全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(7):48-53
黄河三角洲是我国暖温带保存最完整、最广阔
和最年轻的湿地生态系统，在北方河口湿地中具有
代表性，地处渤海之滨的黄河入海口，土壤盐碱化
尤为严重［1，2］。盐碱土是盐土（含有可溶性盐分较高）
和碱土（含有代换性钠较多）的总称，二者在形成
上联系密切，常交错分布，所以，统称为盐碱土［3］。
作为中国最主要的中低产田的土壤类型之一［4］，盐
碱土限制了植物生长，同时，独特的土壤条件造就
了特殊的植被类型 ：盐生植物。柽柳和獐茅作为典
型的盐生植物［5-8］，在黄河三角洲具有代表性，前
收稿日期 ：2015-10-30
基金项目 ：山东省自然科学基金项目（ZR2012DM013）
作者简介 ：王艳云，女，硕士，研究方向 ：黄河三角洲土壤真菌 ；E-mail ：1786582634@qq.com
通讯作者 ：郭笃发，男，教授，研究方向 ：黄河三角洲土壤微生物与重金属 ；E-mail ：guodufa@163.com
应用高通量测序技术研究柽柳、獐茅土壤真菌多样性
王艳云  郭笃发
（山东师范大学地理与环境学院，济南 250000）
摘 要 ： 应用 454高通量测序技术对柽柳和獐茅地土壤真菌种类及多样性进行研究，并对其进行真菌多样性指数和相似性
分析，为黄河三角洲真菌多样性深入的研究和盐碱地的改良提供基础数据和理论依据。结果表明，4个土样共获得 5门 17纲 37目
48科 51属。OTU数和多样性指数表明：柽柳上层（C1 ：0-20 cm）土壤真菌多样性最丰富，其 OTU数、Shannon指数、Chao1指
数分别是獐茅下层（Z2 ：20-40 cm）相应指数的 1.7倍、1.2倍和 2.4倍。距离热图分析表明，Z1和 Z2真菌群落间的相似性最大，
Unifrac metric值为 0.269 9 ；C1和 C2真菌群落间相似性最小，Unifrac metric值为 0.690 2。柽柳地土壤真菌较獐茅地土壤真菌丰富。
关键词 ： 黄河三角洲；柽柳；獐茅；真菌；真菌多样性
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.007
The Application of 454 High-throughput Sequencing Technology into
Anlaysing the Diversity of Soil Fungi in the Field Planting Tamarix
chinensis and Angiospermae
WANG Yan-yun GUO Du-fa
（College of Geography and Environment，Shandong Normal University，Ji’nan 250000）
Abstract: The study，which was related to the variety and diversity of soil fungi in the field planting Tamarix chinensis and
Angiospermae，and the corresponding analysis of fungal diversity index and similarity were conducted by applying 454 high-throughput
sequencing technology. It is aimed at providing the basic datas and theoretical gist for the futher study into the diversity of fungi in Yellow River
Delta and the improvement of saline-alkali soil. And the result indicated four soil samples were divided into 5 phyla，17 classes，37 orders，48
families and 51 genus. The OTU number and diversity index showed that the diversity of soil fungal diversity was the richest in Tamarix chinensis
surface（C1 ：0-20 cm），which was accordingly 1.7 times，1.2 times and 2.4 times of OTU number，Shannon index and Chao1 index in
Angiospermae substratum（Z2 ：20-40 cm）. In addition，the analysis of the distance heat map indicated the fungal communities of Z1 and
Z2 had the most similarity，whose Unifrac metric value was 0.269 9 and the fungal communities of C1 and C2 have the least similarity，whose
value was 0.690 2. In a word，the soil fungi in the field planting Tamarix chinensis was richer than one in the field planting Angiospermae.
