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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(7):146-151
收稿日期 ：2015-07-22
基金项目 ：国家高技术研究发展计划（“863”）项目（2011AA100606），吉林省教育厅“十三五”科学技术研究项目重点项目（吉教科合字［2016］
179 号） ，国家自然科学基金资助项目（31201237），吉林农业大学大学生创新创业项目（201610193046，201410193045），吉林
省科技厅中青年领军人才及优秀创新团队项目（20111815），教育部博士点基金 - 青年教师基金项目（20122223120002）
作者简介 ：韩怡来，男，研究方向 ：生物技术 ；E-mail ：994435840@qq.com
通讯作者 ：官丽莉，女，实验师，研究方向 ：药用植物与生物技术 ；E-mail ：guanll2004@163.com
红花脂质转运蛋白基因的克隆及表达分析
韩怡来1  崔琪1  武云云1  顾天瑶1  滕孝花3  胡人阁1  吴贯达1   
官丽莉1，2  李海燕1，2  李校堃2
（1. 吉林农业大学生命科学学院，长春 130118 ；2. 吉林农业大学 生物反应器与药物开发教育部工程研究中心，长春 130118 ；
3. 通化市第一中学，通化 134000）
摘 要 ： 克隆红花脂质转运蛋白基因（Lipid transfer protein，LTP），并进行生物信息学及表达分析，旨为研究 LTP在红花抵
抗逆境胁迫中的作用提供依据。通过 RT-PCR方法从红花种子中克隆 LTP基因序列，通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析，
构建 LTP与相关物种 LTP的系统进化树，利用 Real-time PCR方法分析在红花不同号组织中 LTP基因的表达量。结果显示，LTP
基因 ORF全长 294 bp，编码 97个氨基酸，相对分子量为 7.46 kD，等电点为 8.91。红花 LTP蛋白包含一个长为 29个氨基酸残基
的信号肽序列；该蛋白含有一个丝氨酸磷酸化位点；三级结构预测表明该蛋白是由 3个 α-螺旋和一个 β-转角简单的缠绕在无规则
卷曲上的简单结构。分子进化表明，红花 LTP基因与十字花科的甘蓝型油菜进化关系最近。通过荧光定量 PCR对红花 LTP基因的
组织表达特异性进行分析，结果表明 CtLTP在不同组织的表达水平具有显著差异，在种子和花中呈现高表达，而在其他组织中低
表达。
关键词 ： 脂质转运蛋白；红花；荧光定量 PCR ；生物信息学分析
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.022
Cloning and Expression Analysis of Lipid Transfer Protein LTP Gene
in Carthamus tinctorius
HAN Yi-lai1 CUI Qi1 WU Yun-yun1 GU Tian-yao1 TENG Xiao-hua3 HU Ren-ge1 WU Guan-da1
GUAN Li-li1，2 LI Hai-yan1，2 LI Xiao-kun2
（1. College of Life Sciences，Jilin Agricultural University，Changchun 130118 ；2. Ministry of Education Bioreactor and Drug Development
Research Center，Jilin Agricultural University，Changchun 130118 ；3. Tonghua No.1 Senior High School，Tonghua 134000）
Abstract: LTP（Lipid transfer protein）gene was cloned，its bioinformatics and expression were analyzed，providing the basis
for the study the role of LTP gene in safflower resisting stresses. The sequence of LTP gene was cloned by RT-PCR technique，the protein
characteristics were analyzed using bioinformatics，and the phylogenetic tree of LTP for safflower and other species was constructed. The
expressions of LTP gene in the different tissues were analyzed using Real time-PCR. Sequence analysis showed that ORF of LTP was 294 bp，
encoding a protein of 97 amino acids with a molecular weight of 7.46 kD，isoelectric point of 8.91. Safflower LTP protein contained a long signal
peptide sequence of 29 amino acid residues，and the protein contained a serine phosphorylation site. Tertiary structure prediction indicated that
the protein was a simple structure of 3 α-helix and 1 β-turn twining in random coils. Molecular evolution showed that the evolutionary relationship
of LTP between Brassica of cruciferous and safflower was the most similar. Tissue-specific expression analysis of safflower LTP by fluorescence
quantitative PCR showed that the gene expression levels in different tissues presented a significant difference，while high expression in seeds
and flowers，and low expression in other tissues.
