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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(6):250-257
收稿日期：2015-12-15
基金项目：国家自然科学基金项目（31370574，31300494），湖北省教育厅科学研究计划资助项目（Q20131402），湖北工业大学高层次人才
基金资助（BSQD12037），绿色轻工材料湖北省重点实验室开放基金［省重点实验室科（2013）2 号 - 面上］
作者简介：吴晨曦，男，硕士，研究方向：植物纤维资源化学；E-mail ：wuchenxi276@163.com
通讯作者：谢益民，男，教授，博士生导师，研究方向：植物纤维资源化学；E-mail ：ppymxie@163.com
DHP-半乳糖复合体制备多孔生物载体及其在人体肝细
胞培养中的应用
吴晨曦1  谢益民1，2  叶哲孜1  王鹏1，2  乐喜1
（1. 湖北工业大学制浆造纸工程学院，武汉  430068 ；2. 湖北工业大学绿色轻工材料湖北省重点实验室，武汉  430068）
摘 要 ： 为了使木素脱氢聚合物（DHP）与人体肝细胞之间有更好的生物相容性，使用 DHP 和 D-半乳糖进行接枝共聚，通
过水凝胶的方法制备医用多孔生物载体。利用红外光谱、核磁共振波谱、比表面积测定仪及扫描电子显微镜对多孔生物载体的主
要成分含量、物理和化学结构以及表面形态进行分析，并对体外培养中的肝细胞形态与代谢活性进行检测。结果表明，以 DHP 与
D-半乳糖的接枝共聚产物作为原料可以制备性能良好的多孔生物载体，比表面积为 6.013 m2/g。使用此多孔生物载体对人体肝细胞
进行培养，人体肝细胞能够健康地附着在 DHP 多孔生物载体上生长增殖。根据含半乳糖的生物载体白蛋白分泌和葡萄糖代谢结果，
最大值分别为 ：9.85 g /（d·L）、16.134 mmol /（d·L），说明肝细胞在培养阶段中具有较高的代谢活性，DHP 与 D-半乳糖的接枝共
聚产物制备的多孔生物载体具有良好的生物相容性。
关键词 ： DHP ；生物载体 ；人体肝细胞 ；细胞培养 ；生物相容性
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.037
Preparation of Porous Biological Carrier with DHP-galactose Complex
and Its Application in Culture of Human Hepatocytes
WU Chen-xi1  XIE Yi-min1，2  YE Zhe-zi1  WANG Peng1，2  LE Xi1
（1. School of Pulp & Paper Engineering，Hubei University of Technology，Wuhan 430068 ；2. Hubei Provincial Key Laboratory of Green
Materials for Light Industry，Hubei University of Technology，Wuhan 430068）
Abstract:  In order  to enhance  the biocompatibility of dehydrogenation polymer（DHP）with human hepatocytes，the DHP was 
copolymerized with D-galactose，by which a porous biological carrier  for medical use was prepared using  the method of hydrogel. Fourier 
transform infrared spectrometer（FT-IR），nuclear magnetic resonance（NMR）spectroscopy，BET specific surface area determination，and 
scanning electron microscope（SEM）were applied to elucidate the main composition，chemical and physical structure，and morphology of the 
porous biological carrier. Inverted microscope and albumin and glucose kits were used to check the morphology and metabolic activity of cultured 
hepatocytes. The results  indicated  that  the porous biological carrier with excellent performance was prepared with co-polymer of DHP and 
D-galactose as raw material，and the specific surface area was 6.013 m2/g. The human hepatocytes healthily adhered on the porous biological 
carrier to grow and proliferate while the carriers were used to culture human hepatocytes. The maximum values of albumin secretion and glucose 
consumption using biological carrier containing galactose were 9.85 g /（d·L）and 16.134 mmol /（d·L），respectively，demonstrating that 
the hepatocytes presented high metabolic activity during culturing，and the porous biological carrier prepared with DHP-galactose complex had 
a great biocompatibility.