Key words: The Yellow River Delta ；Tamarix chinensis ；Angiospermae ；fungi ；fungal diversity
2016,32(7) 49王艳云等：应用高通量测序技术研究柽柳、獐茅土壤真菌多样性
人对它们的研究多集中在植被本身的耐盐机制［9-12］，
而目前关于黄河三角洲生物多样性方面的研究则主
要集中在土壤、动物植被分类、植物群落物种组成
及多样性梯度变化等方面［13，14］，但这些研究都不是
以植被下土壤微生物多样性为研究目的。
土壤真菌数量巨大，种类繁多［15-18］。传统的
培养法遗漏了土壤中绝大多数真菌，难以反映真菌
群落多样性全貌。分子指纹图谱如变性梯度凝胶电
泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）
和末端限制性片段长度多态性（terminal-restriction
fragment length polymorphism，T-RFLP）方法虽然具
有高通量的优势，能够指示不同群落结构的差别，
但对微生物的认识也是有限的［19，20］。克隆测序的方
法虽然能给出微生物群落的更多信息，但与土壤真
菌巨大的多样性相比，克隆文库显得太小，提供的
信息仍然偏少。454 高通量测序技术拥有数据产出
通量高、获得信息丰富、快捷和读长长等优点，使
人们有能力研究高度复杂的真菌群落和稀有的微生
物类群，因此 454 高通量测序技术越来越多地被应
用于土壤微生物生态学研究中［21-23］。454 高通量测
序是一种利用 DNA 乳胶扩增系统和皮升体积的焦磷
酸的测序方法，其主要原理是［24］，独特的短 DNA
片段与一个特别设计的 DNA 捕获磁珠结合，用扩增
试剂使其乳化成微反应体系（包含有一个磁珠和一
个独特 DNA 片段）并确保每个反应体系都是 DNA
单拷贝。DNA 片段在各自反应体系中发生扩增反应
后打破乳化体系，随后将带有 PCR 产物的磁珠放入
只能容纳单个磁珠的 PTP（pico titer plate）板中开始
测序。
本研究利用 454 高通量测序技术对黄河三角洲
柽柳和獐茅地土壤真菌进行研究，探讨两种典型盐
生植物下土壤真菌物种种类、多样性的变化规律，
对丰富我国的物种资源、保护生物多样性具有重要
意义，以及为本区真菌多样性深入研究和盐碱地的
改良提供基础数据和理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
实验土样采集于黄河三角洲的中心城市——东
营市河口区，在柽柳及獐茅地各选取有代表性的 3
个地点进行采样，具体操作是在每个地点（共 6 个）
的 0-20 cm 和 20-40 cm 深度各取样 1 次（尽量避免
雨季采样），共获得 12 个土样。将在多个地点采集
的土壤分别进行充分混合，将各土样混匀并除去较
大的根系等杂物后，对获得的 4 个土样进行编号 ：
C1（ 柽 柳 ：0-20 cm）、C2（ 柽 柳 ：20-40 cm）、Z1
（獐茅 ：0-20 cm）和 Z2（獐茅 ：20-40 cm）。放入
液氮罐带回实验室，保存在 -80℃条件下，用于生物
信息学分析。
1.2 方法
1.2.1 土壤 DNA 提取 土壤样品 DNA 的提取采用
Omega DNA 提取试剂盒（D5625-01），依据试剂盒
操作说明书进行操作。
1.2.2 PCR 扩 增 PCR 扩 增 体 系（50 μL） 包 括 ：
模 板 DNA 10 μg、10×buffer、0.4 mmol/L dNTP
（0.5 μL）、5 U/μL Taq DNA 聚 合 酶（0.5 μL）、1 μL
Bar-PCR primer F（50 μmol/L）、1 μL primer R（50
μmol/L）。PCR 扩 增 条 件 为 ：94℃ 预 变 性 5 min ；
95℃变性 45 s，57℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，30
个循环 ；最后 72℃延伸 5 min。
PCR 扩增用 Roche 454FLX 测序平台的通用引
物，包括 ：18S F 引物（5-CGTATCGCCTCCTCGCGC
CATCAG+bar+CAGTAGTCATATGCTTGTCT-3）、18sR
引物（5-CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCTGC
TGGCACCAGACTTGC-3）。
1.2.3 数据分析 将 PCR 产物在 1％（m/v）的琼脂
糖凝胶中电泳，电泳测定后采用上海生工琼脂糖回
收试剂盒（cat ：SK8131）对 DNA 进行回收。使用
Qubit® 2.0 荧光剂对回收产物进行定量处理。使用罗
