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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(4):137-142
葡 萄 属 葡 萄 科（Vitaceae） 葡 萄 属（Vitis L.），
是全球性果树之一，品种繁多，分布广泛。我国是
世界上葡萄栽培面积较大的国家之一，目前全国入
圃保存的葡萄种质资源也有 2 000 份左右［1］，并且
每年都会有多个新品种出现，因此进行品种保护、
品种鉴定及谱系分析等工作不仅对苗木繁育具有重
要意义，也是保护这些品种知识产权的需要。
SSR（Simple sequence repeat）分子标记技术具
有重复性好、多态性丰富、稳定性高及简便快速等
特点［2］，近年来被广泛应用于葡萄种质鉴别［3］、遗
收稿日期 ：2015-07-21
基金项目 ：科技创新能力建设专项（KJCX20140110，KJCX20140202）
作者简介 ：王慧玲，女，博士，助理研究员，研究方向 ：葡萄分子遗传育种 ；E-mail ：whlhappy@aliyun.com
通讯作者 ：徐海英，女，研究员，研究方向 ：葡萄遗传育种 ；E-mail ：haiyingxu63@sina.com
13 个中国葡萄优新品种的分子身份证构建
王慧玲1，2  闫爱玲1，2  孙磊1，3  张国军1  王晓玥1  徐海英1
（1. 北京市农林科学院林业果树研究所，北京 100093 ；2. 北京市落叶果树工程技术研究中心，北京 100093 ；3. 农业部华北地区园艺作物
生物学与种质创制重点实验室，北京 100093）
摘 要 ： 以近年来选育的 13 个葡萄优新品种为试材，进行亲缘关系分析，构建分子身份证，为中国葡萄品种鉴定和新品种
保护提供一定的参考。利用国际通用的 9 对引物对供试葡萄品种进行 SSR 分析，并根据引物对不同品种扩增条带分子量的大小进
行赋值编码。结果表明，该 9 对引物在供试葡萄品种间共检测出 48 个等位基因，每对引物平均检测到等位基因数为 5.3 个 ；期望
杂合度的范围在 0.435-0.811 之间 ；多态性信息含量变幅为 0.401-0.784。同时基于 SSR 分析结果得到编码各异的品种分子身份证，
该分子编码可以将 13 个葡萄品种进行有效区分。聚类分析显示 13 个品种根据亲缘关系远近聚为不同类别。
关键词 ： 葡萄 ；优新品种 ；SSR ；分子身份证
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.018
Molecular ID Establishment of 13 Chinese Newly-developed Grape
Cultivars
WANG Hui-ling1，2 YAN Ai-ling1，2 SUN Lei1，3 ZHANG Guo-jun1 WANG Xiao-yue1 XU Hai-ying1
（1. Institute of Forestry and Pomology，Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences，Beijing 100093 ；2. Beijing Engineering
Research Center for Deciduous Fruit Tree，Beijing 100093 ；3. Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops
（North China），Ministry of Agriculture of P. R. China，Beijing 100093）
Abstract: Using 13 newly-developed grape cultivars as experimental materials，the phylogenetic relationship among them were analyzed
and their molecular IDs were established，which aimed to provide the references for identifying the grape cultivar and protecting the new ones.
SSR analysis was carried out on the tested grape cultivars with the international commonly-used 9 pairs of primers，and the codes of each
cultivar was assigned according to the molecular weight of the amplified band of different cultivar by the primer. The results showed ：a total of
48 alleles and an average of 5.3 alleles per primer were detected by 9 pairs of primers. The expected heterozygosity varied between 0.435-0.811，
and the information content of polymorphism ranged from 0.401 to 0.784. After alleles assignment and coded，the molecular IDs of cultivars
were established，by which the 13 grape cultivars can be identified. According to the clustering analysis，13 cultivars showed clear separations
due to their different parents.
