全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 10期
哈维氏弧菌胞外蛋白酶基因的
表型克隆与序列分析
潘晓艺 沈锦玉 曹铮 尹文林 郝贵杰 徐洋 姚嘉赟
(中国水产科学研究院鱼类健康与免疫重点实验室浙江省淡水水产研究所, 湖州 313001)
摘 要: 哈维氏弧菌是引起大黄鱼疾病的主要致病菌之一, 胞外蛋白酶是哈维氏弧菌 GYC11081的主要致病因子。利
用表型克隆技术, 用 Sau3A 将提取的哈维氏弧菌基因组 DNA酶切成短片段, 纯化回收 1- 5 kb的片段与 BamH I酶切的
pUC118在 T4连接酶的作用下进行连接,并转化感受态细胞 TG1,在含 0. 5%脱脂奶和 100 g /mL氨苄青霉素的 LB平板上筛
选胞外蛋白酶阳性株, 命名为 YZ。测定阳性株 YZ的胞外蛋白酶活性 ,并对阳性株的重组质粒的插入片段进行序列测定,分
析开放阅读框, 确定胞外蛋白酶基因编码区。发现蛋白酶基因的 ORF编码 531个氨基酸,在起始密码子 ATG上游存在一个
核糖体结合位点 ( SD ) ,其上游的启动区与大肠杆菌的 70启动区和枯草芽孢杆菌的启动区高度同源。在终止子 ( TAG )下游,
存在两个反向重复序列,为推导的 2个转录终止子。哈维氏弧菌胞外蛋白酶基因的克隆与诠释为哈维氏弧菌致病机理和疫苗
的开发奠定了基础。
关键词: 哈维氏弧菌 大黄鱼 胞外蛋白酶 表型克隆
Phenotypic Cloning and Sequence Analysis of Extracellular
Protease Gene of Vibrio harvey i
Pan X iaoy i Shen J inyu Cao Zheng Y inW enlin H aoGuijie Xu Yang Yao J iayun
(K ey Laboratory of Fish H ealth and Immunology, Chinese A cademy of F ishery Science,
Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries,H uzhou 313001)
Abstrac:t A phenotypic clon ing approach was used to iso late a V ibrio harvey i cDNA encoding ex tracellular pro tease. The genom ic
DNA of V ibrio harvey i GYC11081 digested by Sau3A I and the 1- 5 kb fragm ent w as pur ified by agarose gel electrophoresis. Then the
pur ified GYC11081 DNA sam ples w ere liga ted intoBamH Idigested vector pUC118 and then electorporated into E scherichia co li stra in
TG1. It w as m a intained on LuriaBertani ( LB) m ed ium contain ing 0. 5% sk imm ed m ilk and 100 g /mL Amp at 37!C. The pos itive stra in
o f ex trace llular protease was se lected wh ich named YZ. The ex trace llu la r protease activ ity o f the strain YZ w as determ inated. DNA se
quence determ ination w as perform ed by Shangha i Inv itrogen B io techno logy Company w ith an AB I PRISM 377 DNA Sequencer. Open read
ing frame ( ORF ) of extrace llu lar pro tease gene was ana lysised. Subsequent sequence ana lysis revea led tha t the ORF o f pro tease gene en
coded 531 am ino acids, a ribosom e b ind ing s ite ( SD) in the upstream of in itiation codon ATG, and the prom oter reg ion w as hom o logous to
mo tifs o f the70 promo ter region ofE scher ich ia coli and the promo ter reg ion ofBacillus subtilis. There are two inverted repea t sequences in
the downstream o f term ination codon ( TAG ), which derive the two transcription term ina to rs. Cloning and interpreta tion o f V ibrio harvey i
extrace llu lar pro tease gene, it la id the founda tion o f the research of pathogenesis of V ibrio harvey i and the deve lopm ent of vacc ines.
