全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 7期
RNA干扰非特异性研究进展
韩继波　陈晨　陈始明　陶泽璋
(武汉大学人民医院耳鼻咽喉 2头颈外科 ,武汉 430060)
　　摘 　要 : 　RNA干扰 (RNA i)靶向基因治疗是目前研究的热点 ,其依赖序列特异性的基因表达调节为生物学发展带来重
大突破。然而在应用 RNA i时所产生的一系列非特异性反应阻碍了 RNA i进一步的临床应用 ,这其中主要包括脱靶基因抑制
和内在免疫副反应等。主要从非特异性反应的产生机制、脱靶效应的预测和 RNA i非特异性的控制 3个方面对近几年研究成
果进行综述 ,探讨临床应用前景。
关键词 : 　RNA干扰 　非特异性反应 　脱靶效应 　免疫副反应
Advances of Non2spec if ic Effects on RNA i
Han J ibo　Chen Chen　Chen Shim ing　Tao Zezhang
(Departm ent of O tolaryngology and Head2N eck Surgery, Renm in Hospita l of W uhan University, W uhan 430060)
　　Abs trac t: 　A t p resent, RNA interference is being the research focus for gene therapeutic app lications1 Desp ite the excitement a2
bout this remarkable biological p rocess for sequence specific gene regulation, there are a number of p roblem s that need to be overcome
p rior to making RNA i as real therapeutic modality, which can include off2target effects and activating innate immune responses1 This
review discussed mechanistic aspects, p recaution and control of off2target effects and gave a p rospect for clinical app lication1
Key wo rds: 　RNA i　Non2specific effects　Off2target effects　 Immunostimulation
收稿日期 : 2009204230
基金项目 :国家自然科学基金面上项目 (30672313, 30872851)
作者简介 :韩继波 (19842) ,男 ,在读研究生 ,研究方向 :头颈肿瘤 ; E2mail: hjbjy7758521@1631com
通讯作者 :陶泽璋 (19542) ,男 ,教授 ,博士 , Tel: 02728804191126605, E2mail: taozezhang@ hotmail1com
　　RNA干扰以其序列特异性的优势被广泛应用
于阻断或抑制基因表达 ,这也使得它成为强大的基
因功能和基因治疗的研究工具。RNA 干扰是由
dsRNA介导的 ,它与靶基因有序列同源性 ,长双链
RNA 被导入或转染至细胞内时 , 会被 D icer酶
( RNase III endonuclease)裂解成 siRNA ( short2inter2
fering RNA ) ,然后被结合到诱导沉默复合体 R ISC
(RNA2induced silencing comp lex)上 ,引导 Ago2蛋白
( slicing p rotein A rgonatue 2 ) 裂解靶基因 mRNA。
RNA干扰存在的非特异性反应阻碍了 RNA干扰的
进一步临床应用 ,主要包括脱靶效应和免疫副反应。
RNA干扰过程中可能伴随的脱靶沉默效应 (off2target
effects,OTEs) ,主要是因为直接导入细胞或胞内由
dsRNA分解的 siRNA与胞内其它非靶正常基因存在
部分序列同源性 [ 1, 2 ]。在使用 RNA i技术识别人类低