Key words: grape ；new cultivars ；SSR ；molecular ID
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4138
传多样性分析［4，5］、亲缘关系鉴定［6，7］及分子遗传
图谱构建［8］等方面，同时也成为葡萄指纹图谱构
建的有效工具［9］。尹玲等［10］对我国近年来新育成
的 24 个鲜食葡萄品种，利用 6 对国际通用的 SSR
荧光标记引物对其进行扩增，并利用毛细管电泳技
术对产物进行分离，建立了这些葡萄品种的指纹图
谱。近几年，研究者在遗传图谱基础上提出了“分
子身份证”的概念，并将它赋予品种本身作为识别
品种的一个标准。分子身份证是在指纹图谱的基础
上将种质的特征数字化，即每个种质都拥有一个属
于自己的字符串形式的代码，达到更加简单明了区
分种质的目的。在果树方面，研究者利用 SSR 标记
分别构建了甜樱桃、香蕉和桃等的分子身份证［11-13］。
2013 年，杜晶晶等［14］以国家葡萄品种资源圃内保
存的 80 份葡萄种质为试材，对利用 SSR 标记构建
葡萄种质分子身份证的方法进行了探讨，证明 SSR
标记可以用于进行葡萄的分子身份证构建。
本研究选取北京市农林科学院林业果树研究所
选育的 13 个葡萄优新品种为试材，通过 SSR 标记
分析技术，分析它们的亲缘关系，尝试构建 13 个品
种的分子身份证，旨在为保护中国葡萄优新品种的
知识产权，并为育成品种的分子鉴定奠定理论基础，
对中国葡萄遗传育种及品种保护提供帮助。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究所用材料均为北京市农林科学院林业果
树研究所选育的优新品种，共 13 份（表 1），分别
种植于所内资源圃和温室。在四月中旬采集各个葡
萄品种幼叶液氮速冻，保存于 -80℃冰箱，用于基因
组 DNA 的提取。
1.2 方法
1.2.1 基 因 组 DNA 提 取 基 因 组 DNA 提 取 参 照
Marsal 等［15］ 的 方 法。 从 葡 萄 幼 叶 中 提 取 基 因 组
DNA，1% 琼脂糖凝胶电泳检测，利用 Eppendorf 公
司生产的 Bio-Photometer 核酸检测仪检测 DNA 溶液
的浓度与纯度，并将浓度稀释至 50 ng/μL。
1.2.2 DNA 扩增和电泳 本研究选取 9 对国际通用
的 SSR 引物进行扩增（表 2），其中 6 个标记（VV-
MD5、VVMD7［16］、VVMD27、VVS2［17］、VRZAG62
及 VRZAG79［18］）曾被 This 等［19］推荐为葡萄品种
筛选的核心标记。引物由上海生工合成，每对引物
合成 2OD，-20℃冰箱保存备用。
DNA 扩增采用 20 μL 体系。其中含 ：10×PCR
buffer，引物 0.25 μmol/L，模板 DNA 50 ng，dNTP 0.2
mmol/L，rTaq DNA 聚合酶 0.5 U。用于 SSR-PCR 反
应的 dNTP、Taq 酶、DNA Marker 购自 TaKaRa 公司。
PCR 扩增程序 ：95℃预变性 5 min ；95℃变性
15 s，65℃-55℃退火 15 s，72℃延伸 1 min，10 个循
环 ；95℃变性 15 s，55℃退火 15 s，72℃延伸 1 min，
25 个循环 ；4℃保存。PCR 反应在美国 Bio-Rad 公司
生产的 9600 Thermal Cycler 型 PCR 仪上进行。然后
取 PCR 产物 4 μL 进行点样，6% 聚丙烯酰胺凝胶电
泳，银染显色，胶干后在清华紫光 e100 扫描仪上成
像保存。
1.2.3 数 据 分 析 采 用 Powermarker 软 件（Version
3.25）［20］对 9 个 SSR 标记的遗传多样性指数进行分
析。数据标准化处理方法参考陈昌文等［11］的方法。
根据每对引物对不同种质扩增片段对应的分子量大
小，按从小到大依次编码为 1-8。同时参考桃分子
身份证的构建方法，当引物扩增的某一品种等位基
因有 2 个时，按等位基因碱基数较小的条带编码进
行赋值。并通过非加权配对算术平均法（UPGMA）
进行聚类分析，建立亲缘关系图。
2 结果