Key words: lipid transfer protein ；safflower ；Real-time PCR ；bioinformatics analysis
2016,32(7) 147韩怡来等：红花脂质转运蛋白基因的克隆及表达分析
植 物 非 特 异 脂 质 转 运 蛋 白（Non-specific lipid
transfer protein，nsLTP）是一类胞外分泌性蛋白，分
子量约为 9 kD 的碱性小分子蛋白［1］。脂质转运蛋白
在不同物种之间的同源性较低，但均存在脂质转运
蛋白的明显特征。脂质转运蛋白是一个多基因家族
蛋白，如在拟南芥中已分离到 100 多个脂质转运蛋
白基因，在辣椒中已经分离出 6 个脂质转运蛋白基
因，而在水稻全基因组测序后发现了 53 个脂质转运
蛋白基因，同时同一物种中脂质转运蛋白基因的表
达具有较强的发育和组织特异性［2，3］。
LTP 蛋白主要存在于植物地上器官的表皮组织
中，许多研究表明，不同的 nsLTP 基因表达对生物
胁迫及非生物胁迫产生不同响应［4］。国内外对水稻、
菠菜、玉米、花椰菜、绿豆和拟南芥等多种植物的
脂质转运蛋白已有较深入的研究，具备多种复杂的
生物学功能，主要包括脂类物质转运、角质层蜡质
合成［5，6］，低温［7-10］、高温［9，11］或重金属［12］和病
原菌侵害［13］，另外，在花药和花粉发育［14，15］、干
旱和盐［16-19］的胁迫过程中也发挥重要作用。例如，
小麦 TaLTP1 的表达受 PEG、NaCl、H2O2、伤害胁
迫 诱 导［20］， 芝 麻 SiLTP2 与 SiLTP4 受 NaCl、 甘 露
醇诱导［16］，腊梅 nsLTP 基因响应低温胁迫其表达增
高［21］，这些结果表明，nsLTP 在植物对非生物胁迫
和生物胁迫的反应过程中可能起着重要作用，但关
于这些基因的具体生物学功能还有待进一步研究。
红花（Carthamus tinctorius L.）为菊科、红花属
植物，对高温干旱逆境具有较强的耐性，种子耐储
藏，是一种药食两用的经济作物。本课题前期已开
展红花种子、花、叶的转录组测序分析（SRA0472-
79.2）及红花功能基因的研究［22］，在此基础上本研
究克隆 1 个红花脂质转运蛋白基因 cDNA 序列并进
行生物信息学分析和不同器官中的表达特性检测，
旨在为深入研究 CtLTP 基因的功能，揭示脂质转运
蛋白在红花抵抗逆境胁迫中的作用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
样品采自吉林农业大学种植基地，经吉林农业
大学胡全德教授鉴定为菊科植物红花（Carthamus ti-
nctorius L.）。取红花种子、花、茎、叶、根、胚轴和
子叶迅速放于液氮，锡箔纸包好于 -80℃保存备用。
1.2 方法
1.2.1 RNA 提取和 cDNA 合成 取红花各组织置于
液氮中研碎，总 RNA 提取方法按照 Trizol 试剂说明
书进行，提取后进行纯度及浓度测定 ；于 -80℃保存
备用。cDNA 合成根据 Biotek 公司反转录试剂盒操
作进行，反转录产物分离纯化后于 -20℃保存备用。
1.2.2 红花 LTP 基因 ORF 片段的克隆 根据 Solexa
测序获得的红花转录组序列中功能注释为植物脂质
转运蛋白的 Unigene23752，利用 NCBI 网站（http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/）提供的 ORF finder 软件对开
放阅读框进行分析，确定起始密码子及终止密码子。
按照引物设计原则，采用引物设计软件 Primer5.0，
对红花转录组序列中的 1 个脂质转运蛋白基因的
ORF 序列设计引物（LPT-F 和 LPT-R）（表 1）。以反
转录后的 cDNA 为模板进行 PCR 扩增，反应条件为：
94℃预变性 5 min ；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，