Key words: V ibrio harvey i P seudosciaena crocea Ex tracellular pro tease Pheno typ ic clon ing
收稿日期: 20100317
基金项目:浙江省科技厅重点项目 ( 2005F12005 )
作者简介:潘晓艺,男,助理研究员,硕士,研究方向:水生动物病害预防与控制; Em ai:l panxiaoy@i 163. com
通讯作者:沈锦玉,研究员, Em ai:l sj inyu@ 126. com
哈维氏弧菌广泛分布于海洋和河口, 属于条件
致病菌,能引起海水鱼类及其它养殖动物发病 [ 1 - 5 ] ,
也是引起我国四大海产经济鱼类大黄鱼疾病最严重
的病原菌之一 [ 1- 3]。导致鱼体伤口感染、炎症反应
2010年第 10期 潘晓艺等 :哈维氏弧菌胞外蛋白酶基因的表型克隆与序列分析
和败血症等症状,发病率高, 流行面广, 造成经济损
失巨大。哈维氏弧菌的胞外分泌物如蛋白酶、溶血
素、几丁质酶、脂酶和磷脂酶等毒力因子在致病过程
中起到重要作用,根据先前的研究发现,哈维氏弧菌
GYC11081株的主要致病因子为胞外蛋白酶 [ 2]。
本研究旨在采取表型克隆的方法,以哈维氏弧
菌 GYC11081株基因组为材料, 获得哈维氏弧菌的
胞外蛋白酶基因,并对在大肠杆菌获得表达的胞外
蛋白酶进行酶活检测, 为哈维氏弧菌的致病机理研
究和疫苗开发奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 菌株和质粒
哈维氏弧菌 GYC11081菌株分自发病大黄
鱼 [ 3] ,由本实验室保存, 大肠杆菌 TG1由浙江大学
动物科学学院预防兽医研究所惠赠, pUC118 BamH
I/BAP质粒购自宝生物公司。
1. 2 主要试剂
T4连接酶, 限制性内切酶及 DL2000 DNA标准
分子量均为宝生物公司产品, 胶回收试剂盒购自 V
gene公司, 蛋白胨和酵母膏购自 OXO ID公司, 脱脂
奶粉购自光明乳业。
1. 3 细菌基因组 DNA
将复苏的 GYC11081转接到 200 mL含 1. 5%
N aC l的 LB培养液中摇床培养过夜, 细菌基因组
DNA的提取参照文献 [ 6] ,制备好的基因组 DNA溶
于 TE溶液中 - 20∀ 保存备用。
1. 4 基因组 DNA的 Sau 3A I酶切
将 Sau3A I酶用 50%的灭菌甘油按 1#60稀释,按
20 L体系加稀释后的酶 1 L进行酶切 GYC11081基
因组 DNA 30m in(酶浓度和酶切时间已优化 )。酶切
结束后用 1%琼脂糖电泳,用割胶试剂盒割胶回收 1- 5
kb范围酶切片段。
1. 5 连接与转化
胶回收片段通过 T4连接酶与 pUC118(BamH I
酶切并磷酸化 )连接,连接产物通过电转仪以 1. 8 kV
电激转入感受态细胞 TG1中,均匀涂布含 100 g /mL
氨苄青霉素的 0. 5%脱脂奶 LB平板上。 37∀ 培养,
筛选有透明圈的蛋白酶阳性菌落。
1. 6 阳性克隆的酶切鉴定
将周围出现透明圈的菌落转接到含氨苄青霉素
的液体 LB培养液,培养过夜后碱法小量制备质粒,
再转化 TG1选阳性菌落,直到转化后的菌落全为蛋
白酶阳性后,抽取质粒, 根据 pUC118多克隆酶切位
点, 选择不同内切酶进行双酶切, 并将阳性质粒送上
海英骏生物技术有限公司测序。
1. 7 重组菌表达的蛋白酶活性分析
将纯化的阳性菌株单菌落转接 LB培养液, 培养
18 h后, 8 000 r/m in 4∀ 离心 10m in,上清用 0. 22 m
滤膜过滤除菌;在含 0. 5%脱脂奶的琼脂平板上用自
制的打孔器打孔,将滤液按不同量加入各孔中, 30∀ ,
过夜,观察透明圈。
1. 8 序列特征和生物信息学分析
测序结果在 NCBI的 B lastn里进行同源性分析,
在 ORF Finder里进行编码区寻找,并通过使用软件
S ignalP 3. 0程序分析信号肽。使用 ExPASy站点的
ComputepI/MW程序计算相对分子质量和等电点。
2 结果
2. 1 表型克隆阳性株筛选
筛选电转后在含氨苄青霉素的 0. 5%的脱脂奶
平板上出现透明圈的菌落, 由于菌落过于密集 (图
1),具有透明圈的单菌落不易分离, 因此将透明区
域的单菌落用灭菌牙签转接到一新的氨卞青霉素脱
脂奶平板,经 37∀ 培养之后部分菌落周围出现透明
圈 (图 2) ,说明重组菌能够分泌胞外蛋白酶, 命名阳
性重组菌为 YZ。
图 1 电转后涂板 图 2 胞外蛋白酶
阳性株筛选
2. 2 重组质粒双酶切试验
根据 pUC118多克隆酶切位点, 选择限制性内
切酶 E coR I与 P st I进行单酶切和双酶切,结果发现
(图 3), 双酶切后质粒被切成 4个条带, 大小约为
3. 2 kb、2. 4 kb、1. 4 kb和 500 bp; P st I单酶切为 2
个条带,大小约为 5. 1 kb和 2. 4 kb; E coR I单酶切
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
也为 2个条带, 大小约为 6. 1 kb和 1. 4 kb。由于
pUC118质粒上分别只有一个 E coR I和 P st I酶切位
点,因此,从条带可以判断 3. 2 kb条带为 pUC118质