氧诱导因子 ( hyporia2inducible factor21, H IF21)路径上 的调控因子的大规模基因敲除试验中 ,基因表达受抑制效率最高的 3个诱导因子都源于 RNA i的脱靶抑制 ,其中有两个 siRNA通过 7 nt的序列互补 ( 2AG2GCAGT2)可以直接引发诱导因子 hif21αmRNA的低表达 [ 3 ]。Tschuch等 [ 4 ]使用靶向 GFP绿色荧光蛋白基因的 siRNA进行脱靶研究 ,发现 GFP2siRNA不仅抑制 GFP基因表达 ,而且抑制很多内源性基因的表达 ,这种脱靶效应依赖 GFP2siRNA 的滴度 ,在多种细胞系均能发现脱靶抑制现象。随着 RNA i技术的广泛研究和推广应用 , siRNA在哺乳动物体内引起的另一种脱靶效应 ———免疫副作用也引起极大关注。 siRNA 的脱靶免疫副反应主要是激活天然免疫系统 ,诱导炎症因子如 IFN2α、TNF2α、TNF2β、IL26等的产生 ,引起细胞的生长抑制等毒性作用 [ 5～7 ]。 siRNA的这种脱靶效应和免疫刺激毒性极大地影响着它的体内应用 ,为 siRNA 走向
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 7期
临床带来了新的挑战。如何既避免 siRNA 对机体
免疫系统的脱靶副作用又保持 siRNA 的特异性靶
基因沉默作用 ,成为 siRNA设计的关键。
1　非特异性反应的机制
111　免疫副反应
有研究表明 ,由于 siRNA或者 shRNA都含有双
链 RNA的 stretch (11 bp )结构 ,可以激发非特异性
的细胞免疫应答反应 ,如通过与蛋白激酶 K ( PKR )
作用 , siRNA 可引起干扰素样反应 ( interferon re2
sponse)。饱和剂量的 siRNA或者 shRNA可以抑制
正常内源性 m iRNA的功能。另外 ,转染表达的 siR2
NA含有一定的基序 ( sequence motifs) ,可以作用于
细胞膜上 TLR s受体 ( toll2like recep tors)激活内在免
疫系统 ,通过 TLR3和 TLR7路径 ,引起机体免疫反
应。试验发现 ,免疫副反应大多发生在 siRNA双链
含有诸如 5′2UGUGU23′, 5′2UGGC23′或 5′2GUCCUU2
CAA23′等的序列 ,因此在设计 siRNA时应避免含有
类似的上述碱基序列 [ 7, 8 ] (图 1)。
图 1　在使用人工合成 siRNA进行 RNA i试验
时产生的非特异性反应 [ 8]
siRNA引起的毒性反应贯穿于整个干扰过程
中 ,对比针对同一基因的 siRNA产生的毒性反应 ,
发现毒性反应大小与结合到 R ISC复合体的引导链
上的 2UGGC2序列多少密切相关 [ 9 ]。
112　不完全互补导致的脱靶基因抑制
非靶基因抑制是由于 siRNA与非靶 mRNA的
部分杂交导致的部分互补配对 ,这种情况主要发生
在 siRNA引导链 5′端与非靶 mRNA有 6～8 nt的不
完全互补 ,此时 siRNA发挥类似 m iRNA的作用 ,脱
靶也发生在反义链中间区域有约 15 nt的互补
区 [ 10 ]。有研究认为 , siRNA种子区域的六聚体结构
与非靶转录体 3′UTR区域互补是导致脱靶或者非
靶基因降解的重要因素。 siRNA 的脱靶机制与
m iRNA的靶向作用相似 ,需要引导链的六聚体结构
序列 (种子区 2～7位核苷酸 )和非靶基因的 3′UTR
区严格互补配对 [ 11, 12 ]。Anderson等 [ 13 ]应用微点阵
分析转染 siRNA的细胞 ,这些 siRNA种子区域分别
含有低、中、高互补频率 ( seed comp lement frequen2
cies, SFCs) ,发现双链 siRNA含有较低的 SCFs,通
常引发较低的脱靶效应。该研究第一次试验验证得
出种子区域的低互补频率 ( low SCFs)较少引起脱靶
效应。Tschuch等 [ 4 ]发现被 GFP2siRNA抑制的脱靶
基因仅与 siRNA有 8个碱基的互补 ,而且有一小部
分并不是以前认为的必须是与非靶 mRNA的 3′UTR
区域互补 ,而是与 3′UTR区域外的序列互补 ,这提
示脱靶抑制效应并不完全依赖 siRNA 种子区域与
mRNA 3′UTR区互补。