氏公司 454 测序仪（Roch GS FLX sequencer）进行
测序。
去除非靶区域序列后，然后用 uchime 对得到的
质量文件做进一步处理，去掉测序质量不好的序列，
并对序列长度进行筛选，只保留长度在 400-600 bp
的序列 ；采用软件 uclust 将相似性大于 97% 的序列
归为同一种可操作分类单元（OTU），从每个 OTU
中选择代表性序列，与 NCBI 的 GenBank 进行 Blast
比对，确定真菌序列的分类信息，获得门、纲、目、
科和属各水平下的分类单元。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.750
计算土壤真菌的多样性指标：香农指数（Shannon
Index）、Chao1 指数、Coverage 等。
Shannon 指数计算公式 ：H=-（ni/N）log（ni/N）
其中 ：ni= 峰面积，N= 所有峰的总面积
［25，26］。
Chao1 由 Chao（1984） 最 早 提 出。 计 算 公 式
=Schao1=Sobs+n1（n1-1）/2（n2+1），Schao1= 估计的 OTU 数；
Sobs= 实际 OTU 数 ；n1= 只有一条序列的 OTU 数目 ；
n2= 只有两条序列的 OTU 数目。
Coverage ：是指各样品文库的覆盖率，其数值
越高，则样本中序列没有被测出的概率越低。该指
数实际反映了本次测序结果是否代表样本的真实情
况。计算公式为 ：C=1-n1/N，n1= 只含有一条序列的
OTU 的数目 ；N= 抽样中出现的总的序列数目。
基于 Unifrac metric 来比较多组样本之间的差别
度量。Unifrac metric 是一种基于系统发育树的计算
值，可很好的用于衡量样本间物种组成的相似度［27］，
值在 0-1 之间，值越小说明样本间相似度越高。
2 结果
2.1 数据预处理结果
为获取更多土壤真菌群落多样性信息，利用
454 高通量测序技术对真菌 18S rRNA 进行扩增，序
列比对后分析种群多样性和结构组成。经序列质量
筛选，去除碱基错配、缺失、含（N）序列和短序列等，
使得质控之后序列长度大部分分布在 400-600 bp 之
间，且 C1、C2、Z1 和 Z2 土壤真菌高质量序列数分
别为 4 468、4 921、6 859 和 7 439 条，满足基本分
析要求，可用于进一步的生物信息学分析。
2.2 土壤真菌种类分析
本研究共获得 5 门（亚门）17 纲 37 目 48 科 51
属。在门（亚门）分类水平上属于 5 个类群（图 1-A），
主 要 包 括 ：子 囊 菌 门（Ascomycota）、 担 子 菌 门
（Basidiomycota）、毛霉亚门（Mucoromycotina）、壶菌
门（Chytridiomycota）和球囊菌门（Glomeromycota），
其中，子囊菌门在所有样本中的相对丰度为 9.01%-
75.81%，是最优势门，远远大于次优势门 - 担子菌门
（0.83%-16.39%），表现出非常明显的优势地位。另
外，毛霉亚门和球囊菌门在 C2 土样中不存在。在属
分类水平上，优势类群主要包括（相对丰度＞ 1.0%）：
Diatrype、暗球腔菌属（Phaeosphaeria）、旋孢腔菌
（Cochliobolus）、Lulwoana、茎点霉属（Phoma）、绿
僵菌属（Metarhizium）、Knufia、被孢霉属（Mortierella）、
毛霉菌属（Mucor）。其中最优势属是 Diatrype，它在
C1、C2、Z1 和 Z2 中的相对丰度依次为：0.11%、0.06%、
47.81% 和 68.67%，而且它的相对丰度远远大于相
应土样中的次优势属 Phaeosphaeria，具体为 ：C1 中
0.11>0.02，C2 中 0.06>0.04，Z1 中 47.81>3.14，Z2
中 68.6>2.27，Diatrype 表现出非常明显的优势地位，
这与真菌在门中的表现规律一样，说明柽柳和獐茅
地中的土壤真菌优势菌群组成相对单一。
2.3 土壤真菌在不同深度土层上的分布
土壤真菌群落在不同土样上的相对丰度和种类
变化，见图 1。其中，从 C1 样地中共获得土壤真菌
5 门 39 属，相对丰度较高的几种依次是 ：旋孢腔菌
（1.19%）、Knufia（1.05%）、被孢霉属（1.07%）、毛
霉菌属（1.81%），其余 35 属的相对丰度均小于 1.0%。
从 C2 样地中共获得土壤真菌 3 门 25 属，其中，子
囊菌门、担子菌门和壶菌门相对丰度分别为 9.01%、
0.83% 和 0.57% ；在属水平上，相对丰度较高的只
有旋孢腔菌（0.65%），其余 24 属的相对多度均小
于 1.0%。从 Z1 样地中共获得土壤真菌 5 门 40 属，
相对丰度较高的依次是 ：Diatrype（47.81%）、旋孢