粒,而插入的外源弧菌基因大小约为 4. 3 kb,其含有
E coR I和 P st I酶切位点各一个。将这个插入的外
源基因分为 2. 4 kb、1. 4 kb和 500 bp 3个片段。
1. DL2000Marker; 2. E coR I与 P st I双酶切;
3. P st I单酶切; 4. E coR I单酶切; 5. pUC 118
图 3 重组质粒双酶切电泳图
2. 3 蛋白酶活性分析
将阳性株培养上清液体 (离心并过滤除菌 ), 在
含 0. 5% 脱脂奶琼脂平板的孔中分别加入 1、3、
5∃∃ 13 L的上清, 过夜消化, 观察透明圈 (图 4),
发现当加入 5 L就可以观察到透明圈。
图 4 YZ株胞外蛋白酶检测
图 5 胞外蛋白酶基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列
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2010年第 10期 潘晓艺等 :哈维氏弧菌胞外蛋白酶基因的表型克隆与序列分析
2. 4 编码区序列分析
测定的序列的 GenBank登录号为 EF126129, 序
列全长为 4 353 bp。通过 NCB I的 ORF Finder分析,
正向在 2 521- 4 113 bp存在一个长度为 1 593 bp的
开放阅读框 ( ORF)。通过同源性分析发现该开放阅
读框编码一个胞外碱性蛋白酶。阅读框的序列及其
启动区如图 5,整个 ORF编码 531个氨基酸。在起始
密码子 ATG上游的存在一个核糖体结合位点 ( SD ),
序列为 AGGA;起始密码子 ATG上游的启动区与大肠
杆菌的 70启动区和枯草芽孢杆菌的启动区高度同
源,存在一个 - 35区域 ( TTGACA )和 - 10区 ( TA
AAAAT),且两者相距 13 bp。在终止子下游, 发现存
在两个反向重复序列, 为推导的 2个转录终止子, 如
图 2所示。ORF翻译的氨基酸序列通过 SignalP 3. 0
分析发现,在 N端的前 23个氨基酸为信号肽 (图 6)。
通过 EXPASY站点的 ComputepI/MW 程序计算其等
电点为 4. 58,相对分子质量为 55. 6 kD。
图 6 SignalP 3. 0 Server信号肽预测
3 讨论
哈维氏弧菌是海水养殖鱼类重要的致病菌,其
致病因子国内外研究的较少, L iu等 [ 7]认为蛋白酶、
磷脂酶、溶血素及外毒素都可能是其主要致病因子。
Lee等 [ 8 ]用分离的哈维氏弧菌胞外蛋白酶注射对
虾,结果发现,该株哈维氏弧菌分泌的胞外蛋白酶能
够抑制对虾血凝性,并且对对虾有致死作用,确定为
该菌的主要致病因子。也是嗜水气单胞菌、鳗弧菌、
溶藻弧菌等多种主要水产动物致病菌的主要致病因
子之一 [ 9- 12]。石存斌等 [ 13]对两株致病性哈维氏弧
菌胞外产物的特性进行了分析, 发现 38 kD的蛋白
酶对鲫鱼有致死毒性。哈维氏弧菌胞外蛋白酶基因
方面的研究较少。
本研究通过表型克隆的方法,以脱脂奶作为底
物,对蛋白酶基因进行克隆筛选。基于哈维氏弧菌
GYC11081株能分泌胞外蛋白酶的特性,并根据前人
的研究成果认为,蛋白酶基因大小一般在 1- 2 kb左
右,因此对 GYC11081株基因组酶切产物割胶回收的
范围设定为 1- 5 kb; 并利用 Sau3A 产生的酶切位
点为% GATC与 BamH 的酶切位点 G% GATCC能产
生粘端连接的特点,先用 Sau3A 对 GYC11081基因
组 DNA进行部分酶切,将获得的产物与 BamH 酶切
的 pUC118质粒相连接,转化大肠杆菌进行表达、蛋白
酶活性筛选、序列测定。最终获得插入片段全长为
4 353 bp的序列,通过序列分析存在一个长度为 1 593
bp的开放阅读框 ( ORF), 编码一个 531个氨基酸长
度的胞外碱性蛋白酶,在 N末端有一段由 23个氨基
酸组成的信号肽序列。在 ORF上游存在一个强启动
子,在下游存在转录终止子。
本研究通过 GYC11081蛋白酶基因克隆表达
成功而获得了能分泌单一蛋白酶的基因工程菌株,
首次阐明了哈维氏弧菌胞外蛋白酶基因结构。这为
今后基因工程亚单位疫苗的开发提供了参考。
参 考 文 献
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(下转第 187页 )
181
2010年第 10期 刘海映等:中国对虾荧光标记虾的大规模制作与养殖试验
图 1 VIE标记的中国对虾
殖试验,取得了预期的效果。V IE标记虾和非标记
虾无论在体重和体长等生长情况基本一致, 没有显
著的差异,在成活率上基本一致,没有显著差异。红
色 V IE标记对虾效果比较理想,尽管荧光标记随着
个别对虾的生长而表现出分布的不均匀, 但 V IE保
持率仍在 70%以上,肉眼可见, 与非标记对虾有显
著的差别。若在晚上用紫外灯照射判别, 则效果
更好。
本试验研究的结果表明, 红色 V IE标记的大规
模中国对虾在室外池塘中与非标记的中国对虾生长
发育和成活率没有显著差。可以将红色 V IE标记
的中国对虾用于海洋的增殖放流研究。
参 考 文 献
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