全 文 ：·综述与专论· 2016, 32(3):31-37
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
1987 年，Ishino 等首先在 K12 大肠杆菌中发现
串联间隔重复序列［1，2］，2002 年，这种序列被命
名为成簇的规律间隔性短回文重复序列（clustered
regularly interspaced short palindromic repeats，
CRISPR）［3］。2005 年，根据几个实验室的实验结
果 推 测，CRISPR 及 其 相 关 蛋 白 CRISPR-associated
protein 9（Cas9）与细菌的免疫机制有关，可以用来
识别并降解外来的 DNA，抵抗遗传侵入［4-6］。随后
的研究证实了这一推测，CRISPR/Cas9 系统作为一
种免疫防御机制，在细菌和古细菌基因组中是广泛
存在的，可以抵抗侵入的病毒和质粒［7-11］。
酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes，Sp）来源
的 II 型 CRISPR/Cas9 系 统 利 用 核 酸 酶 Cas9， 与 两
种非编码 RNA，即 crRNA 和 tracrRNA 来锚定目标
DNA［12］。这两种非编码 RNA 可以进一步简化融合
成一段单链引导 RNA（single guide RNA，SgRNA）。
保 守 的 间 隔 相 邻 基 序（Proto-spacer adjacent motif，
PAM）位于基因组靶点的 3 端，是 Cas9 识别靶点
所必需的序列。如果 PAM 序列前 17-20 个核苷酸与
SgRNA 序列相同，那么 Cas9/SgRNA 复合体可以特
异地结合到这段特定序列上。成功结合以后，Cas9
的两个独立的核酸酶结构域将在 PAM 序列前 3 个
收稿日期 ：2015-06-02
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31401276）；青岛农业大学高层次人才科研基金（6631115025）
作者简介 ：尹珅，博士，教授，研究方向 ：生殖生物学 ；E-mail ：syin@qau.edu.cn
通讯作者 ：马俊宇，博士，副教授，研究方向 ：生殖生物学 ；E-mail ：jyma@qau.edu.cn
CRISPR/Cas9 系统的脱靶效应
尹珅  贺桂芳  赖方秾  谢凤云  马俊宇
（青岛农业大学生殖科学研究院 动物生殖与种质创新山东省高校重点实验室 青岛农业大学动物科技学院，青岛 266109）
摘 要 ： 在细菌中发现的免疫系统 CRISPR/Cas9，已经成为最有效的基因工程编辑工具，甚至大有希望可以治疗人类遗传性
疾病。但是 CRISPR/Cas9 系统在使用时会产生严重的脱靶问题，导致假表型和错误的解释。提高与靶点结合的高效率，同时减少
脱靶效应，将是今后 CRISPR/Cas9 技术的挑战。综述关注与 CRISPR/Cas9 脱靶效应相关的内容，总结了影响其靶点专一性的因素，
减少 CRISPR/Cas9 脱靶效应的可行性方法和设计工具等，供大家学习讨论。
关键词 ： 脱靶 ；靶点专一性 ；CRISPR/Cas9
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.006
Off-target of CRISPR/Cas9 System
YIN Shen HE Gui-fang LAI Fang-nong XIE Feng-yun MA Jun-yu
（Institute of Reproductive Science，Key Laboratory of Animal Reproduction and Germplasm Enhancement in Universities of Shandong，College
of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109）
Abstract: As an adaptive immune system discovered in bacteria，clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）
/CRISPR-associated protein 9（Cas9）technology has been used as the most effective genome-editing tool. By now，CRISPR/Cas9 has shown
a great promise in healing human genetic diseases，however，off-target is a critical issue while applying it. The off-target of CRISPR/Cas9
leads to the false phenotype and wrong interpretation. Optimization of on-target activity and minimizing off-target activity will be challenges
while CRISPR/Cas9 is applied in the future. In this review，we focused on the off-target related issues，including factors involved in the target
specificity，strategies and tools of minimizing the off-target of CRISPR/Cas9.
