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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年增刊
DHPLC系统工作原理及其应用
李莉 王翀 陈瑶生
(华南农业大学动物科学学院,五山 510642)
摘 要: 变性高效液相色谱 ( DHPLC)是一种高通量筛选 DNA序列变异的新技术, 从该仪器设备的组成、工
作原理、基本操作方法、主要技术特点等作一综述,并对其在基因组领域的应用如 SNP分析、双链 DNA片段分析、
微卫星分析、mRNA定量分析、引物纯度检测等方面及在医学、遗传学方面的应用作了较详细的综述。
关键词: DH PLC 原理 应用
Working Principles and Application of DHPLC System
L iL i W ang Chong ChenY aosheng
(C ollege of Anim al S cience, South China Agricultura l University, Guangzhou 510642)
Abstrac:t Dena tur ing H igh Perform ance L iqu id Chrom atog raphy ( DH PLC ) is a kind o f h igh throughout new tech-
n ique to detect them utation of the DNA sequence. The structure of the instrum ent, working P r inciples, basic man ipu la ting
m ethod and m a in technical characteristic were rev iew ed. The applica tions in the m ed ic ine, genetics and genome dom ain
such as ana lysis of SNP, the fragm ent o f doub le stra ins, m icro sate llite, the quantitative mRNA, the pure detec tion of the
pr im e, et al we re rev iew ed in de tai.l
Key words: DHPLC P r inciple Application
基金项目:国家自然科学基金资助 ( 30300249)
作者简介:李莉 ( 1982-) ,女,硕士研究生,专业方向:动物遗传育种与繁殖,电话: 020-85280277
通讯作者:王翀 ( 1968-) ,女,博士,副教授,主要研究方向:分子遗传学,电话: 020-85285703, E-m ai:l bet ty@ scau. edu. cn
变性高效液相色谱 ( denaturing h igh performance
liqu id chrom atography, DHPLC)是一种新的高通量筛
选 DNA序列变异的新技术, 这一技术最先由美国
S tanford大学 Oefner及 Underhill等于 1995年报道,
美国 T ransgenom ic公司采用该原理制造专利化仪
器, 专利产品为 WAVEm DNA 片段分析系统
(WAVE
m
DNA fragment analysis system )。
1. 1 仪器主要组成部分
硬件部分: 变性高效液相色谱仪 (WAVEm
3500HT): WAVE
m
L-7100型四元梯度溶液注入系
统 (含四元梯度泵 ) , WAVEm L-7250型 Peltier可冷
却、加热自动进样器, WAVEm L-7300 p lus型高精度
Peltier柱箱, WAVEm L-7400型紫外 /可见光检测
器, WAVEm L-700在线去气装置: 四通道, 样品池
(可容纳 4个 96孔 PCR板,以便进行大规模分析筛
查 ), WAVEm Maker数据工作站系统 (硬件 )等。