30 个循环 ；72℃ 8 min，4℃终止反应。对 PCR 产物
进行回收，连接 pEASY-T1 载体，并转化 DH5α 感
受态细胞，通过蓝白斑筛选后，挑取白色菌落过夜
培养，提取质粒，PCR、双酶切（EcoR Ⅴ和 Hind Ⅲ）
鉴定重组子，然后测序（由生工生物工程（上海）
股份有限公司完成）。
1.2.3 生物信息学分析 ORF Finder 在线软件分析
红花 LTP 基因相应的氨基酸序列。将获得的红花
LTP 基因 ORF 序列通过 BLAST 搜索 NCBI 的蛋白质
和核苷酸数据库，并通过 DNAMAN 软件翻译成氨基
酸序列，利用 DNAMAN 软件对来源于各种植物的
LTP 的相关氨基酸序列进行同源比对。相对分子质
量与理论等电点（pI）预测采用 ExPASy 在线服务器
的 Compute Pi/Mw 工具，二级结构预测使用 Dublin
大 学 的 Porter 服 务 器， 三 级 结 构 预 测 使 用 Swiss-
Model 服务器，结构功能域分析采用 ExPASy 在线务
器 Prosite Scanprosite。 利 用 SignalP4.1Server（http://
www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/） 对 红 花 LTP 进 行
信号肽预测。利用 TMHMM Server v. 2.0 在线软件进
行跨膜区预测。利用 MEGA5.0 软件中的 Neighbor-
Joining（邻位相连法，NJ）构建系统进化树等。
1.2.4 红花 LTP 基因的组织表达差异分析 取红
花 种 子、 花、 茎、 叶、 根 提 取 RNA， 并 反 转 录
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.7148
为 cDNA 用 于 Real-time PCR 分 析。 定 量 PCR 反
应 体 系 为 ：SYBR Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）
（2×）10 μL ；上下游引物（表 1）各 0.4 μL ；ROX
Reference Dye II（50×）；DNA 模板 2 μL ；ddH2O 6.8
μL。PCR 反应条件为 ：95℃预变性 30 s ；95℃变性
5 s，60℃退火 20 s，40 个循环。
2 结果
2.1 红花总RNA的提取及检测
从吉红 1 号种子中提取总 RNA，凝胶电泳检测
结果（图 1）显示，28S rRNA 和 18S rRNA 条带清
晰，说明所提取的 RNA 完整性较好 ；经核酸蛋白检
测 仪 测 得 A260/A280=1.93，A260/A230=1.98， 表 明 RNA
纯度较高，可用于 RT-PCR 扩增。
1 2
1，2 ：RNA 样品
图 1 红花种子总 RNA 电泳图
2.2 红花LTP基因ORF片段的克隆
根据 CtLTP 基因编码区序列特异引物（LTP-F，
LTP-R），以红花种子 cDNA 为模板扩增出一条 294
bp 的条带（图 2-A）。经回收纯化后，PCR 产物与
pEASY-T1 载体连接，通过菌液 PCR 验证（图 2-B）
和质粒的 EcoR Ⅴ和 Hind Ⅲ双酶切验证（图 2-C），
测序结果正确，命名该基因为 CtLTP（GenBank 登
M 1 2 3 4 5 6 M
M 7 8
2000
bp
1000
750
500
250
100
2000
bp
1000
750
500
250
100
2000
bp
1000
750
500
250
100
M：DNA Marker；1，2：LTP 基因 RT-PCR 电泳；3-6：LTP 基因菌液 PCR 电泳；
7，8 ：LTP 基因酶切验证
图 2 红花 LTP 基因的克隆
录号为 KT692604）。
2.3 红花脂质转运蛋白的序列分析
将推导出的红花脂质转运蛋白 LTP 氨基酸序列