Key words: off-target ；target specificity ；CRISPR/Cas9
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.332
碱基处切断 DNA 双链，留下一个平末端的 DNA 双
链 断 裂（DNA double stranded break，DSB）。 这 种
DSB 可以通过非同源末端侵入（non-homologous end
joining，NHEJ）通路修复，也可以通过同源重组
（homologous recombination，HR）进行修复［2，13，14］。
当作用机制被研究清楚后，科学家们短短几
年就将 CRISPR/Cas9 发展为全世界最热和最有力
的基因工程工具，各种研究性文章层出不穷［15-19］。
CRISPR/Cas9 成 功 用 于 多 种 植 物 和 动 物 的 基 因 敲
除、基因插入、基因调控、基因修复和文库筛选
等，加速了农作物的改良和动物育种，甚至逐渐
走向临床应用，有望治疗人类遗传性疾病。然而
CRISPR/Cas9 并非没有缺点，它也会引起严重的脱
靶（Off-target）效应［20-22］，产生假表型和错误的解
释，有时甚至会产生严重的副作用。在应用大文库
Cas9 载体选择性筛选特定表型的时候尤其需要着重
考虑 CRISPR/Cas9 的脱靶效应，如果一个少见的脱
靶突变恰好得到了目的基因突变的表型，就会影响
整个试验的准确性。唯一真正有效的验证方法就是
对得到的突变体进行全基因组深度测序［23］。显而易
见，这对大多数实验室来说花费昂贵，且费时费力。
所以在 CRISPR/Cas9 试验开始之前，利用前人总结
的经验、设计原则来提高 CRISPR/Cas9 特异性，这
样才能最大可能获得真正想要的目地突变体，避免
脱靶效应的影响。本篇综述仅关注 CRISPR/Cas9 脱
靶效应相关问题，与大家共同探讨。
1 影响 Cas9/SgRNA 靶点专一性的因素
1.1 PAM序列
细 菌 的 种 类 不 同， 锚 定 靶 点 DNA 的 PAM 序
列也有所不同［24，25］，但所有 PAM 序列都严格位
于 靶 点 序 列 的 3 端， 被 Cas9 的 独 特 结 构 域 所 识
别［15，26］。 目 前 应 用 最 广 的 是 酿 脓 链 球 菌 Cas9
（SpCas9），PAM 典型序列是 NGG，N 可以是任何核
苷酸，没有差异。可以推测 ：如果第一位核苷酸明
确限制为 4 种核苷酸中的任何一种，那么 Cas9 识别
的目标就会减少到原来的 1/4，明显提高了识别靶点
的专一性 ；如果 PAM 序列更长一些，变成 4 位或者
5 位核苷酸，那么同样可以明显减少 Cas9 识别的目
标序列，使靶点位置更准确。值得注意的是，这种
更长的 PAM 序列提高了靶点的专一性，可以减少脱
靶效应，但同时也减少了对于目标序列的可设计靶
点数目。
1.2 Cas9/SgRNA的丰度
进行体外质粒酶切操作时，如果核酸酶浓度
过高，就会产生对质粒的错切。同样可以推测，当
Cas9/SgRNA 复合体的有效浓度增高时，Cas9 切割
的专一性就会降低。体外实验也表明，过多的 Cas9/
SgRNA 复合体存在会导致 SgRNA 错配率的增加［21］。
在细胞体内试验中，如果适当减少 Cas9 和 SgRNA
质粒转染浓度，靶点的专一性会随之增加［22］。如果
增加 Cas9 蛋白质浓度 2.6 倍，在全基因组范围，错
配数目就会增加 2.6 倍［23］。在小鼠基因组中，当恒
定 Cas9 蛋白浓度时，SgRNA 的丰度就会决定错配数
目［27］。由上可见，Cas9/SgRNA 的相对丰度可以决
定靶点的专一性。任何改变 Cas9 或者 SgRNA 表达
水平的变化都会影响脱靶数目。
1.3 SgRNA结构
对于不同的 SgRNA，错配的数目、位置差别
非常大。所以，SgRNA 除了可以引导 Cas9 结合到
特定靶点，其本身结构也可以影响对靶点的专一
性［20-22，28］。对 SgRNA 的 3 端结构区进行加长或者
缩短修饰，都会改变 SgRNA 的转录效率或者稳定性，
进而改变 SgRNA 的表达水平［24］。例如，SgRNA 发