软件部分: M icrosoft W indow sm NT 操作系统,
HSMD-7000数据工作站控制接口软件, WAVEm
Maker核苷酸片段分析系统专用软件包。
1. 2 DHPLC基本原理及其应用
用离子对反向高效液相色谱法: ① 在不变性的
温度条件下,检测并分离分子量不同的双链 DNA分
子或分析具有长度多态性的片段, 类似 RFLP分析,
也可进行定量 RT-PCR 及微卫星不稳定性测定
(M SI) ;② 在充分变性温度条件下, 可以区分单链
DNA或 RNA分子, 适用于寡核苷酸探针合成纯度
分析和质量控制; ③ 在部分变性的温度条件下, 变
异型和野生型的 PCR产物经过变性复性过程,不仅
分别形成同源双链,同时也错配形成异源双链,根据
柱子保留时间的不同将同源双链和异源双链分离,
2006年增刊 李莉等: DH PLC系统工作原理及其应用
从而识别变异型。根据这一原理, 可进行基因突变
检测、单核苷酸多态性分析 ( SNPs)等方面的研究。
1. 3 DHPLC基本操作方法
在进行 DHPLC检测之前应设定仪器的参数:
① 设定 ds DNA分离柱的温度, 对于部分变性的温
度,导入所要检测的 DNA序列, WAVE系统中的
WAVE
m
M aker软件可根据待分析片段的 DNA序列
很方便地预测出柱温。另外斯坦福大学 Tm 计算网
站 ( http: / / insertion. stanford. edu /me l.t htm l)提供的
M elt软件也可辅助温度选择,解链曲线是确定柱温
的最佳参考依据, 但WAVEm M aker还可提供更有
用的其它信息,最为重要的是分析单一片段中存在
的多个解链域。因为一般软件预测的是整个序列的
平均解链温度,这只是一系列合适温度条件的中点,
最适检测温度还取决于期望检出变异所在区域的局
部解链温度。对于 dsDNA片段大小、微卫星及 mR-
NA的定量分析,直接采用 50e 的柱温,就是很理想
的检测温度。对于 RNA和 O ligo的检测分析, 80e
也是很合适的柱温, 不需要另外找软件分析处理。
② 设定流动相 A液和 B液的组成: A液含 0. 1mo l/
L的 TEAA、0. 1mo l/L的 EDTA、0. 1%的乙腈。 B液
含 25%乙腈、0. 1mo l/L的 TEAA、0. 1mo l/L的 ED-
TA,至于运行时 A液与 B液的配合比例则视检测的
目的不同而有所不同。③ 设定紫外检测器的波长
为 260 nm。④设定自动加样器的取样样本号、进样
量等。⑤ 根据研究的需要,设定将运行的程序名称
并存盘。⑥ 设定实验结果储存的文件夹、文件名
等。
1. 4 DHPLC主要技术特点
DHPLC检测技术的主要特点是: ① 高通量
( high throughout)检测,适合大规模的 SNP筛查及微
卫星分型的分析。②自动化程度高: 减轻劳动强度,
提高检测效率。③灵敏度及特异度均较高: 与直接
测序相当,检测未知的 SNP可达 95%以上,已有许
多学者进行了 DHPLC相关的方法学比较研究, 均
提示其敏感性和特异性可达 96% ~ 100%, 明显高
于常用的 DGGE、CCM、CSGE、SSCP等变异检测技
术 [ 5, 7, 8, 26, 27, 32] , 目前只有基于毛细管电泳技术发展
起来的荧光单链构像多态性分析 ( F-SSCP)在敏感
性和特异性方面能与 DHPLC相媲美 [ 12 ]。④所检测
的 DNA或 RNA片段的长度变动范围广, 较适合大
片段 DNA的筛查。⑤ 快速:每份样本的检测时间
不超过 10m in,对于高通量的洗脱柱, 3m in便可检测
一个样品。⑥ 相对价廉:平均每检测一份样本的费
用约为 10元人民币。将数份样品混合后组成样品
池,成本可进一步降低。⑦ 检测结果以图表显示,
直观易判断。
1. 5 DHPLC应用
1. 5. 1 SNP检测 在部分变性温度情况下 (柱温在
53~ 78e 之间 ), DHPLC可进行基因突变的检测和
未知 SNPs筛查。基于异源双链的形成, 一个杂合
子个体的 PCR产物一定含有野生型和突变型两种
DNA, 并且两者的比例为 1B 1, 将 PCR产物进行变