2.1 SSR引物扩增多态性
通过改进的 CTAB 方法提取全部实验材料的基
因组 DNA，通过电泳和紫外分光光度计检测，基因
组 DNA 的浓度和纯度均符合 SSR 实验要求。聚丙烯
酰胺凝胶电泳结果显示，SSR 扩增条带清晰。本实
验所选用的 9 对 SSR 引物在供试葡萄品种中共检测
到 48 个等位基因，平均每对引物扩增的等位基因数
是 5.3 个。最少的 VVMD6 和 VrZAG29 引物分别扩
增出 3 个等位基因，VrZAG79 扩增的等位基因数最
多为 8 个，其中有 5 对引物的等位基因数超过平均
数（表 2）。等位基因数越多，表明该引物更能反应
品种之间的差异。其中 VVMD5 和 VVMD7 对 13 个
品种扩增结果（图 1）显示，13 个品种分别有 6 个
等位基因。尽管 9 对引物的多态性不高，但是足以
2016,32(4) 139王慧玲等：13 个中国葡萄优新品种的分子身份证构建
区分这 13 个葡萄品种。
利用 Powermaker 软件对 9 个 SSR 标记在 13 个
葡萄品种中的主等位基因频率、期望杂合度、观测
杂合度及扩增位点的多态信息含量等进行了计算分
析。结果（表 3）表明，扩增位点的观测杂合度在
0.385-0.846 之间，平均值为 0.641。期望杂合度的
范围在 0.435-0.811 之间，平均值为 0.638。多态性
信 息 含 量 PIC 变 幅 为 0.401-0.784， 平 均 为 0.598。
表 1 13 个葡萄品种名称及分子身份证编码
品种编号 品种名称 品种类型 亲本（谱系）（♂ × ♀） 分子身份证编码
1 香妃 欧亚种（Vitis Vinifera） 绯红 ×（玫瑰香 × 莎芭珍珠后代 73-7-6） 215172221
2 艳红 欧亚种（Vitis Vinifera） 京早晶 × 玫瑰香 245234332
3 早玛瑙 欧亚种（Vitis Vinifera） 京早晶 × 玫瑰香 354334232
4 爱神玫瑰 欧亚种（Vitis Vinifera） 京早晶 × 玫瑰香 335262232
5 瑞都红玉 欧亚种（Vitis Vinifera） 瑞都香玉芽变 234272222
6 瑞都红玫 欧亚种（Vitis Vinifera） 香妃 × 京秀 233271222
7 瑞都早红 欧亚种（Vitis Vinifera） 香妃 × 京秀 233271231
8 紫珍珠 欧亚种（Vitis Vinifera） 莎芭珍珠 × 玫瑰香 134171112
9 早玫瑰香 欧亚种（Vitis Vinifera） 莎芭珍珠 × 玫瑰香 234211132
10 瑞都脆霞 欧亚种（Vitis Vinifera） 香妃 × 京秀 233251222
11 瑞都香玉 欧亚种（Vitis Vinifera） 香妃 × 京秀 213261231
12 峰后 欧亚种（Vitis Vinifera） 巨峰实生 131123232
13 瑞都无核怡 欧亚种（Vitis Vinifera） 红宝石无核 × 香妃 222143222
注 ：分子身份证编码的引物顺序为 P1-P9 ；身份证编码中加粗的数字为该品种特异等位基因编码
VrZAG79 引物的 PIC 值最高，结合期望杂合度值及
等位基因数值，该引物对本研究供试葡萄品种的区
分能力最强。
2.2 分子身份证构建
根据电泳结果，对 9 对引物在供试种质扩增的
等位基因谱带大小分布范围进行赋值。因为本实验
中引物扩增最多的等位基因数为 8，所以赋值范围
为 1-8（表 4）。为了保证分子身份证字符串的每位
上只有 1 个字符，对同一引物下的扩增条带只选择
位点较小的进行分子编码。
根据表 4 中等位基因的赋值标准和各引物对品
种的扩增结果，对 13 份供试葡萄品种进行分子编码，
结果（表 1）显示，用选取的 9 对引物可以将 13 个
品种进行有效区分。但是因为品种亲缘关系较近，
进行分子编码最少也需要 8 对引物才能够将所有品
种区分开，如瑞都红玫和瑞都早红的分子编码比较
相似，在第 8 对引物时才区分开。另外在所构建的
13 个品种分子身份证中，有 7 个品种具有至少一个
特异等位基因。紫珍珠、早玫瑰香和瑞都脆霞各具
有一个特异等位基因，艳红、早玛瑙和峰后各具有
2 个特异等位基因，瑞都无核怡则具有 3 个特异等
