP扩增条件的确定
为确定最佳反应温度，以较低浓度的基因组
DNA 为模板，分别选择 61、63 及 65℃进行 LAMP
反应 60 min。结果表明，利用上述 3 个温度获得的
LAMP 产物均能够检测到明显的梯状条带，未添加
DNA模板的反应管未检测到明显的梯状条带。其中，
在相同的反应体系下，当反应温度为 63℃时，扩增
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.664
产物的条带更加清晰，所以选择 63℃作为 LAMP 反
应的最适温度（图 2-A）。
当模板浓度较高时（1.0×108 CFU/mL），反应
15 min 即可出现明显的梯状条带；反应至 30 min 时，
扩增产物的浓度几乎不再增加（图 2-B）。当选用较
低模板浓度时（1.0×104 CFU/mL），反应至 20 min
时，利用琼脂糖凝胶电泳才可明显地检测到梯状条
带；继续延长反应时间，扩增产物的浓度逐渐增加；
反应时间延长至 40 min 时，产物浓度不再明显变化。
为保证实际检测过程中，当遇到较低模板浓度时，
仍可有效地检测出病原，我们将 LAMP 反应的最佳
时间确定为 40 min（图 2-C）。
方法的特异性分析，按优化的 LAMP 反应条件 63℃
温育 40 min。产物经 LFD 检测发现，以哈维氏弧菌
基因组 DNA为模板的反应呈阳性，而以其他供试弧
菌、海豚链球菌、单增李斯特菌等致病菌的基因组
DNA为模板时，反应皆呈阴性，以蒸馏水为模板的
反应也呈阴性（图 3）。
bp
3000
1000
500
100
bp
3000
1000
500
100
bp
3000
1000
500
100
M 60
108NC
0 10 20 30 40 50 /min2515
M 60
104NC
0 10 20 30 40 50 /min2515
M NC
61ć
104 104 104 NC
63ć
104 104 104 NC
65ć
104 104 104
A
B
C
M：100 bp Plus DNA ladder（Fermentas，美国）；NC：以无菌去离子水为模板，
反应时间为 60 min。A：LAMP 反应温度的确立；104：模板浓度约为 1.0×104 
CFU/mL，反应时间为60 min。B、C：反应时间的确定。B：模板浓度约为1.0×108 
CFU/mL ；C：模板浓度约为 1.0×104 CFU/mL
图 2 LAMP 反应条件的优化
bp
3000
1000
500
100䍘᧗㓯Ự⍻㓯
A
B
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
M：100 bp Plus DNA ladder（Fermentas，美国）；1：以无菌去离子水作为模板； 
2 ：以哈维氏弧菌基因组 DNA为模板；3-11 ：分别以创伤弧菌、河流弧菌、
副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、迟缓爱德华菌、单增李斯特菌、海豚链球菌、
嗜水气单胞菌的基因组 DNA为模板
图 3 LAMP（A）和 LAMP-LFD（B）特异性分析
2.3  LAMP-LFD的灵敏度验证
选 用 1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、
1.0×103、1.0×102 及 1.0×101 CFU/mL 等 7 个浓度 
的基因组 DNA 作为模板，进行有生物素标记的
LAMP 反应。实验结果表明，经 LFD 检测的最低模
板浓度为 1.0×102 CFU/mL 或 2 CFU/ 反应（图 4-E）；
利用 1.5% 琼脂糖凝胶电泳同样可检测到的最低模
板浓度为 1.0×102 CFU/mL（图 4-A、4-B、4-C）；而
以 vhhA-F3 和 vhhA-B3 为特异性引物的 PCR 方法能
够检测到的最低模板浓度为 1.0×104 CFU/mL 或 200 
CFU/ 反应（图 4-D）。
2.4  LAMP-LFD重复性分析
重新取哈维氏弧菌的新鲜培养悬液，调整至可
检测的最低模板浓度（1.0×102 CFU/mL），提取基
因组 DNA 后，以优化的反应体系 63℃温育 40 min。
2.2  LAMP-LFD的特异性
选择常见的水产致病菌为模板进行 LAMP-LFD
