全 文 ：第26卷第4期
2007年8月
生态
Ecological
科学
Science
26(4)：298·302
Aug．2007
外来入侵植物空心莲子草几丁质酶特性研究
朱芳艳，许善峰，沈云霞，周 倩，顾新州，杨生妹p
扬州大学生命科学与技术学院生物化学教研室，江苏扬州225009
【摘要】 外来入侵植物空心莲子草因其强抗逆性而迅速蔓延，成为有害杂草。拟研究其病程相关蛋白——几丁质酶酶
学性质，为探讨该植物的抗逆机理和入侵机制提供理论依据。空心莲子草经乙烯利处理后，其叶片蛋白质提取液在4℃
经40～60％饱和硫酸铵溶液沉淀，SephadexG．75洗脱后得几丁质酶液。结果表明：空心莲子草几丁质酶最适反应pH为
5．7左右，在pH4．0～8．0均表现稳定，当pH小于4．0和大于8．0时酶活力丧失50％以上，在pH2．0和10．0时没有活力；
在30℃．80℃范围内，酶均具较高活性，最适反应温度为70℃左右，温度高于80℃后，酶稳定性下降；当底物浓度小于
1．25％时，酶活力随底物浓度的增加而增加，在底物浓度大于1．25％浓度时，活力增加的趋势减缓。结果提示：也许空心
莲子草的强抗逆性是因为其几丁质酶具较高的温度耐受性和较大的pH作用范围。
关键词：空心莲子草；几丁质酶：酶学性质
中图分类号：X173 文献标识码：A 文章编号：1008—8873(2007)04．298．05
Characterizationofchitinaseofanalieni vasivewe d--Alternantheraphiloxeroides
(Mart．Griseb．)
ZHUFang．yah，XUShan．feng，CHENYun．xia，ZHOUQian，GUXin．zhou，YANGSheng．mei’
CollegeofBiosciencesandBiotechnology,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China
Abstract：Becauseofits trongresistancetoenvironmentalstresses，Alternantheraphiloxeroides，anlieni vasiveplant，hasfast
becomea s verew edinChina．Inordertoexplorethmechanismofitsstrongresistancedinvasiveness，westudiedthe
propertiesofitschitinase，oneofthepathogenesis-relatedproteinsinplant．Theproteinwasextractedfromtheleavestreatedby
ethylene，precipitatedwith40～60％ammoniumsulfatendisolatedbySephadexG-75chromatography．Anenzymaticssay
showedthatheoptimumpHforthisenzymewasabout5．7anditwastableintherangeof4．0to8．0pH．Itwouldossmore
than50％ofitsactivitywhenpHwaslowerthan4．0orhigherthan8．0andalmosthadnoactivitywhenpHwas2．0or10．0．It
hadhighendurancetowiderangeoftemperaturesanditsactivitywashighfrom30。Cto80。C．Itsoptimumtemperaturewas
about70。Canditbegantolossitsactivitywhentemperaturewashigherthan80"C．Itwasalsofoundthatthereactionvelocityof
thisenzymeincreasedwitheincreaseofits ubstrateconcentrationwhentheconcentrationw slowerthan1．25％．Allofthese
suggestedthathighenduranceofthisnzymetotemperaturendacidityoralkalinitym ghtavecontributedtoAlternanthera
philoxeroidsstrongre istanceoenvironmentalstresses．
Keywords：alternantheraphiloxeroides；chitinase；propertiesofenzyme
收稿日期：2007．05．09收稿，2007，07．20接受
作者简介：朱芳艳(1982--)，女，在读硕士研究生。主要从事外来入侵植物生物化学方面研究。
+通讯作者(Correspondingauthor)，E-mail：yang_=s睁otmail．com
万方数据
4期 朱芳艳，等：外来入侵植物空心莲子草几丁质酶特性研究 299
1引言(Introduction)
空心莲子草陋lternantheraphiloxeroides
(Mart．)Griseb．1(又称水花生)，为苋科莲子草属
多年生草本植物⋯，原产于南美洲。该植物自20世
纪30年代引入我国后迅速蔓延，现已对农业、园艺、
养殖业和交通运输等造成严重的后果【2’3J。多方面的