位基因。
2.3 供试葡萄品种亲缘关系分析
根据本研究所用的 9 对 SSR 引物扩增结果进
行 数 据 统 计， 利 用 POWERMAKER 软 件， 采 用
UPGMA 法对所有品种进行聚类分析，聚类结果（图
2）显示，亲缘关系近的多聚为一类，如父母本相同
的瑞都红玫、瑞都早红、瑞都脆霞和瑞都香玉聚在
一起，而瑞都红玉为瑞都香玉的芽变，也聚为一类。
紫珍珠和早玫瑰香亲本相同聚为一类。艳红、早玛
瑙爱神玫瑰与香妃聚为一个大类，他们都有相同的
亲本玫瑰香。该聚类结果清楚地反应了品种间亲缘
关系的远近。
3 讨论
采用 9 对 SSR 引物对 13 个葡萄品种进行了分
子身份证构建和亲缘关系分析。平均等位基因数
（5.3）、期望杂合度（0.435-0.811）和引物多态性信
息含量（0.401-0.784）方面显示，本实验结果都较
低（表 3）。Guo 等［21］ 利用相同引物在 32 个中国
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4140
葡萄品种扩增平均位点数 11.5，期望杂合度 0.740-
0.915，多态性信息含量 0.716-0.908。本研究结果也
低于 Moreno-Sanz 等［22］采用相同引物在西班牙品种
中的扩增结果。可能是由于 13 个供试葡萄品种来源
于相同的育种单位，许多品种父母本相同，亲缘关
系较近，选育品种的性状相似，导致品种遗传多样
性较低。但是通过这 9 个分子标记，也可以将 13 个
葡萄品种完全区分开。同时我们发现标记 VrZAG79
在本研究所用的 13 个中国葡萄品种中扩增等位基因
数最多，多态信息含量最高，这与 Guo 等［21］在 32
个中国葡萄品种的实验结果一致，表明 VrZAG79 可
以作为区分中国葡萄品种的核心标记之一。
在引物扩增结果的基础上，我们采取最小等位
基因编码法［13］对 13 个葡萄品种进行分子编码。得
到了 13 个葡萄品种编码各异的分子身份证。在桃编
码中发现亲缘关系较近的品种很难区分［13］，而本研
究中，对于亲缘关系较近的品种通过增加引物也得
到了有效区分，如瑞都红玫和瑞都早红的区分等。
本研究对来自同一育种单位亲缘关系相同或较近的
表 2 9 对 SSR 引物的碱基序列及扩增结果
引物编号 引物名称 引物序列（5-3） 等位基因数
P1 VVS2 F ：CAGCCCGTAAATGTATCCATC
R ：AAATTCAAAATTCTAATTCAACTGG
7
P2 VVMD5 F ：CTAGAGCTACGCCAATCCAA
R ：TATACCAAAAATCATATTCCTAAA
6
P3 VVMD7 F ：AGAGTTGCGGAGAACAGGAT
R ：CGAACCTTCACACGCTTGAT
6
P4 VrZAG62 F ：GGTGAAATGGGCACCGAACACACGC
R ：CCATGTCTCTCCTCAGCTTCTCAGC
5
P5 VrZAG79 F ：AGATTGTGGAGGAGGGAACAAACCG
R ：TGCCCCCATTTTCAAACTCCCTTCC
8
P6 VVMD27 F ：GTACCAGATCTGAATACATCCGTAAGT
R ：ACGGGTATAGAGCAAACGGTGT
6
P7 VVMD6 F ：TCTCTAACCCTAAAACCAT
R ：CTGTCTAAGACGAAGAAGA
3
P8 SCU06 F ：CCTAATGCCAGGAAGGTTGC
R ：CCCTAGTCTCTCTACCTATCCATG
4
P9 VrZAG29 F ：ATAACCAGGACAAGTTATTCAAGCC
R ：ACCCAATTGACCATCTTTTATGCTG
3
表 3 9 个 SSR 标记在 13 个供试葡萄品种的遗传多样性
引物名称
主等位基
因频率
期望杂
合度
观测杂
合度
多态信息
含量（PIC）
VVS2 0.269 0.802 0.846 0.774
VVMD5 0.577 0.618 0.615 0.585
VVMD7 0.462 0.701 0.615 0.661
VrZAG62 0.500 0.657 0.923 0.607
VrZAG79 0.385 0.811 0.692 0.784