利用 SignalP4.1 软件进行信号肽分析，发现 CtLTP1
蛋白氨基端的前 29 个氨基酸为信号肽序列，属于
分泌蛋白。用推测的氨基酸序列进行 BLASTp 比较，
发现 CtLTP 属于 LTP 蛋白家族（lipid-transfer protein
family）。TMHMM Server v. 2.0 软 件 分 析 结 果 表 明
CtLTP1 蛋白是一个跨膜蛋白，位于 7-29 处存在一
个跨膜区，N 端位于膜内，C 端位于膜外。
利用 ProtParam 软件对去除信号肽的红花 LTP
成熟蛋白进行基本特性分析，结果显示 CtLTP1 含有
原子总数为 1 029，分子式为 C316H513N97O94S9，其分
子量为 7 463.6 Da，理论等电点为 8.91。
用 DictyOGlyc 在线工具对蛋白的糖基化位点进
行预测。根据 P 值大于 0.5 即为存在糖基化位点为
评分标准，LTP 蛋白仅存在 1 个糖基化位点，是位
于第 46 位的丝氨酸（Ser）。这些修饰可能与 LTP 蛋
白的生物学功能密切相关。
表 1 扩增红花 LTP 基因及 qRT-PCR 所用的引物序列
引物用途 引物名称及序列（5-3）
CtLPT1 基因全长引物 LPT-F ：ATGAGACCTTCCATGAAGTTG
LPT-R ：TCAACAGTGTTTAGTGCAGAAG
CtLPT 基因 qRT-PCR 引物 qLPT-F ：GCGGCAAATTGCAACTACATG
qLPT-R ：TTTTGCTCCCTCACCTTAGCG
EF-1α 基因 qRT-PCR 引物 EF-1α-F ：CAAAGTTCGCACCACCTTCA
EF-1α-R ：AGAACCCAGGCGTACTTGAA
2016,32(7) 149韩怡来等：红花脂质转运蛋白基因的克隆及表达分析
采用 SWISS-MODELSOPMA 进行 LTP 的编码蛋
白二级结构分析，结果表明 LTP 蛋白二级结构主要
由 α-螺旋（Alpha helix，39.18）、延伸链（Extended
strand，10.31）、无规则卷曲（Random coil，40.21）、β-
转角（Beta turn，10.31）组成。
在 SWISS-MODEL 依据保守结构域作图工具中，
对 CtLTP 编码蛋白进行三维结构建模，结果（图 3）
显示，CtLTP 编码蛋白是由 3 个 α-螺旋和一个 β-转
角简单的缠绕在无规则卷曲上的简单结构。
酸在红花中同样存在，但只有 7 个保守的半胱氨酸
残基。利用 DNAMAN 软件对红花 LTP 进行同源性
分析显示，与其他物种比较 CtLTP 蛋白与甘蓝型油
菜一致性最高，为 47.42%。结果表明，CtLTP 是一
个新的红花脂质转运蛋白。
为了进一步了解 CtLTP 蛋白与其他物种 LTP 蛋
白间的进化关系，采用 MEGA5.0 软件的 NJ 法构建
系统进化树（图 4）。通过与 14 种植物的 LTP 氨基
酸聚类分析发现，脂质转运蛋白在烟草、野生大豆、
甘蓝型油菜、拟南芥等植物中均以多种形式存在，
且序列差异较大，在系统进化树分散在遗传距离较
远的分支上。红花 LTP 蛋白与拟南芥、野生大豆、
油橄榄、千里光以及苜蓿同属于一个分支。
2.5 红花LTP基因的组织差异表达分析
利用实时荧光定量 PCR 技术检测 CtLTP 基因在
不同组织中的相对表达量。组织差异表达可为研究
基因的功能和调控机制提供依据，本实验选取红花
的种子、花、茎、叶、根、胚轴和子叶 7 个组织对
红花脂质转运蛋白基因进行了组织差异表达分析。
图 5 显示，CtLTP 在不同组织的表达水平具有显著
差异，在种子和花中呈现高表达，而在其他组织中
低表达。
图 3 LTP 蛋白三级结构预测图
Arabidopsis thaliana
Brassica napus
Carthamus tinctorius
Medicago truncatula
Glycine soja
Olea europaea
Tamarix hispida