卡结构上有 RNA 聚合酶 III 的转录终止信号（4 个连
续的 U-A 配对），将最后一个突变为 A-U 配对，改
变了原有的终止信号，从而避免 SgRNA 转录的过早
终止，增加了 SgRNA 的表达水平 ；对 SgRNA 发卡
结构长度增加了 5 bp，可以改进与 Cas9 的结合，形
成更多有效的 Cas9/SgRNA 复合体［29］。所以，改变
SgRNA 结构可以影响 SgRNA 的表达，以及 SgRNA
与 Cas9 的组装效率，从而改变了有效 Cas9/SgRNA
的丰度，对靶点专一性产生影响。
1.4 SgRNA引导序列的长度
通常 SgRNA 上的引导序列是 20 个核苷酸，与
基因组目标序列 PAM 前 20 个核苷酸序列互补形成
RNA-DNA 双链。然而，并不是增加 SgRNA 的引导
序列长度，就能提高靶点的专一性。例如，将 5 引
导序列增加到 30 个核苷酸，结果利用 Northern Blot
2016,32(3) 33尹珅等：CRISPR/Cas9 系统的脱靶效应
发现延长的 5 端在体内被剪切掉［30］。这表明长的
SgRNA 并不稳定，Cas9 蛋白只能保护大约 20 个核
苷酸长度的引导序列。并且，如果 SgRNA 引导序列
被剪短到 17-18 个核苷酸，那么靶点专一性会得到
很大提高，可能因为开始的 2-3 个核苷酸对与靶点
的结合没有帮助，反而能增加与脱靶位点结合的可
能性［31］。
1.5 种子区域序列
在细菌和哺乳动物中，PAM 近端 1-12 位碱基
发生错配就可以导致靶点切割效率的降低甚至消失，
所以 PAM 近端 1-12 位碱基可以定义为决定 Cas9 切
割效率的种子区域（Seed）［32，33］。近来试验表明
PAM 近端 1-5 位碱基序列可能是更精确的种子区
域［27，34］。尽管不同试验检测到的序列长度有所不同，
但是种子区域序列的确可以帮助决定靶点专一性。
在哺乳动物基因组中，每个 SgRNA 有数以万计的与
种子区域结合的潜在位点。例如，在小鼠基因组中
大约有一百万个 AAGGA（种子区域）+NGG（PAM）
序列，而只有一万个 CGTCG+NGG 序列，如果设计
SgRNA 引导序列时选择丰度更高的 AAGGA+NGG，
很明显会有更多的结合靶点，那么潜在的脱靶位点
也随之增高 ；如果选择丰度更低的 CGTCG+NGG，
那么就会有更高的靶点专一性［27］。
1.6 染色质特征的影响
此外，基因组 DNA 并不是简单的、敞开所有
空间结构的线性双链 DNA。在细胞不同时期，基因
组 DNA 折叠组装成染色质，进一步形成空间结构
更复杂的染色体，种子区域 +PAM 序列被包埋在内
部，因此 Cas9 蛋白与染色质种子区域序列的亲和性
（accessibility）也是必须要考虑的问题。更强的染色
质亲和性可以让 Cas9 更容易结合埋在内部的种子区
域 +PAM 序列，有一种 Cas9 的突变体，dCas9-VP64
融合蛋白能够结合染色质空间结构非开放区域序列，
并且激活转录［35］。
靶点位置序列的 CpG 岛甲基化状态也与靶点专
一性有关。CpG 岛甲基化与染色质沉默相关，更多
的甲基化状态可以降低结合力，进而影响靶点的专
一性［23］。由此也可以推测，染色质除甲基化的其他
表观遗传修饰，如组蛋白乙酰化程度也能影响靶点
的专一性。
上面总结的影响 Cas9/SgRNA 靶点专一性的因
素很可能是不完整的和偏差的，很多试验只能发现
一小部分的错配位点或预测的假阳性结果，只有多
项试验结果结合在一起才可能对影响靶点专一性的
因素有更广泛和更深入的理解。例如，染色体免疫
共 沉 淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP） 方
法检测 Cas9 结合位点，配合全基因组测序可以移
除 Cas9 非依赖性的假阳性（如测序错误和 ChIP 偏
差），获得真实可靠的 Cas9 靶点。此外，由于靶点
特异性高度依赖于目标基因序列，所以小样本数量
SgRNA 也会引起偏差，这种产生偏差的试验研究所
得到的经验规则自然也是有偏差的。但是对于现在
这些试验，如 ChIP、体外筛选、全基因组测序等，
很难扩大试验规模来减少偏差，所以只有利用偏差
较少的试验来帮助进行大数量 SgRNA 的研究［23］。