2016,32(6) 65程蝶等：环介导等温扩增联合横向流动试纸条可视化检测哈维氏弧菌的研究
结果表明，以 1.0×102 CFU/mL 浓度的哈维氏弧菌基
因组 DNA为模板时，LFD 检测结果呈阳性；以蒸馏
水为模板时，检测结果均呈阴性，具有良好的重复性。
2.5  LAMP-LFD检测哈维氏弧菌人工污染大黄鱼
组织灵敏度及适用性分析
不同浓度的哈维氏弧菌等体积污染大黄鱼组织
发现，LAMP-LFD 可从 1.0×103 CFU/mL 污染的大黄
鱼肌肉组织中稳定检测到病原，检测灵敏度为 5×102 
CFU/mL 或 20 CFU/ 反应。PCR 方法只能从 1.0×105 
CFU/mL 污染的大黄鱼肌肉组织中稳定检测到病原
（表 2）。LAMP-LFD 对健康大黄鱼肌肉组织的检测
结果为阴性，特异性良好。
利用传统的细菌分离培养方法对收集的病样检
测表明，8 份大黄鱼样品中有 2 份样品中可成功分
离出哈维氏弧菌，而 14 份南美白对虾中有 4份样品
分离出哈维氏弧菌。利用 LAMP-LFD 方法从传统方
法鉴定阳性的样品中均可检测出哈维氏弧菌，而且
从传统方法鉴定阴性的 2 份病虾样品中检测到哈维
氏弧菌的存在；PCR 方法也能够从传统方法鉴定阳
性的样品中检测出哈维氏弧菌，而传统方法检测阴
性的 1份病虾样品中检测到该病原菌（表 3）。
3 讨论
哈维氏弧菌能够感染多种海洋脊椎动物和无
脊椎动物，而在我国，该病原已成为对虾养殖中的
䍘᧗㓯Ự⍻㓯
bp
3000
1000
500
100
MA B
C
E
D
NC 107 106 105 104 103 102 101
NC 107 107 105 104 103 102 101
bp
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M NC 107 106 105 104 103 102 101
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M NC 107 106 105 104 103 102 101
bp
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M NC 107 106 105 104 103 102 101
M：100 bp Plus DNA ladder（Fermentas，美国）；NC：以无菌去离子水作为模板；不同浓度哈维氏弧菌（1.0×107、1.0×106、
1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102 和 1.0×101 CFU/mL）的菌液提取的基因组 DNA作为模板，各浓度平行制备
3个重复，LAMP 产物分别经琼脂糖凝胶电泳方法（A、B和 C）和 LFD（E）检测；以 vhhA-F3/ vhhA-B3 作为引物
进行 PCR反应，产物经琼脂糖凝胶电泳方法检测（D）
图 4 LAMP（A，B，C）、PCR（D）和 LAMP-LFD（E）方法的灵敏度
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.666
主要病原菌，也是鱼类、贝类及蟹类养殖的重要细
菌性病原。因此，建立快速、准确的检测技术，实
现病原菌的早期诊断和基层的即时检测，对于该病
的有效预防和监测具有重要意义。本研究选择哈维
氏弧菌的溶血素基因作为检测靶标，建立了便捷的
LAMP-LFD 技术，可特异性的从细菌培养物或动物
组织样品中检测到哈维氏弧菌病原。
灵敏度是衡量核酸检测类方法的重要技术指
标。Pang 等［29］选择 toxR 作为分类标记，建立的
PCR 方法，可从 4.0×103 细菌 /mL 的哈维氏弧菌纯
培养物中检测到细菌的存在；Caipang 等［21］以热
bp
3000
1000
500
100
A 䍘᧗㓯Ự⍻㓯
BM 1 2 3 4 5 6
M：100 bp Plus DNA ladder（Fermentas，美国）；1，3，5 ：以无菌去离子水作为模板；2，4，6：最低检测浓度（1.0×102 
CFU/mL）的哈维氏弧菌菌液提取基因组 DNA作为模板
图 5 LAMP（A）和 LAMP-LFD（B）的重复性试验
激蛋白家族 dnaJ 基因为检测靶标，建立了可特异
性检测亚洲鲈鱼体内哈维氏弧菌感染的 PCR 方法，