Key words:  DHP ；biological carrier ；human hepatocytes ；culture ；biocompatibility
2016,32(6) 251吴晨曦等：DHP-半乳糖复合体制备多孔生物载体及其在人体肝细胞培养中的应用
肝脏是人体的重要器官，它是人体的物质代谢
中心，负责人体的代谢、排毒、循环调节身体的功能。
然而肝脏疾病对人体危害极大甚至导致死亡，威胁
着人类的身体健康，肝组织工程支架材料已经成为
了医学与科学领域的一个重要研究。肝组织工程是
一门新兴学科，其核心是使肝细胞与生物载体材料
形成三维体外活体组织，以病损组织重建或永久替
代［1］。根据来源不同，可将原材料分为天然高分子
材料和人工合成高分子材料［2，3］。
木素碳水化合物（lignin-carbonhydrate complex，
简称 LCC）是由木素和聚糖通过共价键形成的不均
一高分子，是良好的生物材料［4，5］。李金玲等［6］发现，
LCC 具有良好的动物细胞相容性，所含聚糖部分具
有细胞识别能力，能与细胞上的糖受体发生吸附［7］。
然而，动物细胞对木素与多糖的亲和性不同，天然
LCC 具有一定局限性，若能够使用木素脱氢聚合物
（dehydogenation polymer，简称 DHP）及其衍生物与
聚糖进行聚合，将能够灵活的满足不同细胞需求。
1960 年，Ferudenberg 等［8］对木质素的合成进
行了研究，使用松伯醇合成一种叫做脱氢聚合物的
人工合成木素，它的结构与天然木质素的结构十分
相似。1995 年，Terashima 等［9］将甘露糖和果胶视
为碳水化合物与木质素进行复合，以松伯醇葡萄糖
苷作为木质素的前驱化合物在过氧化物酶体系下合
成了 DHP 与多糖的复合体，这种复合体的结构与磨
木木质素结构相似。 Seo 等［10］利用木材聚半乳糖
葡萄糖甘露糖侧链上的半乳糖单元，使肝细胞能够
在基质上良好的粘附并形成肝细胞聚集体。肝细胞
是一种依赖贴壁性的细胞，其表面存在去唾液酸糖
蛋白受体（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）［11］，
又称为半乳糖受体，主要表达与肝细胞表面，可以
与半乳糖产生特异性作用。采用 DHP 与 D-半乳糖
复合制备多孔生物水凝胶［12］载体，可以模仿天然
LCC 在细胞培养中的应用，其具有一定的溶胀率［13］，
可以提高载体的比表面积并使载体孔隙增大，有利
于营养物质的传输和代谢物质的清理，肝细胞在孔
内生长也能受到保护，更接近于正常形态。良好的
生物相容性及三维结构，使体外培养时细胞形态和
培养环境更加接近体内状态［14，15］，代谢活性比单层
培养细胞有所提高［16，17］。
本研究利用人工合成的 DHP 与 D-半乳糖为原
材料，通过与缩水甘油醚的交联形成 DHP-半乳糖
复合体，制备具有网状结构的多孔生物载体水凝胶。
利用红外光谱分析仪、核磁共振波谱仪和孔隙率测
定仪测定载体化学结构及多孔性能，并对体外培养
中肝细胞代谢活性进行检测，旨在解决天然 LCC 制
备生物载体中糖的种类与含量不可控的问题。
1 材料与方法
1.1  材料
醋酸钠、醋酸、过氧化物酶、乙醇、二甲基亚砜、
磷酸盐缓冲液、聚乙二醇缩水甘油醚；白蛋白试剂
盒、葡萄糖试剂盒，南京建成生物研究所；胎牛血清，
杭州四季青公司；RPMI-1640 培养基，赛默飞世尔
生物化学制品有限公司；胰蛋白酶消化液，谷歌生物；
人体肝细胞 L-02，武汉原生原代生物医药科技有限
公司。
FT-IR 型红外光谱仪 Thermofisher Nicolet 6700
型；冷冻干燥机 Labconco 195 型；扫描电子显微镜
JSM-5610LV，日本电子株式会社；紫外可见分光光
度计 Shimadizu UV-2550 型；全自动比表面和孔隙度
分析仪 BELSORP-Mini Ⅱ型。
1.2  方法