VVMD27 0.269 0.754 0.692 0.721
VVMD6 0.654 0.494 0.385 0.426
SCU06 0.731 0.435 0.385 0.401
VrZAG29 0.692 0.470 0.615 0.421
Mean 0.504 0.638 0.641 0.598
表 4 SSR 引物扩增基因谱带大小 /bp
引物名称
分子编码赋值标准
1 2 3 4 5 6 7 8
VVS2 120 124 140 142 150 154 160
VVMD5 220 224 228 230 232 234
VVMD7 230 236 240 244 246 250
VrZAG62 180 184 186 190 202
VrZAG79 234 236 240 244 248 252 254 256
VVMD27 178 180 184 186 190
VVMD6 186 200 204
SCU06 160 166 170 180
VrZAG29 104 108 110
注 ：分子编码赋值时依次按照等位基因分子量大小顺序进行。当引物对某
一品种扩增的等位基因数大于 1 个时，则选择等位基因碱基数较小的条带
编码进行赋值
2016,32(4) 141王慧玲等：13 个中国葡萄优新品种的分子身份证构建
品种均可被有效区分，充分说明我们所选取的引物
足以区分亲缘关系很近的不同材料，亦即利用 SSR
标记构建葡萄分子身份证具有较强的可靠性，可作
为鉴别葡萄品种的一种有效方法。本实验得出的结
果在一定程度上可以作为供试品种鉴定的依据，但
在后期的大量鉴定中的适用性还需进一步的验证。
如果能将分子标记和品种来源及表型性状相结合来
研究制定它们的分子身份证将会得到更加科学客观
的实验结果。
４ 结论
本研究采用国际通用的 9 对 SSR 引物，对 13
份中国葡萄优新品种进行了亲缘关系分析，构建了
它们的有效分子身份证，再一次表明 SSR 分析技
术可以作为葡萄品种分子身份证构建的有效技术
手段。
参 考 文 献
［1］ 刘崇怀 , 马小河 , 武岗 . 中国葡萄栽培品种［M］. 北京 ：中国
农业出版社 , 2014.
［2］ Morgante M, Olivieri A. PCR-amplified microsatellites as markers in
plant genetics［J］. The Plant Journal, 1993, 3（1）：175-182.
［3］ 吴子龙 , 王军 , 沈育杰 , 路文鹏 . 8 个山葡萄及山欧杂种葡萄品
种的 SSR 分析［J］. 植物资源学报 , 2008, 9（1）：105-109.
［4］ 邹瑜 , 杨柳 , 黄大辉 , 等 . 70 份毛葡萄种质资源遗传多样性的
SSR 分析［J］. 南方农业学报 , 2013, 44（12）：1943-1948.
［5］ Emanuelli F, Lorenzi S, Grzeskowiak L, et al. Genetic diversity and
population structure assessed by SSR and SNP markers in a large
germplasm collection of grape［J］. BMC Plant Biology, 2013, 13 ：
39
［6］ 李慧 , 罗正荣 , 张青林 . 基于 SSR 和 IRAP 标记的‘关口葡萄’
亲缘关系分析［J］. 果树学报 , 2014, 31（6）：1024-1027.
［7］ 温景辉 , 申海林 , 邹利人 , 等 . 20 份葡萄种质亲缘关系的 SSR
分析［J］. 果树学报 , 2011, 28（5）：782-786.
［8］ Vezzulli S, Troggio M, Coppola G, et al. A reference integrated map
for cultivated grapevine（Vitis vinifera L.）from three crosses, based
on 283 SSR and 501 SNP-based markers［J］. Theoretical and
Applied Genetics, 2008, 117 ：499-511.