Gossypium hirsutum
Theobroma cacao
Senecio odorus
Brassica napus
Oryza sativa
Nicotiana glauca
Chimonanthus praecox
图 4 红花 LTP 与其他物种 LTP 的聚类分析
2.4 同源性分析和系统进化树分析
红花 LTP 蛋白氨基酸序列与其他植物 LTP 蛋白
进行比对，结果显示在植物 LTP 中一些保守的氨基
3 讨论
红花在食品、药品领域起着重要作用，是我国
重要的油料和经济作物。红花病害的发生和流行一
直是影响红花黄色素及红花油产量的重要因素，特
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.7150
别是根腐病、锈病等病害严重影响了红花的产量及
品质。因此，通过生物技术手段提高红花品种的抗
性，确保红花食品、药品的安全是十分必要的。
脂质转运蛋白在植物中普遍存在，目前已经从
单子叶植物和双子叶植物的很多器官和组织中发现
了脂质转运蛋白，其中以在拟南芥、水稻、玉米、小
麦、棉花、辣椒、以及番茄等作物中研究较为深
入。本研究根据红花转录组测序结果，克隆到 1 个
脂质转运蛋白基因 CtLTP，其编码的蛋白属于 Non-
specific lipid-transfer protein Ⅱ（nsLTP2） 亚 家 族，
其具有 LTP 蛋白的理化性质，包括 8 个保守的半胱
氨酸残基、碱性等电点、低分子量以及 N 端典型信
号肽结构等［24］。通过对 13 种植物与克隆得到的红
花 LTP 氨基酸序列进行多重比对发现，他们的同源
性差异较大，说明 LTP 蛋白的一级结构在不同物种
间存在差异，具有多态性。LTP 能被病原菌诱导而
高水平表达，并能抑制病原菌的生长和诱导植物系
统抗性的产生［25］。拟南芥 LTP3 作为一个新的负调
控因子，通过调控 ABA-SA 的平衡参与植物免疫［26］。
过量表达 LTPs 基因也能提高转基因作物对病原菌
的抗性，能够增强作物的抗病和适应不良环境的能
力 ；小麦 TdLTP4 基因在拟南芥中过表达能够提高
其抗旱和抗盐能力，同时转基因拟南芥离体叶片表
现出增强对交链孢菌和灰葡萄孢真菌性［27］；小麦
TdLTP3 能够增强拟南芥抗旱性及氧化应激能力［28］；
超表达脂质转运蛋白 AZI 能够增强植物对盐的耐受
性，体内外实验证明其通过与有丝分裂原活化的蛋
白激酶 MPK3 相互结合发挥作用［29］；转 LTP 基因甘
蓝型油菜对菌核病的抗病性增强［30］。因此，通过基
因工程的手段过量表达 LTPs 基因培育作物抗逆新品
种，具有广泛的应用前景。
本研究克隆到 1 个脂质转运蛋白基因 CtLTP 基
因，并主要在红花种子及花瓣中表达，具有显著的
组织表达特异性，为进一步利用红花的脂质转运蛋
白 LTP 提高红花的抗性研究奠定基础，以推动红花
转基因育种的进程。下一步实验会将 CtLTP 基因构
建植物表达载体并转化到植物中进行表达及功能验
证，期望获得抗病抗逆能力增强的转基因植物 ；同
时，亦可构建原核表达载体，获得纯化的 LTP 蛋白，
在体外验证该蛋白的功能。
4 结论
本研究成功克隆 1 个红花脂质转运蛋白 LTP 基
因 cDNA 序列并进行生物信息学分析及组织特异性
表达分析，结果表明，红花 LTP 基因在不同组织的
表达水平具有显著性差异，在种子和花瓣中较高，
而在其他组织中表达量较低。
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0
5
10
15
20
25 ṩ 㤾 ਦ ᆀਦ 㜊䖤 ⿽ᆀ 㣡⴨ሩ㺘䗮䟿
* 表示差异显著（P<0.05）；** 表示差异极显著（P<0.01）
图 5 红花 LTP 基因的组织表达分析
2016,32(7) 151韩怡来等：红花脂质转运蛋白基因的克隆及表达分析
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（责任编辑 马鑫）