因此发展高效、经济、定量评测脱靶效应的试验技
术是目前迫切需要的。利用整合酶缺陷的慢病毒载
体（integrase-defective lentiviral vectors，IDLVs） 捕
获 DSB 结合测序可能是不错的新方法。Cas9 切割可
以产生 DSB，IDLVs 可以通过 NHEJ 通路整合 DSB
进而发现全基因组切割位点［36］。同时利用没有 Cas9
或者 SgRNA 处理的细胞做严格的对照，可以帮助剔
除假阳性。
2 降低脱靶效应的可行性策略
2.1 控制Cas9/SgRNA的丰度
如上所述，任何改变 Cas9/SgRNA 丰度的策略
都会影响脱靶效应。典型的 Cas9/SgRNA 复合体都是
通过表达载体瞬时转染细胞得到的，当增加质粒浓
度或者用强启动子的时候，增加了 Cas9/SgRNA 复
合体的丰度，增加了对正确靶点的结合效率，但随
之脱靶效应也明显增加。如果降低转染的质粒浓度
或者使用弱的启动子，就会减少 Cas9/SgRNA 复合
体的丰度，这样就会增加靶点专一性，降低脱靶效
应。很明显这也会降低对正确靶点的结合效率。最
近，利用 RNA 聚合酶 II 转录系统来表达 SgRNA，
可以更好的控制 SgRNA 表达量［37］。此外，还可以
直接注入重组 Cas9 蛋白和体外转录的 SgRNA，来
代替细胞质粒转染表达方法［38，39］。由于这些外来
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的 Cas9 和 SgRNA 会很快降解，相当于降低了有效
Cas9/SgRNA 的丰度，这样也可以减少脱靶效应。
2.2 应用单切口酶活性突变体dCas9
如果对 Cas9 切割双链 DNA 结构域的关键位点
进行碱基突变，那么可以获得只能切割一条 DNA
或者没有切割能力的突变体 dCas9 蛋白［40，41］。如
果用只有一个切口酶活性的突变体 dCas9，配合一
个 SgRNA 切开一条 DNA 链，然后 dCas9 再配合另
一个 SgRNA 在相邻区域的互补 DNA 链中也只切开
一个切口，那么两条链上临近的两个切口同样会形
成双链断裂，后面的试验可以正常进行。如果一条
SgRNA 错配，只会形成一个切口，不会形成双链断
裂，很快就会被细胞修复正常。而两条 SgRNA 同时
错配，形成双链断裂的脱靶机率很小，这样就极大
地提高了靶点专一性。
类似的策略还有利用突变体 dCas9 与核酸酶
FokI 形成二聚体来降低脱靶效应。FokI 只有在形成
二聚体时才会发挥核酸酶活性切割双链 DNA［42］，
所以融合蛋白 dCas9-FokI 单体配合两条 SgRNA 才能
完成正确切割。而两条 SgRNA 在临近区域同时错配
的机率很小，所以极大地降低了脱靶效应［43，44］。
2.3 改变SgRNA的序列
改变 SgRNA 的结构和序列长度，已经被证明是
可行的降低脱靶效应的方法。例如，有一些 SgRNA
的 5 端加上 GG 可以降低脱靶效应［45］。将 SgRNA
的引导序列截短到 17-18 个核苷酸，而不是标准的
20 个核苷酸，在保证一定结合靶点效率的基础上，
也可以大大降低脱靶效应［31］。如果不考虑与靶点结
合的效率，那么应用这种截短的 SgRNA 是简易方便
的降低脱靶效应的方法。
2.4 新品种Cas9蛋白
SpCas9 蛋白是最早研究和应用最广的 Cas9，现
在其他菌株中的 Cas9 也开始被鉴定并应用到基因工
程中。利用新菌株中的 Cas9 替代 SpCas9 蛋白质和
改变其蛋白质构象也会提高特异性。由于不同细菌
来源的 Cas9 蛋白质表现出不同的 PAM 序列［46］，所
以影响了对靶点的专一性，通过检测全基因组范围
的结合和切割效率，证明新的 Cas9 蛋白明显提高了
靶点专一性。还有通过体外蛋白质工程改变晶体结
构，完全有可能设计出新的高特异性的 Cas9 蛋白。
3 降低脱靶效应的设计工具
可以帮助寻找 SgRNA 潜在脱靶位点的在线工
具，见表 1。
表 1 预测 SgRNA 潜在脱靶位点的在线工具
工具 网址 参考文献
CHOPCHOP https ：//chopchop.rc.fas.harvard.edu/ ［47］