1.2.1  DHP 多孔生物载体材料的制备 
1.2.1.1  人工合成 DHP  将松柏醇 -β-D 葡萄糖苷溶
解在醋酸钠 / 醋酸缓冲溶液（pH4.6）中，在无菌条
件下将含有辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶和 β-葡
萄糖苷酶的混合溶液加入三口瓶中，使用恒流泵将
松柏醇 -β-D 葡萄糖苷溶液滴加到含酶的缓冲溶液
中，三口瓶始终保持无菌状态在恒温水浴锅（30℃）
中，并持续经过活性炭和棉花净化通入空气，当松
柏醇 -β-D 葡萄糖苷溶液滴加完后，等待反应 1 d 后，
继续加入酶的混合溶液，继续反应 7 d。反应结束后
将溶液离心分离，保留固体物质，使用蒸馏水清洗
固体物质 5 次以上保证将残留的酶、水溶性的 LCC
以及未参加反应的起始物清洗干净，冷冻干燥后得
到粗产物，向粗产物中加入二氯乙烷 /乙醇（2/1，V/V）
溶液，室温下搅拌 4 h 后离心分离，收集溶解部分
在 40℃下旋转蒸发，将所得的固体残留物放入减压
真空干燥箱中干燥 2 d 得到 DHP。
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1.2.1.2  DHP-半乳糖复合体及多孔生物载体制
备  将 50 mg DHP 与 100 μL NaOH（3.3 mol/L）放入
小试管中，利用磁转子进行混合搅拌 4 h 后，向试
管中添加 100 μL 聚乙二醇缩水甘油醚，含糖载体需
再加入占总组分 1%的 D-半乳糖，搅拌均匀后封口，
放入 50℃水浴锅中反应 24 h 后接枝共聚成为 DHP-
半乳糖复合体，并得到成型的水凝胶材料，其具有
一定强度。使用蒸馏水对水凝胶进行浸泡，每 12 h
更换一次蒸馏水，直至蒸馏水澄清且 pH7，可将水
凝胶材料取出。放入冷冻干燥机脱水 24 h 后取出，
两种多孔生物载体制备完成。将载体于 -20℃条件下
进行保存，以供后续实验使用。
1.2.2  生物载体的化学结构表征 
1.2.2.1  比表面积和孔隙度分析  采用 BELSORP-
Mini Ⅱ型全自动比表面积和孔隙度分析仪对多孔生
物载体的比表面积和孔结构进行分析，将载体样品
于 250℃预处理 4 h，然后在 -198℃条件下使用 N2
吸附与脱附，测定样品在不同 P/P0 下 N2 的凝聚量，
得到样品的吸脱附曲线与孔径分布曲线，从而得出
样品的比表面积，并通过电镜图观测多孔生物载体
的孔隙度。
1.2.2.2  红外光谱分析  取 2 mg 多孔生物载体材料
样品与 300 mg 的无水 KBr 混合，研磨均匀后，取
少量倒入压片模具中压片，采用 Thermofisher Nicolet
公司6700型红外光谱仪用透过法测定FT-IR光谱图。
1.2.2.3  多孔生物载体的糖分析  取多孔生物载体
样品 50 mg，移入小试管中，加入 72%硫酸 500 μL，
搅拌均匀后在常温下水解 60 min，将水解液移至
250 mL 灭菌瓶中，加入洗涤水及蒸馏水 14 mL，将
酸稀释至质量分数为 4%。将灭菌瓶移入高压灭菌锅
中，在 121℃下灭菌 45 min。采用质量恒定的 G3 砂
芯坩埚抽滤，取滤液 3 mL，使用 BaCO3 调节 pH 值
至 7，使用 0.22 μm 微孔滤膜过滤，使用 HPLC 对
过滤后的液体进行测试。HPLC 分离条件：色谱柱
Aminex HPX-87P 300 mm×7.8 mm ；柱温 85℃；蒸
馏水流动相；流速 0.6 mL/min ；最大压力 10.3 MPa，
检测器为差示折光检测器；进样量 20 μL。
1.2.2.4  固体 13 C NMR 分析  采用 Bruker 公司的
AVANGE DRX-500 超导核磁共振波谱仪，在 100.6 
MHz 下对多孔生物载体进行 13 C 连续扫描，得到样
品的固体 13 C NMR 谱图。实验条件：温度 300 K，