Dahlgrenl等 [ 14 ]利用 siRNA 靶基因库与 siRNA
进行双核苷酸碱基错配 ,分析 siRNA对特定靶点的
沉默效应 ,结果显示不仅错配碱基的位置 ,而且错配
的核苷酸碱基本身的形式 ( GCAT)都对沉默产生影
响。此研究发现 ,当靶 mRNA的两个碱基发生突变
时 ,它突变后仍能在很大程度上被其原来对应的
siRNA转录后水平抑制。而当相同位置的碱基突变
发生在 siRNA的引导链上时 ,所产生的基因抑制效
应的模式与上述抑制效应不同。
RNA干扰过程中是直接裂解靶 mRNA还是转
录后抑制 ,取决于 siRNA是否与其靶 mRNA完全配
对 ,转录后抑制 (m iRNA干扰途径 )依靠 m iRNA与
靶 mRNA 3′UTR区域的不完全配对 , Ago1蛋白被认
为介导了二者的结合过程。相反 , siRNA介导的靶
mRNA降解 ,可以在与 mRNA 结合的任何部位发
生 ,由 Ago2蛋白介导 [ 15, 16 ]。
A leman[ 17 ]通过试验证实 ,当转染 siRNA 并使
Ago2蛋白 (Ago蛋白家族中惟一能催化 siRNA介导
的靶 mRNA裂解的蛋白 )低表达时 ,靶 mRNA的降
解受到影响 ,而并没有显著影响非靶 mRNA 的降
解。这提示尽管经典的 RNA干扰机制 ,即完全互补
配对 , siRNA介导 Ago2蛋白裂解靶 mRNA可以发生
82
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
2009年第 7期 韩继波等 : RNA干扰非特异性研究进展
在 siRNA和不完全互补配对的脱靶转录体之间 ,但
大多数的脱靶的 mRNA的裂解是不依赖 Ago2蛋白
的 ,是否通过类似 m iRNA路径由 Ago1蛋白介导 ,需
要进一步验证。
113　正义链介导的脱靶基因抑制
如果 siRNA 的正义链也偶然替代反义链参与
形成 R ISC,也可以引起与之互补的非靶 mRNA的降
解 ,产生脱靶效应 [ 8 ]。对于 siRNA的正义链 (非引
导链 )第 1和第 2位置上的核苷酸的 2′2O2methyl化
修饰 ,可以减少正义链进入 R ISC复合体的机会 ,从
而减少脱靶效应 [ 1 ]。
2　脱靶效应的预测
脱靶基因预测方法是寻找 siRNA 和脱靶序列
之间的非完全匹配模式。非完全匹配模式有 3种 :
G∶U摇摆、失配和凸出。脱靶基因沉默中 , siRNA
和基因序列至少有 3个碱基失配 , 典型的情况是连
续 4～5个碱基失配 , 而且尾端凸出模式很常见。
因此 , 使用传统的 BLAST来搜索脱靶基因会忽略
很多候选的脱靶基因 , 而精确的试验方法成本很
高。通过计算生物学方法能够在精度和成本之间得
到平衡 , 例如通过种子散列、归类原理和组合法来
识别 siRNA和脱靶基因之间的失配模式 , 可以迅速
找出候选的脱靶基因 [ 14 ]。
网上许多脱靶评估软件 ,如 dsCheck可以评估
长双链 RNA ( long dsRNA )是否引起脱靶效应。该
软件模拟 D icer酶 ,研究长 dsRNA所有 19 nt长度的
剪切体 ,然后运用经典的运算系统迅速列举出所有
潜在的可能的脱靶基因 ,这显著提高了与靶 mRNA
同源的其它非靶 mRNA的搜索的特异性和敏感性。
dsCheck网站不仅能对 siRNA脱靶可能性进行精确
的软件搜索验证 ,而且提供最小化脱靶效应的 dsR2
NA的设计 [ 18 ]。
而基于试验的方法则更加精确 , 像利用荧光酶
活性的敏感性可以建立一套化验方法来定量记录相
关的 RNA i功效和特异性 , 可用于任何存在脱靶效
应风险的 RNA i研究 , 并且跟随微阵列表达切面在
基因组水平监控脱靶效应 [ 19 ]。
3　RNA干扰特异性的控制
311　siRNA或 dsRNA化学修饰
Behlkt等 [ 1 ]认为对 RNA双链进行适当的化学
修饰 (图 2) ,可以提高双链 RNA 的核酸酶的稳定
性 ,减少引发机体内免疫应答反应的机率 ,降低脱靶
效应的发生率 ,还可以提高 RNA i的药代动力学效
应。这主要包括 2′2OME [ 2′2O2methyl) ] , 2′2F ( 2′2
fluoro ) , 2′2MOE ( 2′2O2( 22methoxyethyl ) , FANA