［9］ Karata H, Değirmenci D, Velasco R, et al. Microsatellite
fingerprinting of homonymous grapevine（Vitis vinifera L. ）
varieties in neighboring regions of South-East Turkey［J］. Scientia
Horticulturae, 2007, 114 ：164-169.
［10］ 尹玲 , 张晨 , 向江 , 等 . 我国新育成葡萄品种 SSR 指纹图谱的
建立［J］. 果树学报 , 2015, 32（3）：366-373.
［11］ 艾呈祥 , 张力思 , 魏海蓉 , 等 . 甜樱桃品种 SSR 指纹图谱数据
库的建立［J］. 中国农学通报 , 2007, 23（5）：55-58.
［12］ 王静毅 , 陈业渊 , 黄秉智 , 等 . 部分香蕉品种 SSR 指纹图谱的
构建［J］. 果树学报 , 2009, 26（5）：733-738.
［13］ 陈昌文 , 曹珂 , 王力荣 , 等 . 中国桃主要品种资源及其野生近
缘种的分子身份证构建［J］. 中国农业科学 , 2011, 44（10）：
2081-2093.
［14］ 杜晶晶 , 刘国银 , 魏军亚 , 等 . 基于 SSR 标记构建葡萄种质资
源分子身份证［J］. 植物研究 , 2013, 33（2）：232-237.
［15］ Marsal G, Baiges I, Canals JM, et al. A fast, efficient method for
extracting DNA from leaves, stems, and seeds of Vitis vinifera L. ［J］.
American Journal of Enology and Viticulture, 2011, 62 ：376-381.
1
allel1
allel4
allel7 allel6
P2 P3
bp
300
200
180
160
allel5
allel2 allel3
allel6
allel5 allel4allel3
allel1
allel2
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
P2 ：VVMD5 ；P3 ：VVMD7 ；1-13 ：不同品种
图 1 VVMD5 和 VVMD7 扩增的等位基因特征
13⪎䜭ᰐṨᙑ
0.1
12ጠਾ9ᰙ⧛⪠俉8㍛⧽⨐6⪎䜭㓒⧛5⪎䜭㓒⦹7⪎䜭ᰙ㓒11⪎䜭俉⦹10⪎䜭㜶䵎
4⡡⾎⧛⪠1俉ླ3ᰙ⧋⪉2㢣㓒
图 2 13 个葡萄品种基于 SSR 的聚类分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4142
［16］ Bowers JE, Dangl GS, Vignani R, Meredith CP. Isolation and
characterization of new polymorphic simple sequence repeat loci in
grape（Vitis vinifera L. ）［J］. Genome, 1996, 39 ：628-633.
［17］ Thomas MR, Scott NS. Microsatellite repeats in grapevine reveal
DNA polymorphisms when analyzed as sequence-tagged sites
（STSs）［J］. Theoretical Applied Genetics, 1993, 86 ：985-990.
［18］ Sefc KM, Regner F, Turetschek E, et al. Identification of microsa-
tellite sequences in Vitis riparia and their applicability for genoty-
ping of different Vitis species［J］. Genome, 1999, 42（3）：367-
373.
［19］ This P, Jung A, Boccacci P, et al. Development of a standard set of
microsatellite reference alleles for identification of grape cultivars
［J］. Theoretical and Applied Genetics, 2004, 109（7）：1448-
1458.
［20］ Liu K, Muse SV. PowerMarker ：an integrated analysis environment
for genetic marker analysis［J］. Bioinformatics, 2005, 21 ：2128-
2129.
［21］ Guo DL, Zhang Q, Zhang GH. Characterization of grape cultivars
from China using microsatellite markers［J］. Czech Journal of
Genetics and Plant Breeding, 2013, 49 ：164-170.
［22］ Moreno-Sanz P, Loureiro MD, Suárez B. Microsatellite characteriz-
ation of grapevine（Vitis vinifera L. ）genetic diversity in Asturias
（Northern Spain）［J］. Scientia Horticulturae, 2011, 129 ：433-
440.
（责任编辑 马鑫）