氘带 POM（聚甲醛）转子（转速 6.0 kHz），3 ms 接
触时间，0.05 s 接受时间，脉冲宽度为 12.8 μs，脉
冲迟滞 3 s。每个样品扫描越 3 000 次以提高信噪比。
1.2.2.5  扫描电子显微镜（SEM）分析  将体外培
养后的多孔生物载体收集，使用锇酸后固定技术，
使附着在载体表面的肝细胞产生良好的的反差，继
续使用梯度乙醇（50%，60%，70%，80%，90%，
100%）脱水，真空干燥后将固定好的多孔生物载体
材料置于硅片上，真空喷溅金离子，用扫描电子显
微镜观察多孔生物载体材料的表面形态结构。
1.2.3  生物载体材料在人体细胞体外培养中的应用
1.2.3.1  人体肝细胞 L-02 的培养  各取含糖与不含
糖多孔生物载体 15 mg 在电热烘箱中 170℃，灭菌 2 
h。将人体肝细胞按照 1×105 个 /mL 接种在加有多
孔生物载体的 6孔培养板中，每个孔中加入 1 mL 的
RPMI-1640（含 20% 的新生胎牛血清）培养基，放
入 37℃，5% CO2，100%湿度的 CO2 培养箱中培养。
每 24 h 更换一次培养液，并用倒置相差显微镜观察
每天的细胞形态和细胞在生物载体表面的粘附情况。
1.2.3.2  细胞计数  在人肝细胞 L-02 培养的第 1-6
天，在超净工作台上，每天分别取出实验组与对照
组的代谢液，之后用 2 mL 的磷酸盐缓冲液（PBS）
冲洗孔洞 2次，用 2 mL 0.25% 的胰蛋白酶消化液消
化 8 min，弃去消化液，加入 1 mL 的 RPMI-1640（含
20% 的新生胎牛血清）培养基终止消化，并将细胞
从孔壁上吹打下来制备成细胞悬液。取 200 μL 细胞
悬液，加入等量的 0.4% 台盼蓝溶液染色，使两者混
合均匀，然后吸取适量混合液于细胞计数板上，在
倒置显微镜下数出四大格中被染色的细胞的数量，
按公式计算出细胞总数。
1.2.3.3  代谢活性的检测  利用溴甲酚绿法测定白
蛋白含量。取 10 μL 蒸馏水、白蛋白标准样（34.8 
g/L）和实验过程中每天收集的细胞代谢液，分别加
入小试管中，每个试管中都滴加 2.5 mL 溴甲酚绿溶
液，室温下混匀反应 10 min。 利用双蒸水在 628 nm
下将紫外分光光度计调零后，对以上试管进行测定
得到各试管的吸光度 A空白、A标准和 A样品，白蛋白含
量计算公式：
2016,32(6) 253吴晨曦等：DHP-半乳糖复合体制备多孔生物载体及其在人体肝细胞培养中的应用
Aḷ߶  AオⲭAṧ૱  Aオⲭⲭ㳻ⲭਜ਼䟿 = × Cḷ߶
采用葡萄糖氧化酶 - 过氧化物酶法测定葡萄糖
含量。取标准葡萄糖（5.55 mmol/L）和实验过程中
每天收集的细胞代谢液，分别加入小试管中，之
后每支试管中加入含葡萄糖氧化酶（10 U/mL）、过
氧化物酶（1 U/mL）磷酸缓冲溶液（pH7）、苯酚
（10.6 mmol/L）和 4- 氨基安替比林（70 mmol/L）的
混合溶液 1 mL，混匀后在 37℃恒温水浴锅中反应
15 min，使用双蒸水在 505 nm 波长处将紫外分光光
度计调零后，测定标准管与样品管的吸光度 A标准、
A样品，葡萄糖含量计算公式：
× Cḷ߶
Aḷ߶Aṧ૱㪑㨴㌆ਜ਼䟿 =
2 结果
2.1  生物载体的形态观察与化学结构表征
2.1.1  半乳糖复合体扫描电镜图  通过测定所得含
糖生物载体的比表面积为 6.013 m2/g，从图 1 中可
测量出含糖生物载体的平均孔径 20 μm，孔隙率为
60%，内部孔隙相互连通，有利于营养物质的扩散
及代谢物质的排出。
芳香核的 1 510.01 cm-1 和 1 420.79 cm-1 的吸收峰，
表明两种材料都具有木质素结构。图 2-B 材料不仅
具有刚性疏水的木质素结构，还有柔性亲水的糖结
构，使其具备生物载体的基本要求。
图 1 DHP-半乳糖复合体的表面形态