检测灵敏度达到了 100 fg 的细菌基因组 DNA。而
Schikorski 等［20］基于 TaqMan 探针技术建立了实时
荧光定量 PCR 技术，应用于欧洲鲍鱼哈维氏弧菌的
检测，灵敏度可达 18 个细菌。多重 PCR 技术在哈
维氏弧菌和弧菌菌群其他弧菌的同步检测和鉴别中
取得了一定程度的应用。Cano-Gomez 等［22］建立的
多重 PCR 技术，应用于哈维氏弧菌与相似弧菌坎氏
弧菌（V. campbellii）、藻弧菌（V. owensii）、轮虫弧
菌（V. rotiferianus）的区别鉴定，检测灵敏度可达
到 30 pg 的细菌基因组 DNA。而 Haldar 等［23］选择
弧菌的溶血素基因建立的多重 PCR 技术，可分别特
异性地检出哈维氏弧菌、坎氏弧菌，以及副溶血弧
菌，最低检测下限在 10-100 个细菌。环介导等温
扩增技术被认为具有比 PCR 更加优越的灵敏度［30］。
Cao 等［24］将毒素调控基因（toxin-positive regulatory 
表 2 哈维氏弧菌人工污染健康大黄鱼肌肉组织的检测结果
　方法
污染大黄鱼组织所用哈维氏弧菌浓度（CFU/mL） 未被污染的健康大黄鱼肌肉组织（CFU/mL）
1.0×105 1.0×104 1.0×103 1.0×102 1.0×101 0
LAMP-LFD + + + - - -
+ + + - - -
+ + + - - -
PCR + - - - - -
+ - - - - -
+ - - - - -
   注 ：+：阳性；- ：阴性
表 3 细菌分离培养、LAMP-LFD 和 PCR 对野外病样的检
测结果
细菌分离培养 LAMP-LFD PCR
鱼 虾 鱼 虾 鱼 虾
哈维氏弧菌（+） 2 4 2 6 2 5
哈维氏弧菌（-） 6 10 6 8 6 9
2016,32(6) 67程蝶等：环介导等温扩增联合横向流动试纸条可视化检测哈维氏弧菌的研究
gene，toxR）作为检测靶标，建立了针对哈维氏弧菌
的环介导等温扩增技术，灵敏度为 17.2 个细菌，与
基于 TaqMan 探针的实时荧光定量 PCR 技术的检测
灵敏度相当。而 Thongkao 等［25］基于 vhhP2 基因建
立的环介导等温扩增技术，进一步将该方法的灵敏
度提高到了0.6 CFU。本研究建立的LAMP-LFD方法，
针对哈维氏弧菌纯培养物的检测灵敏度为 1.0×102 
CFU/mL 或 2 CFU/ 反应；而利用该方法能够从污染
强度达到 5×102 CFU/mL 的大黄鱼组织中稳定检测
到哈维氏弧菌的存在，具有良好的灵敏度。
操作便捷，检测快速是目前核酸检测类方法不
断改进的重要目标。环介导等温扩增技术因其核酸
扩增过程不再需要类似 PCR 的多个温度模块，在 1
个温度下即可完成扩增过程，极大的降低了反应仪
器构造的复杂度，在操作便捷程度上具有比 PCR 明
显的优势［31］。针对 LAMP 产物的检测，常用的检
测手段包括琼脂糖凝胶电泳检测，利用荧光染料，
或通过利用浊度计检测，同样具有与 PCR 产物检
测相似的弊端，如检测仪器昂贵、假阳性率高、易
接触有毒试剂等［32，33］。LAMP-LFD 技术利用荧光
素标记的探针特异性地与 LAMP 产物结合，在很大
程度上降低了结果的假阳性，同时 LAMP 产物通过
LFD 试纸条检测，完全摒弃了对凝胶成像系统、浊
度计、荧光定量 PCR 仪等设备的依赖，检测更加适
应于基层的即时检测［28］。在检测耗时方面，Cao 和
Thongkao 等［24，25］利用 LAMP 进行核酸扩增的时间
分别是 60 min 和 90 min，而本研究建立的 LAMP-
LFD 技术，核酸扩增仅需 40 min，加上 LFD 判断结
果的时间也只需要 50 min。
4 结论
本研究以哈维氏弧菌的溶血素基因为检测靶标，
建立了 LAMP-LFD 方法。该方法可特异性检出哈维
氏弧菌，针对创伤弧菌等其他弧菌，迟缓爱德华菌、
单增李斯特菌、海豚链球菌及嗜水气单胞菌等常见
水产病原菌均无交叉反应，自模板加入后，整个检
测过程仅需 50 min 即可完成，针对细菌纯培养物的
检测灵敏度达到 1.0×102 CFU/mL 或 2 CFU/ 反应，
重复性良好，仪器需求简单，可应用于哈维氏弧菌
的基层即时检测。
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（责任编辑  狄艳红）