CasOT Off-Targeter http://eendb.zfgenetics.org/casot ［48］
Cas9 Design http://cas9.cbi.pku.edu.cn ［49］
CRISPR Design Tool http://crispr.mit.edu ［22］
Cas-OFFinder http://www.rgenome.net/cas-offinder/ ［50］
E-CRISP http://www.e-crisp.org/ ［51］
WTSI Genome
Editing（WGE）
http://www.sanger.ac.uk/htgt/wge/ ［52］
对于每个开发出来的设计 SgRNA 靶点的工具，
首要考虑的就是如何在基因组上避免脱靶效应，有
些工具对给出的 SgRNA 还可以提供可能的脱靶位
点［22，47-49，51］。通常用脱靶位点的数目，或者评价得
分的加权和来评估设计结果的好坏。由于这些工具
在具体算法上各自不同，预测出来的脱靶数目和位
置结果也有所差异，但在设计序列时都力求最小的
脱靶效应。例如，根据靶点位置，有的工具注重考
虑在引导过程中的单核苷酸多态性（single nucleotide
polymorphisms，SNPs） 和 二 级 结 构［49］， 对 SgRNA
选择靶点的影响［53］，或者基因组本身特点如外显子、
CpG 岛对 SgRNA 效率的影响［47，51］；有的工具包含
了已有的系统突变研究［22］，或者用户输入惩罚的数
据（E-CRISP）［51］，在定位和错配的基础上分别计
算脱靶效应 ；有的工具对脱靶效应的计算采用二进
制标准，对整个引导区（Cas-OFFinder）［50］，或者
确定的 PAM 临近和远端区域（CHOPCHOP，CasOT
off-Targeter and Cas9 Design）［47-49］，错配率小于一个
具体数值 ；有时也并不考虑错配的位置和数目，而
是用 Cas9 切割位点的效率来计算和 PAM 错配［21，
22，30］。显而易见，每种工具都有自己的优势和特色。
需要注意的是，对于研究较少的生物，研究者挑选
的设计 CRISPR/Cas9 靶点工具必须能够接受用户输
入基因组信息［48-50］，可选择替换的 PAM［47，48，50］，
这样才能得到自己的设计结果。
2016,32(3) 35尹珅等：CRISPR/Cas9 系统的脱靶效应
同 时，CRISPR/Cas9 的 试 验 目 的 也 是 一 个 重
要的考虑因素，到底是追求与靶点结合的高效性，
还是追求最小的脱靶效应。例如，如果追求的是
SgRNA 的靶点高效性，不在意脱靶效应，那么可以
使用 CHOPCHOP 这类工具［47］。如果更关注脱靶效
应，则需要使用能够定量预测脱靶效应的工具，如
CRISPR Design Tool 和 E-CRISP［22，51］，获得最小的
脱靶效应。总之，每种工具都有自己的特色，因此
在实际设计过程中，可以将几种工具结合使用，得
到自己想要的理想结果。
4 展望
尽 管 已 有 很 多 研 究， 但 是 人 们 对 决 定 Cas9/
SgRNA 靶点专一性的重要因素和规则还是了解不够，
想要准确预测结合的具体位点还是有难度的。此
外，人们对 Cas9 结合靶点之后的实际功能影响（如
切割、突变和转录干扰）之间的关系也研究得不够
深入。甚至有些证据表明大多数的 Cas9 脱靶效应是
短暂的，并且对功能的冲击很小。如转录组性能分
析表明脱靶效应对基因表达变化的影响可以忽略不
计［35，40，41］，并且理论计算值表明 Cas9 结合对随后
基因表达的影响呈指数性衰减［54］。面对争议，现在
需要的是对全基因组范围的结合、切割和转录组变
化的数据进行对比，以此来验证 Cas9 脱靶效应究竟
有多大的影响。
CRISPR/Cas9 将在很长的一段时间里作为主流
基因工程工具应用到更多的研究领域，现在所用的
减少脱靶效应的可行性方法都在一定程度上牺牲了
与靶点结合的效率。所以既要保证与靶点结合的效
率，又要降低脱靶效应，将是今后 CRISPR/Cas9 技
术研究的一个热点。
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（责任编辑 狄艳红）