2.1.2  FT-IR 光谱图  以 DHP 为原材料的多孔生物
载体的红外光谱如图 2、表 1 所示。从图 2 可看出
3438 cm-1 处羟基峰、1087 cm-1 处的 C-O-C 和醇基 
C-O 的振动峰，表明其中存在糖结构，图 2-B 中加
入 1% 的 D-半乳糖，从差谱图 2-C 可观察到这两处
峰强有所加强。图 2-A 与图 2-B 都具有来自木质素
4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000
Tr
an
sm
itt
an
ce
/%
wavenumber/cm-1
A
B
C
A ：不含糖载体 FT-IR 光谱图；B：含糖载体 FT-IR 光谱图；C：差谱（B-A）
图 2 多孔生物载体的 FT-IR 光谱图
表 1 多孔生物载体的红外光谱图信号分析
谱带位置（cm-1）
官能团归属
不含糖载体（A） 含 1%糖载体（B）
3438 3440 O-H拉伸
2867 2867
CH3，CH2 和 CH中的 
C-H拉伸
1642 1642 共轭羰基
1510 1509 芳香核振动
1454 1454 C-H振动
1348 1348 紫丁香基
1251 1250 愈创木基
1087 1086 脂肪族醚
945 945 芳香核 C=H振动
847 847 芳香核 C-H振动
2.1.3  生物载体糖分析结果  根据不同糖的标准回
归曲线，使用高压液相色谱法测定多孔生物载体中
的糖含量。测试结果显示，加入 1% 组分 D-半乳糖
的多孔生物材料中含有 0.95% 的 D-半乳糖和部分葡
萄糖，说明合成含糖多孔生物载体时，D-半乳糖基
本按照预期所加含量与原材料进行结合，说明可以
控制生物载体内的糖含量，得到最适宜的质量分数
以保证多孔生物材料具有良好的生物相容性。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6254
2.1.4  固体 13C NMR 谱图  在脂肪族碳原子区（δ0-
110），δ79.5 来自半乳糖与 DHP 以苯甲醚键连接结
构 的 α-C 与 β-C（NO.8），δ69.9-72.1 来 自 半 乳 糖
与 DHP 以酯键连接结构的 α-C。从差谱图中观察到
δ79.5、δ69.9-72.1 处有一定波动，表明图 3 样品 A
围进行生长且形态良好。图 6 所示为不含糖的多孔
生物载体细胞培养图，图 6中细胞前期有部分增加，
但总体细胞数不多，第 5、6天时细胞呈现减少趋势。
由此证明含半乳糖的载体具有良好的生物相容性。
2.2.2  人体肝细胞生长曲线  在倒置生物相差显微
镜下使用细胞计数板，对培养的人体肝细胞 L-02 的
200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
C
1 2 12
10
8
9
3 4 5 116 7
δ
A
B
A：含糖载体 13C NMR 谱图；B：不含糖载体 13C NMR 谱图；C：差谱（A-B）
图 3 多孔生物载体的 13C NMR 谱图
中 DHP 与半乳糖发生连接，形成水凝胶生物载体。
各材料共振信号的基团归属见表 2。
2.1.5  体外培养中载体扫描电镜（SEM）  从图 4 中
可以观察到，两种生物载体表面的孔洞相互交错，
都具有一定强度，且孔洞数量较多，提高比表面
积，细胞能在孔内生长，使营养物质和代谢物质扩
散畅通，提升了肝细胞生长的三维空间和营养输送。
图 4-A 标记处能够看到有肝细胞附着在其上，图
4-B 中载体上无肝细胞附着。表明含糖多孔载体具
有良好生物相容性，可以提供人体肝细胞适宜生长 
环境。 
2.2  多孔生物载体在人体肝细胞体外培养中的观测
2.2.1  细胞形态  将人体肝细胞 L-02 接种在制作好
的多孔生物载体上，对细胞进行静态观察。每天将
细胞培养孔板取出，置于倒置显微镜下观察肝细胞