性复性过程,杂交会形成同源双链和异源双链。同
样, 当把野生型和突变型 PCR产物混合后, 进行变
性复性过程,杂交后也会出现 4种情况 (图 1) ,它们
不仅形成同源双链,同时也错配形成异源双链,异源
双链由于碱基对不匹配,在部分变性的温度条件下,
就会在不匹配的碱基对处部分解链, 由于单链 DNA
带负电荷减少,结合力弱, 因此, 异源双链比同源双
链先洗脱出来, 根据柱子保留时间 ( retention time )
的差异将同源双链和异源双链分离 (图 2)。据此可
检测反相柱 ( reverse-phase co lumns)中单个碱基置
换、插入或缺失杂合二倍体的片段, 可检测 DNA片
段大小在 80~ 1000bp范围的单碱基突变,对于未知
的 SNP和单个核苷酸突变, 系统检测的准确率大于
96%, 对于已知的 SNP和单个核苷酸突变, 系统检
测的准确率大于 99. 9%。对于基因突变的检测及
SNP的检测也是 DHPLC的最主要用途。鉴于此,中
外许多研究者利用 DHPLC系统进行了基因突变的
研究 [ 16, 24, 25, 27, 31, 34]、未知 SNPs筛查 [ 2, 6, 10, 23, 24, 33]。
图 1 通过杂交形成同源和异源双链
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2006年增刊
图 2 同源双链与异源双链在柱子上保留时间不同而分离
1. 5. 2 双链 DNA片段分析 在非变性温度条件下
(柱温 50~ 52e ), DHPLC主要有三个方面的应用:
①双链 DNA片段的分析与纯化; ②微卫星的分析;
③ RT-PCR产物的定量分析。
在非变性温度下, DNA双链不解开, 由于 PCR
产物片段大小的不同, 在柱子内停留的时间也有差
异,小片段的 DNA分子首先被洗脱出来,通过紫外
吸收光 ( 260nm )检测, WAVEm M aker核苷酸片段分
析系统专用软件包将其转换为不同的峰型, 参照分
子量标准,通过软件系统便可读出 PCR产物的不同
图 3 DHPLC系统和琼脂糖凝胶电泳对 H aeⅢ酶切质粒 pUC18分析图谱比较
片段大小。DHPLC区分 DNA片段大小的灵敏度很
高,每个峰能检测到 0. 5ng的 DNA样品,且对产物
的大小分辨率可达到 1% 的水平, 即 100bp左右的
DNA可分离出其相差 1bp的片段, 1 000bp左右能
分离相差 10bp的片段大小, 分离范围广, 约 50 ~
2 000bp内的片段大小均能很好分辨, 图 3展示了用
HaeⅢ 酶切质粒 pUC18后的琼脂糖凝胶电泳图谱
和 DHPLC系统分析图谱, 对于采用琼脂糖凝胶电
泳不能分离较接近的片段, 如 257bp和 267bp, DH-
PLC系统能有效分离, 对于所需片段可根据峰的位
置用 T ransgenom ic自动收集器对 DNA片段进行纯
化、回收一步完成,回收产物可用于进一步的测序或
克隆等。Huber等 ( 1995) [ 19 ]用 DHPLC系统快速而
精确地分析了烷基化物多个负粒子 DNA片段的大
小。
1. 5. 3 微卫星分析 由于微卫星核心序列重复数
的差异是形成多态性的基础, 引发微卫星位点发生
突变的原因主要为 /滑链错配0,这将导致微卫星的
等位基因之间会产生几个或十几个碱基的差异, 且
等位基因呈共显性,利用其等位基因片段大小的差
异,便可通过 DHPLC系统将其不同的基因型区分
开。图 4展示了用 DHPLC系统和 PAGE胶对微卫
星 PCR 产物检测分析对照。 D evaney和 Marino
( 2000)
[ 11 ]利用 DHPLC分析了人 HUMTH01位点的
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2006年增刊 李莉等: DH PLC系统工作原理及其应用
图 4 DHPLC系统和 PAGE胶对微卫星
PCR产物检测分析对比
微卫星多态, 候建国等 ( 2003) [ 1]也用 DHPLC系统
分析了与猪经济性状紧密相关的 7个微卫星位点,