研究证明，该植物之所以迅速蔓延成为入侵植物，
主要是因为其强大的抗逆性。它能利用营养体(根、
茎)进行无性繁殖。当温度降至O℃时，其水面或
地上部分已冻死，但当温度回升至10℃时，水下
或地下根茎即可萌发生长；茎段曝晒1～2d仍能
存活[4]；且在人为干扰下(受伤)，其营养繁殖更加
旺盛，而不似其它植物会因伤处病菌感染而死亡【5】。
因此，阐明空心莲子草的抗逆机理，对有效控制该
植物蔓延有非常重要的意义。
植物抗逆性包括植物对外界各种胁迫因子的耐
受及反应。植物对不同的因子有不同的对抗机理，
如它们在受到病原菌侵染时常产生一类病程相关蛋
白(pathogenesis—relatedproteins，简称PR蛋白)以
抵御病原菌的扩散。几丁质酶是植物体内重要的抗
菌RP蛋白之一【6J。
几丁质是多数真菌细胞壁及昆虫一些组织的组
成成分[7】，它是N．乙酰．D一葡萄糖胺以B一1，4一糖苷键
连接的线性多聚物。植物体内的几丁质酶分为组成
型和诱导型两类。几丁质酶能水解B一1，4．N一乙酰一葡
萄糖胺线性同聚物。所以，几丁质酶可以降解病原
真菌细胞壁中的几丁质，破坏细胞新物质的沉积，
致使病原体死亡，同时产生的细胞壁碎片又有诱导
作用，从而刺激寄主植物的抗病反应瞵J。Schlumbaum
等【91已报道菜豆几丁质酶具有抗真菌活性。王海波
等【10】发现豇豆几丁质酶有抑制昆虫生长的作用。因
此，植物体内几丁质酶活性的强弱与其抗逆性有密
切的关系，阐明植物体内几丁质酶的活性、作用特
征及其抗菌谱，是研究植物抗逆机制的必要前提。
本文拟提取分离空心莲予草几丁质酶，并分析
其酶学特征，为其纯化及分子生物学特征研究奠定
基础，同时也为进一步探讨该外来入侵植物的抗逆
机理和入侵机制提供理论依据。
2材料与方法(Materialsandmethods)
2．1材料
2．1．1空心莲子草：室内栽培。
2．1．2几丁质：由南通兴成生物制品公司赠送。
2．1．3SephadexG一75购于sigma公司。其他化学试剂
均为国产试剂，分析纯标准。
2．2方法
2．2．1空心莲子草的室内栽培
采扬州大学植物生理试验田耕作层土壤，装盆前
过筛混匀，高温灭菌。土壤含有机质、速效磷、速效
钾及钙等。装入容积为10cm×5cmx5cm的塑料盒，
每盒装土1kg。空心莲子草采用营养繁殖，每盒均匀
放置地下茎6节。植株生长期间，温室常规管理，不
定期防虫，松土。待植株生长一定时间后，进行乙烯
利诱导处理。
2．2．2乙烯利诱导
0．032％乙烯利溶液喷洒空心莲子草叶片至叶片
挂满水滴，持续喷洒三天。
2．2．3胶状几丁质制备
1 g几丁质放入研钵，加少量丙酮研成糊状后，
加入400ml浓盐酸，全部溶解成凝胶状时加入50％
的乙醇溶液，不断搅拌，待胶状几丁质沉淀之后，去
除上清液，沉淀放入透析袋，用蒸馏水低温透析过夜，
最终浓度定为1％。
2．2．4酶提取
(1)取100g乙烯利处理后的空心莲子草叶片，粉
碎，用O．5mmol·U。(pH7．6)的Tris-HCLnmmol—LEDTA，
2mmol·L。113-巯基乙醇，10mmol·L。1抗坏血酸，
I％PVP)缓冲液匀浆，于4"C抽提，过夜，两层纱布
过滤，1l000r．min。1离心30min，取上清。
(2)饱和硫酸铵溶液沉淀：40％硫酸铵饱和度
的溶液沉淀蛋白提取液，1l000r．min。1离心10min，
取上清，再用60％硫酸铵饱和度的溶液沉淀上清，离
心收集沉淀，缓冲液溶解，制得粗酶溶液。
(3)SephadexG-75凝胶过滤：装柱(500x20mml，
用0．5mmol·L一(pH7．6)的"Iris．HCI溶液平衡
SephadexG．75后，上样，pH7．6的O．5mmol·L。秭s．HCI
万方数据
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缓冲溶液洗脱，流速为ImL·rain～，每2min收集1活力。结果表明，在pH5．7时酶活力最高(图2)。
管，收集目的蛋白峰。
2．2．5几丁质酶活力测定(DNS法)
几丁质可被水解为N．乙酰一D一葡萄糖单体，单体
与3，5一二硝基水杨酸共热反应生成有色化合物，在
540nm处有最大吸收值。精确吸取适当稀释的待测
酶液0．2mL加入一定pH缓冲液1mL，加入1％胶状
几丁质0．2mL，在50℃水浴60min，沸水浴终止反
应，加入0．1mLDNS试剂，煮沸5min。一个酶活
力单位(U)被定义为在504C下每小时释放出相当于
1ugN．乙酰．D．葡萄糖的还原糖所需要的酶量。
2．2．6酶学性质测定方法
见何忠效主编《生物化学实验技术》⋯】。
3结果(Results)
3．1SephadexG．75柱层析
如图1所示，测定洗脱液在280nm处的吸光
值，在20管和50管附近出现两个吸收峰。酶活力
测定表明，第23号管中蛋白质的酶活力最高，说明
几丁质酶主要在第一洗脱峰中。
——紫外吸收值Lr7absorbanee+酶埒力enzymeactivity
p
o
嘎。
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1 8 1522293643505764
洗脱体积volune(mL)
图1SephadexG-75柱层析及几丁质酶活性测定
Fig．1SephadexG-75chromatography．andtheassayedof
chitinaseactivity
3．2最适反应pH
分别在pH3．0、3．8、4．2、4．6、5．0、5．4、5．7、