的生长情况与形态。图 5 所示为含半乳糖的多孔生
物载体培养人肝细胞时的培养图，从图 5 中可以观
察到随着天数增加，细胞生长情况越来越好，细胞
数增多，并且能观察到细胞黏附在多孔生物载体周
表 2 多孔生物载体的 13C NMR 信号分析
峰号
化学位移（δ）
                                    官能团归属 
不含糖载体（B） 含 1%糖载体（A）
1 195.1 195 松伯醇 γ-CHO
2 189.5 190.1 α-CHO
3 150.6 150.8 愈创木基 C3/C4
4 131.9 131.7 非醚化 β-O-4 愈创木环 C1
5 123.8 123.9 对 - 羟苯基 C1
6 114 113.9 愈创木基 C5
7 109.5 109.6 愈创木基 C2
8 79.5 79.4 半乳糖 C1，Cβ（β-O-4）
9 69.9-72.1 69.9-72.1 半乳糖 C4，Cα（β-O-4），缩水甘油醚 C1、C2
10 56.3 56.5 -OCH3
11 44.6 44.8 缩水甘油醚 C4
12 20.9-23 20.8-23 CH3（乙酰基）
第 1-6 天进行细胞计数，计数结果如图 7 所示。从
图 7 中可看出，制作的不含半乳糖的 DHP 多孔生
物载体所培养的人体肝细胞生长情况比不上空白样
（Blank）。而加入 D-半乳糖组分占 1% 的 DHP 多孔
生物载体与空白对照组所培养的肝细胞生长良好，
第 1-5 天细胞保持增长状态，第 5 天的生长速率最
2016,32(6) 255吴晨曦等：DHP-半乳糖复合体制备多孔生物载体及其在人体肝细胞培养中的应用
大，细胞总数到达最大值。DHP 含糖载体的细胞培
养数总体高于空白对照组，表明加入一定 D-半乳糖
的 DHP多孔生物载体具有良好的生物相容性。
2.2.3  人体肝细胞的代谢活性  肝细胞的代谢活性
的两项重要指标白蛋白分泌与葡萄糖代谢如图 8 所
示。从图 8 可清晰看出，加入 1%D-半乳糖的复合
A
B
A ：含糖生物载体表面形态；B：不含糖生物载体表面形态
图 4 人工合成 DHP 多孔生物载体的扫描电镜图
A B
C D
E F
A ：第 1天；B：第 2天；C：第 3天；D：第 4天；E：第 5天；F：第 6天
图 5 人体肝细胞 L-02 在含糖多孔生物载体上的生长情况
BA
DC
FE
A ：第 1天；B：第 2天；C：第 3天；D：第 4天；E：第 5天；F：第 6天
图 6 人体肝细胞 L-02 在不含半乳糖多孔生物载体上的生
长情况
0 1 2 3 4 5 6
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20㓶㜎ᮠ/×105 њ·mL -1 ᰦ䰤/d 0% 1% Blank
图 7 人肝细胞生长曲线
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.6256
体材料在体外培养的 6 d 中，肝细胞 L-02 代谢活性
始终保持较好状态，好于空白对照组与不加 D-半乳
糖的多孔生物载体，表明其具有良好的生物相容性，
有利于对肝细胞的培养。
能够灵活地调节 LCC 基多孔生物水凝胶载体中 D-半
乳糖的含量。从生物载体的差示光谱的分析结果（图
2）可知，含 1% 糖载体在 1 086 cm-1 处的 C-O-C 弯
曲振动信号明显增强，表明 DHP上成功地接枝了 D-
半乳糖。从差示谱图（图 3）上发现 79.4 ppm 处的
信号（No.8）和 69.9-72.1 ppm 处的信号（No.9）分
别来自半乳糖结构单元中的 C1 和 C4，进一步阐明
了本研究合成的 DHP-半乳糖复合体中半乳糖结构单
元的存在。 通过水凝胶的方法制备医用多孔生物载
体，比表面积为达到 6.013 m2/g，适合人肝细胞的培