腔 菌（3.02%）、 暗 球 腔 菌 属（3.14%）、Lulwoana
（1.08%）、 绿 僵 菌 属（1.68%）， 其 余 35 属 的 相 对
丰度均小于 1.0%。从 Z2 样地中共获得土壤真菌
5 门 23 属，相对丰度较高的几种依次是 ：Diatrype
（68.67%）、暗球腔菌属（2.27%）、Lulwoana（1.2%）、
茎点霉属茎点霉属（1.04%），其余 19 属的相对丰度
均小于 1.0%。说明 C1 和 Z1 土壤真菌种类较多。
柽柳地中，0-20 cm 土壤真菌种类多于 20-40
cm 土壤真菌种类 ；同样地，在獐茅地中，0-20 cm
土壤真菌种类也多于 20-40 cm 土壤真菌种类。土壤
真菌相对丰度的变化规律与种类上的变化规律基本
一致 ：同一真菌，其在 0-20 cm 的相对丰度普遍大
于 20-40 cm 的相对丰度。本研究中总体呈现出随土
壤深度增加，真菌种类和相对丰度减少的趋势，原
因可能是上层土透气性好、营养物质相对丰富。
各 土 样 土 壤 真 菌 种 类 有 一 定 差 别（ 图 2），
只 11 个 属 为 4 个 土 样 所 共 有。 此 外， 青 霉 菌 属
2016,32(7) 51王艳云等：应用高通量测序技术研究柽柳、獐茅土壤真菌多样性
（Penicillium）、盘多毛孢属（Pestalotia）、Cyphellop-
hora、Ophiocordyceps、Hemileia、Burgoa、Sistotrema、
Powellomyces、 毛 霉 菌 属（Mucor）、Conidiobolus、
Thamnocephalis 这 11 个属只存在于柽柳地土壤中，
所有这 11 个属在 C1 中都存在，而 C2 中只有青霉
菌属、盘多毛孢属、Cyphellophora、Hemileia、Burg-
oa、Conidiobolus 6 个属存在。只存在于獐茅中的属
（ 共 12 个 ） 包 括 ： 绿 僵 菌 属（Metarhizium）、
Halosarph-eia、 中 国 盘 菌 属（Peziza）、 光 柄 菇 属
（Pluteus）、Filobasidium、Sakaguchia、Volvariella、
裸 盖 菇 属（Psilocybe）、Hannaella、Hyphoderma、
Rhizophagus、Funneliformis，其中，Halosarpheia、中
国盘菌属、Hannaella 在 Z2 中不存在。
2.4 土壤真菌多样性分析
柽柳和獐茅地土壤真菌群落多样性结果，见表
1。采用 Mothur 软件对群落结构多样性进行分析（表
1）可知，4 个土样中土壤真菌覆盖率均高于 89%，
表明本次测序深度合理，基本能代表样本的真实情
况。柽柳上层土壤 OTU（操作分类单元）数最多，
为 858，獐茅下层土壤 OTU 数最少为 501，前者是
后者的 1.7 倍。4 种样地中 Shannon 指数平均值和
Chao1 指数平均值由高到低依次为 C1 ＞ Z1 ＞ C2 ＞
Z2，其中，C1 的 Shannon 指数平均值和 Chao1 指数
平均值分别是 Z2 相应指数的 1.2 倍和 2.4 倍。由此
可见，柽柳地土壤真菌比獐茅地土壤真菌丰富，且
柽柳上层土壤真菌多样性最丰富。
100
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⴨ሩѠᓖ%
C1 C2 Z2Z1ṧ૱㕆ਧ
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0
⴨ሩѠᓖ%
C1 C2 Z2Z1ṧ૱㕆ਧ
Glomeromycota
Chytridiomycota
Mucoromycotina
Basidiomycota
Ascomycota
A B
Thamnocephalis
Funneliformis
Rhizophagus
Conidiobolus
Mucor
Mortierella
Entophlyctis
Powellomyces
Spizellomyces
Blyttiomyces
Sistotrema
Hyphoderma
Hannaella
Psilocybe
Burgoa
Volvariella
Cryptococcus
Hemileia
Sakaguchia
Filobasidium
Coprinopsis
Malassezia
Pluteus
Ophiocordyceps
Cyphellophora
Schizosaccharomyces
Pestalotia
Lepidosphaeria
Lasiobolus
Surculiseries
Peziza
Eutypa
Halosarpheia
Penicillium
Myrothecium
Chaetomium
Acremonium