(2′2fluoro2β2D2arabinonucleotide modification) , LNA s
( locked nucleic acids)等多种化学修饰方法 ,其中
LNA s被认为可能导致细胞毒性 ,其安全性需要进一
步试验验证 [ 1, 20 ]。有研究证实 , 2′2O2methyl (2′邻甲
基磷酰化修饰 )主要是阻止 TLR7路径的免疫反应、
增加 siRNA对内源性核酸酶的耐性而提高 RNA i特
异性和干扰效率的 [ 21 ]。
磷酸二酯键和核糖基的化学修饰 ,前者包括硫磷酰化、硼烷磷酰化
和甲基磷酰化 ,后者包括 2′2fluoro、LNA、2′2O2methyl、FANA, 2′2O2
MOE [ 1 ]
图 2　对 siRNA选择性修饰
还有研究显示 ,对核苷酸特异位点的化学修饰
可以减少因 siRNA的引导链通过类似 m iRNA作用
途径而引起的 OTEs(脱靶效应 )。对 siRNA选择性
的化学修饰既可以保留 siRNA引导链的指导 Ago2
蛋白裂解把 mRNA的潜能 ,而且还可以减少 siRNA
因与同源 m iRNA具有相似的种子区而导致的类似
m iRNA作用途径的脱靶干扰效应 [ 22, 23 ]。
Jackson等 [22 ]认为对 siRNA引导链种子区域特定
位置序列的化学修饰 ,可以减少大多数与 siRNA引导
链种子区域互补而导致的脱靶基因沉默。尤其是对引
92
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 7期
导链 5′2GS端的第 2位点的核苷酸戊糖环上 2′位置甲
基磷酰化 (2′2O2methyl)修饰可显著减少脱靶沉默。
312　确定最适 siRNA浓度
有文献认为 , siRNA pool可以增加对靶 mRNA
的打击效率 ,但这样也同时加大了脱靶风险 ,因为
siRNA浓度的增加意味着与非靶 mRNA不完全互补
配对的机率增大 ,另外 , siRNA存在饱和效应 ,但达
到一定浓度后 ,额外的增加 siRNA并不能显著提高
对于靶 mRNA的抑制作用。对于体内试验 ,应当找
出沉默效率最高的最低 siRNA浓度 ,避免脱靶效应
及免疫副反应 [ 24 ]。
当 siRNA浓度高于 100 nM 时 ,通常会产生非
特异的脱靶效应 ,浓度在 20～100 nM范围内偶尔产
生 ,浓度低于 20 nM基本上不产生脱靶效应 ,目前试
验中最低有效浓度可达 10 nM ,不同的细胞系其最
低有效干扰浓度会有所不同 [ 8 ]。
313　siRNA的设计
Daniel[ 20 ]引用 U i2Tei等人观点认为 , siRNA的
序列设计满足下面的要求可以保证 RNA i具有较高
的特异性 :反义链 5′端种子区域富含 A、U碱基 ;正
义链 5′端富含 GC碱基。在设计 siRNA 时避免诸
如 , 5′2UGUGU23′, 5′2UGGC23′或 5′2GUCCUUCAA23′
等类似结构 ,可以减少 siRNA引发的免疫反应 [ 8 ]。
U i2Tei为了研究 siRNA上各位置核苷酸功能 ,将
siRNA的核苷酸用 DNA脱氧核苷酸替换 ,发现并没
有显著影响 siRNA的基因沉默功能。引导链 5′端 2
～8位的核苷酸 (种子区域 ) ;正义链上种子区域的互
补序列 ;引导链 5′末端和正义链 3′悬突 (overhang)这
3个序列可以被 DNA脱氧核苷酸替换而不影响其干
扰效应。然而靠近引导链 3′端的 2 /3的序列不能被
替换 ,主要因为此区域与 RNA 识别蛋白 TRBP2
(TAR2RNA binding p rotein)和 Ago2蛋白结合。
正义链 (passenger strand)靠近 3′末端的区域由
DNA脱氧核苷酸替换也会减少脱靶效应 (减少正义
链进入 R ISC的机会 ) ,这是因为 DNA2RNA杂化链
没有单纯的 RNA双链稳定。对 siRNA种子区域进
行 DNA 脱氧核苷酸替换修饰 ,可以明显减少因与
siRNA种子区域互补而导致的非靶基因的沉默 ,因
此设计 DNA2RNA异源嵌合体可有效沉默靶基因而
减少脱靶效应 [ 25 ]。
4　展望
由脱靶效应产生的意外的基因调控和免疫副反
应成为 RNA i技术研究、治疗和诊断的一个主要障
碍 ,但 RNA i技术的迅速发展和优势有目共睹。随着