Pan等 ( 2003) [ 29]用 DHPLC高通量检测微卫星的不
稳定性。
1. 5. 4 mRNA定量分析 对于目前研究较多的基
因表达方面, DHPLC系统也有其独到的应用, 特别
是应用基因在不同物种或不同组织器官中表达水平
的差异,通过检测 RT-PCR产物的峰面积的大小,采
用WAVEm Maker核苷酸片段分析系统专用软件可
对产物量进行分析。在有标准样品或相对参照物的
前提下, 可以相对或绝对的定量出 mRNA的表达
量,以确定基因在组织内的表达情况。H ayw ard等
( 1998)
[ 18]利用 DHPLC建立了竞争性 RT-PCR的模
型及分析方法。Doris等 ( 1998) [ 13]采用 DHPLC系
统及竞争性 RT-PCR快速分析基因表达。H ayw ard
等 ( 1995) [ 17]用单管内 RT-PCR和 DHPLC系统对基
因表达进行精确而绝对的定量。王翀等 ( 2003) [ 14]
对用 mRNA差异显示方法获得的在不同猪种肌肉
组织中有差异表达的 EST,采用 DHPLC系统对不同
组织中基因的表达进行相对定量, 从而鉴定了差异
表达的准确性。
1. 5. 5 引物纯度检测 在完全变性温度 (柱温
80e )情况下,形成单链 DNA分子或 RNA可从洗脱
柱上分离,可用于对单链 RNA的检测及脱氧核苷酸
(如合成的引物等 )进行检测和质量监控,对寡核苷
酸 ( o ligo)质量控制。 5~ 80m er,可检测单碱基差别;
5~ 30mer,可检测相同长度寡核苷酸中单碱基序列
的差别。对 RNA 的分析, 检测范围在 200 ~
5 000nts,在配备有收集器的情况下可对分离的单链
DNA、 oligo、RNA 进 行纯 化, Huber 等 ( 1993,
1996)
[ 20, 21]曾作过相关的研究, 田兴国等 ( 2003) [ 3]
在利用 DHPLC系统对微卫星的分析方法探讨中,
曾利用该原理对合成的引物进行检测分析, 以确定
合成引物的纯度,对有降解的引物及时要求公司重
新合成,减少了研究时间和经费的浪费。
1. 5. 6 主要应用领域 DHPLC这一新兴的变异检
测技术一经诞生,即被许多实验室采用,大多用以筛
选候选基因中已知或未知变异。在最早成功地筛选
出乳腺癌、卵巢癌相关基因 ( BRCA1)的突变后 [ 15] ,
现 DHPLC已被用于肿瘤相关基因 ( TSC1、TSC2、
ATM、p53 等 )、先天性长 QT 综合征 ( KCNQ1、
KCNH2)、隐睾病 ( GREAT )、血友病甲 ( F8C )、多发
行硬化 (MAG )等 50多种疾病 (候选基因 )的变异筛
选中。在肾脏疾病中, DHPLC也已被用于常染色体
显性遗传的多囊肾相关基因 PKD1和 PKD2的突变
筛选中 [ 30]。
DHPLC在大量用于基因突变检测的同时, 其功
能被不断地开发拓展, 已被应用于微卫星 DNA鉴
定、肿瘤杂合性缺失的检测、RT-PCR的竞争性定
量、人种遗传学分析、基因作图、核酶中自身剪切反
应的研究、CpG岛甲基化的分析 [ 19]、细菌鉴定 [ 22]、
DNA片段大小测定及寡核苷酸的分析和纯化等许
多基因组研究领域中。
DHPLC也进一步应用到 mRNA的检测中, 例
如, Gallo等 ( 2002) [ 14 ]建立了对 mRNA的可变剪接
或转录产物的编译进行检测的方法。M atin等
( 2002)
[ 28]、王翀等 ( 2003) [ 4 ]将 DHPLC与差异显示
mRNA法 ( mRNA differentia l display)的原理相结合,
可用于鉴定差异表达的基因。
综上所述,随着研究者对其认识的不断深入和
提高,以及寻找更多疾病相关基因或用于连锁或进
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2006年增刊
化分析的多态性标记的迫切需要, DHPLC这一高
效、经济的检测技术在将来的基因组学研究领域中
将继续发挥重要的作用。
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