Knufia
Lecythophora
Aureobasidium
Ascobolus
Aspergillus
Metarhizium
Cladosporium
Phoma
Geomyces
Lulwoana
Phaeosphaeria
Gibberella
Cochliobolus
Diatrype
图 1 各样地土壤真菌在门（A）及属（B）分类水平上的种类和相对丰度
C2 Z1
Z2C1
图 2 各土样真菌种类维恩图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.752
表 1 壤真菌群落多样性
样品 OTU Shannon Chao1 Coverage/％
C1 858 5.53 1670.91 89.66
C2 551 4.73 750.81 95.67
Z1 846 5.15 1331.84 94.44
Z2 501 4.5 682.07 97.61
2.5 柽柳、獐茅土壤真菌的相似性分析
从 图 3 可 以 看 出，Z1 和 Z2 真 菌 群 落 间 的
Unifrac metric 值最小，为 0.269 9 ；C1 和 Z1 真菌群
落间的 Unifrac metric 值为 0.387 7 ；C2 和 Z2、C1 和
C2 真 菌 群 落 间 的 Unifrac metric 值 分 别 为 0.683 6、
0.690 2，说明 Z1 和 Z2 真菌群落间的相似性最大，
而 C1 和 C2 真菌群落间相似性最小。表明柽柳地土
壤真菌群落多样性高于獐茅地土壤真菌群落多样性，
前者土壤真菌种类较后者丰富。
关［29］。另外，Buée 等［23］和李超等［30］都发现最丰
富真菌类群为担子菌门，其次才是子囊菌门，与本
研究不同，这种差异可能是由各自土壤在 pH、盐分
含量和 CaCO3 含量等性质的不同造成的。
柽柳地和獐茅地中，均是 0-20 cm 土壤真菌种
类多于 20-40 cm 土壤真菌种类，总体呈现出随土壤
深度增加，真菌种类减少的趋势，说明自然状态下
土壤的真菌多样性受到土壤垂直分布的影响，优势
真菌种群随土壤深度的变化略有差异，与前人研究
一致［31，32］。
通过多样性和相似性分析可知，柽柳地土壤真
菌群落多样性高于獐茅地土壤真菌群落多样性，且
柽柳上层土壤真菌多样性最丰富。由前面土壤真菌
种类分析可知，獐茅地土壤真菌种类略多于柽柳地，
与多样性和相似性分析的结果不一致。这可能是由
于多样性和相似性分析均是以 OTU 为基础，而 OTU
是通过将多条序列按其序列间的距离对它们进行聚
类，后根据序列之间的相似性作为域值分成的操作
分类单元，此操作分类单元被认为可能属于属或种，
也可以是菌株，所以所得结果有所不同，具体原因
有待进一步研究。
4 结论
本研究共获得 5 门（亚门）17 纲 37 目 48 科 51
属。在门分类水平上，子囊菌门（Ascomycota）是
所有样本中的最优势门，其相对丰度远远大于次优
势门担子菌门（Basidiomycota）。在属分类水平上，
最优势类群是 Diatrype。
本研究中土壤真菌种类和相对丰度总体呈现出
随土壤深度增加，真菌种类和相对丰度减少的趋势。
C1 土壤真菌的 OTU 数、Shannon 指数、Chao1
指数分别是 Z2 相应指数的 1.7 倍、1.2 倍和 2.4 倍，
且 Z1 和 Z2 真菌群落间的相似性最大，C1 和 C2 真
菌群落间相似性最小，柽柳地土壤真菌多样性高于
獐茅地土壤真菌多样性。
参 考 文 献
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［2］刘宁 , 李新举 , 赵庚星 , 等 . 基于 GIS 的黄河三角洲土壤肥力质
C1
C1
C2
C2
Z2
Z2
Z1
Z1
0.6459
0.5998
0.5536
0.5075
0.4614
0.4152
0.3691
0.3229
0.2768
0.2307
0.1845
0.1384
0.0922
0.0461
0.0
图 3 各土样真菌群落距离热图
3 讨论
本研究柽柳地和獐茅地土壤采集于黄河三角洲，
应用高通量测序技术对其柽柳地上下层和獐茅地上
下层土壤真菌种类和多样性进行了研究。
在本研究中，以子囊菌门为主（在 C2 中相对
丰度高达 75.81%），其次是担子菌门（在 C1 中相对
丰度最高，仅为 16.39%），这与袁超磊等［28］的研
究结果一致，但本研究共获得 5 个真菌门，而后者
仅仅获得 3 个（毛霉亚门和壶菌门未获得），这可能
与柽柳和獐茅地中含有包括动植物残体的沉积物有
2016,32(7) 53王艳云等：应用高通量测序技术研究柽柳、獐茅土壤真菌多样性
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（责任编辑 狄艳红）