对 RNA i过程中脱靶效应的机制的不断了解 ,通过高
效特异的 siRNA 序列设计和化学修饰 ,可以既保持
或增强靶基因的特异性沉默效果 ,又避免 siRNA诱
导的免疫刺激和脱靶基因抑制作用 ,将为 RNA i更加
安全有效地应用于临床开辟更广阔的前景。
参 考 文 献
1　 Behlke MA1 O ligo Nucleotides, 2008, 18: 305～3201
2　 Aagaard L, Rossi JJ1 Adv D rug Deliv Rev, 2007, 59 ( 2～3) : 75
～861
3　 L in XY, Ruan XA, et al1 Nucleic Acids Research, 2005, 33
(14) : 4527～45351
4　 Tschuch C, Schulz A, et al1 BMC Molecular B iology, 2008, 9: 601
5　 Morrissey DV, et al1 Nat B iotechnol, 2005, 23 (8) : 1002～10071
6　 Hornung V, et al1 NatMed, 2005, 11 (3) : 263～2701
7　 Marques J, et al1Nat B iotechnol, 2005, 23 (11) : 1399～14051
8　 Cullen BR1 Nature Methods, 2006, 3 (9) : 677～6791
9　 Fedorov Y, Anderson EM, et al1 RNA , 2006, 12: 1188～11961
10　W atts JK, et al1D rug D iscovery Today, 2008, 13 ( 19 /20 ) : 844
～8491
11　B irm ingham A, et al1 Nature Methods, 2006, 3 (3) : 199～2031
12　Jackson AL, Burchard J, et al1 RNA, 2006, 12: 1179～11871
13　Anderson EM, B irm ingham A, et al1 RNA, 2008, 14: 853～8611
14　Dahlgren C, et al1 Nucleic Acids Research, 2008, 36 ( 9 ) : 4752
～47551
15　Rossi JJ1 Nature Cell B iology, 2005, 7 (7) : 643～6441
16　Jean2FranÔois Rual, et al1 BMC Genom ics, 2007, 8: 106～1091
17　A leman LM, Doench J, Sharp PA1 RNA, 2007, 13: 385～3951
18　Yuki Naito, Tomoyuki Yamada, et al1 Nucleic Acids Research,
2005, 33: 589～5911
19　N icola Smart, et al1 B iol Proced, 2005, 7 (1) : 1～71
20　Daniel De Paula, Bentley LB1 RNA, 2007, 13: 431～4561
21　W hitehead KA, Langer R, Anderson DG1Nature Reviews D rug D is2
covery, 2009, (8) : 129～1361
22　Jackson AL, Burchard J, et al1RNA, 2006, 12: 1197～1201
23　O la SnФve J r, et al1Acs Chem ical B iology, 2006, 1 ( 5 ) : 274
～2761
24　O la SnФve J r, et al1B iochem B iophys Res Commun, 2004, 32 (5) :
769～7731
25　Kum iko U i2Tei, et al1 Nucleic Acids Research, 2008, 36 (7) : 2136
～21381
03
© 1994-2011 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net