6．2、6．6、7．0及7．8的缓冲溶液中测定)L-I“质酶酶
詈
{
客
晷
宕
曩
姆
龌
l 3 5 7 9 ll
DH
图2 pH对几丁质酶活力影响
Fig．2EffectsofpHontheactivityofchitinase
3．3pH稳定性
酶在pH2．0、3．0．、4．0、5．0、6．0、7．0、8．0、9．0
及10的Tris—HCL缓冲溶液中分别放置120min后，
将pH调至5．7，50℃测定不同pH条件下剩余酶的相
对活力。
结果如图3所示，pH在4～8之间时，几丁质酶
比较稳定，小于4和大于8时活力的损失大于50％，
在pH2和10时没有活力。
营
．≥
录董
运葺
避奇
靛矗
罂．兰
羔
2
2 3 4 5 6 7 8 9 1011
pH
图3pH对几丁质酶稳定性的影响
Fig．3EffectsofpHonthestabilityofchitinase
3．4最适反应温度
将新配制的酶液在pH5．7的Tris-HCL缓冲溶液中
于不同温度下测定酶活力。结果如图4：在50～80℃
∞
∞
∞
∞
∞
∞
∞
∞
o
8
7
6
5
4
3
2
l
加
∞
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∞
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钙
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尬
协
∞
，
万方数据
4期 朱芳艳，等：外来入侵植物空心莲子革JL-]一质酶特性研究 30l
30 40 50 60 70 80 90100
温度Temperature(℃)
图4几丁质酶最适反应温度·
Fig．4Effectof emperatureon heactivityofehitinase
时酶活较高，70。C时几丁质酶活力最高。
3．5温度稳定性
将新配制的酶液在pH5．7的Tris—HCL缓冲溶液
中于不同温度下放置120min，然后在50℃测定剩余
相对酶活力。结果如图5，几丁质酶在30～80。C时均
比较稳定。
浓度时，活力增加的趋势减缓(图6)。
0．2504 0．5 0．750．9 l 25 1．5
底物浓度Sustrateconcentrate(％)
图6反应底物最适浓度
Fig．6Effectofsustrateconcentrateontheactivityofchitinase
4讨论(Discussion)
在自然状态下，空心莲f草几丁质酶含量很低，
几乎测不出活性。用乙烯利处理后，几丁质酶活性迅
速提高，说明空心莲子草几丁质酶为诱导型酶。乙烯
利释放出乙烯气体，乙烯诱导几丁质酶机制不是很清
楚。有报道推测乙烯的释放与植物机体的防御机制有
关f12】。
从不同植物中提取的几丁质酶具不同的性质。空
心莲子草JL-]-‘质酶的最适pH在与豆科叶片几丁质酶
基本一致【l3‘。大多数植物的几丁质酶在60℃下都较
稳定，而空心莲子草几丁质酶最适反应温度为70℃，
在80℃时仍具较高的酶活性，这在植物中为首次发
现。已有报道中，只发现微生物中的激烈热球菌几丁
质酶，在90～100。C还具正常水解反应【l引。空心莲子
草几丁质酶的耐热性是否与它的抗逆机理有关还需
进一步的研究。
30 40 50 60 70 80 90 参考文献(References)
温度Temperature(℃)
图5温度对几丁质酶稳定性的影响
Fig．5Effectofemperatureonthestabilityofchitinase
3．6最适底物浓度试验
分别配制0．25％、0．50％、O．75％、1％、1．25％胶状
几丁质，在50。C时反应60分钟，测定酶活力。结果
表明：底物浓度越大，酶活力越高，但当大于1．25％
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5．附表：①附表应使用三线格式(包括顶线、底线和栏目线)②全表共用单位可加括号编排在表的右上方。
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③表中量和单位应按GB3101．93的规定标示，即量符号与单位问用斜线隔开。例如：时间及其单位写为：
“t／min”，浓度及其单位写为“c／(mol·L-1)”。④表注放在表格底线以下。表注的序号宜用小号阿拉伯数字并加
半圆括号置于被注释对象的右上角，女l：lxxx"；也可用星号“"标注。⑤表中所有文字信息都要求英文对照。
6．附图：附图需另页排版，并在正文中保留图位(用一空行表示)和中英文图题。对附图的具体格式要求见
另文。
7．外文学术名词的中译：外文学术名词的中译使用通用的译法，译名在文中首次出现时应在括号内注明原文。
万方数据
外来入侵植物空心莲子草几丁质酶特性研究
作者： 朱芳艳， 许善峰， 沈云霞， 周倩， 顾新州， 杨生妹， ZHU Fang-yan， XU Shan-feng
， CHEN Yun-xia， ZHOU Qian， GU Xin-zhou， YANG Sheng-mei
作者单位： 扬州大学生命科学与技术学院生物化学教研室,江苏扬州,225009
刊名： 生态科学
英文刊名： ECOLOGICAL SCIENCE
年，卷(期)： 2007,26(4)

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