养。因此，无论是生物载体化学组分还是多孔性及
表面形态方面，以 DHP 与 D-半乳糖的接枝共聚产
物作为原料可以制备性能良好的多孔生物载体。
在体外培养中与肝细胞进行共培养，模拟天然
LCC 在细胞培养中的应用。对所制备的含糖与不含
糖 DHP 生物载体进行电镜观察，两者都具有良好的
三维多孔结构，由于使用了含半乳糖的生物载体，
使肝细胞能够更好的附着在含糖载体表面进行生长，
分析体外培养中肝细胞的生长情况及代谢活性，细
胞计数结果得出采用含半乳糖与不含糖的载体时细
胞数最大值分别为 16.5×105/mL、2.375×105/mL，
表明 D-半乳糖的加入可以有效提高载体诱导人肝
细胞的增殖的能力。使用以 DHP-半乳糖复合体为
原料制备的生物载体进行培养时，白蛋白分泌和葡
萄糖代谢值最大值分别为：9.85 g /（d·L）、16.134 
mmol /（d·L），远高于不含半乳糖的载体。以上结
果表明 DHP 复合体材料结构适合细胞生长，具有良
好的生物相容性。
本研究创新的使用了 DHP 与聚糖进行接枝共聚
制备生物载体，此方法的优点在于可以对聚糖的种
类及含量进行控制，更加灵活的满足各种细胞的需
求。但缺点在于人工合成 DHP-聚糖复合体的分子量
较低，使得后期载体的制备步骤较为繁琐，周期较
长，并且聚糖的最佳含量也需要反复试验，才能得
到具有良好性质的生物载体。本研究尚未得出对于
肝细胞 D-半乳糖的最佳含量。在今后的研究中，将
继续探索 DHP 多孔生物载体的不同制备方法，以实
现快速、高效的载体制备，并针对不同细胞的需求，
对所添加聚糖的种类及含量进行研究，使 DHP 多孔
生物载体能够更好的投入到组织工程的应用中。
ᰦ䰤/dᰦ䰤/d1 2 3 4 5 62
4
6
8
10
12ⲭ㳻ⲭ࠶⋼/g⋅L-1 ⋅d-1  0% 1% Blank
1 2 3 4 5 6
8
10
12
14
16
18㪑㨴㌆⎸㙇/mmol⋅d-1 ⋅L-1  0% 1% Blank
A
B
A ：白蛋白分泌；B：葡萄糖代谢
图 8 肝细胞代谢活性
3 讨论
天然 LCC 可以作为良好的生物载体材料，尤其
是从银杏等木材提取的 LCC 由于含有适量的半乳糖
聚合物［6］，能为人肝细胞的半乳糖受体（galactose 
receptor）所感知到［18］，从而促进体外培养过程中
人肝细胞在 LCC 基生物载体上的黏附、生长、繁
殖、分化，因此 LCC 基生物载体具有良好的生物相
容性。但因天然 LCC 中半乳糖的含量根据植物纤维
材料的种类而变化，选择具有最适合人肝细胞的半
乳糖含量的植物纤维原料受到较大的限制。本研究
为了解决此问题，使用 DHP 与 D-半乳糖进行聚合，
2016,32(6) 257吴晨曦等：DHP-半乳糖复合体制备多孔生物载体及其在人体肝细胞培养中的应用
4 结论
使用人工合成 DHP 制作的水凝胶多孔生物载
体，具有良好的三维结构，平均孔径为 20 μm，比
表面积为 6.013 m2/g。
利用DHP与D-半乳糖合成的接枝共聚产物制作
的水凝胶多孔生物载体，比没有加入 D-半乳糖的载
体具有更好的生物相容性，细胞计数结果得出含半
乳糖与不含糖细胞数最大值分别为：16.5×105/mL、
2.375×105/mL，表明 D-半乳糖的加入可以有效提高
载体的生物相容性。
将水凝胶多孔生物载体用于人肝细胞的体外
培养，肝细胞能够附着在其表面且生长良好，根据
代谢活性结果，含半乳糖与不含糖的白蛋白分泌最
大值分别为：9.85 g /（d·L）、4.01 g /（d·L），葡萄
糖代谢最大值分别为：16.134 mmol /（d·L）、6.095 
mmol /（d·L），肝细胞同时具有较高的代谢活性，
以上表明用 DHP-半乳糖接枝共聚产物制作的载体具
有良好的生物相容性。
参 考 文 献
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（责任编辑  李楠）