全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(4):242-250
收稿日期 ：2015-10-19
基金项目 ：国家自然科学基金项目（21206040，21406066），国家“863”计划项目（2012AA02A303），国家重大专项（2013ZX10004003-
003-003），中央高校基本科研业务费（WF1214035）
作者简介 ：陈以衡，男，硕士研究生，研究方向 ：动物细胞的大规模培养 ；E-mail ：yihengchen91@126.com
通讯作者 ：刘旭平，男，博士，讲师，研究方向 ：动物细胞的大规模培养，E-mail ：xupingliu@ecust.edu.cn ；谭文松，男，博士，教授，研究方向 ：
动物细胞培养与组织工程，E-mail ：wstan@ecust.edu.cn
微载体浓度与细胞接种密度对 ST 细胞生长的影响
陈以衡  陶姝宇  刘旭平  谭文松
（华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237）
摘 要 ： 选择合适的微载体浓度、细胞接种密度以提高微载体利用率，优化微载体培养体系猪睾丸细胞（Swine testicle
cells）的贴附生长与维持。使用 DMEM 补加 10% 血清、LSM（Low serum medium）两种培养基考察微载体浓度、细胞接种密度对
细胞生长维持的影响，进而比较 ST 细胞在不同条件下对 Cytodex 1 微载体的利用率。结果显示，使用 LSM 在 T150 方瓶中连续传
代培养 30 d，平均比生长速率为 0.626 d-1，是 DMEM 补加 10%FBS 培养基的 1.15 倍。选择 10×105 cells/mL 细胞接种 3 g/L Cytodex
1 搅拌瓶体系，最大细胞密度为 38.3×105 cells/mL，微载体利用率上升到 58.8%。在灌注培养体系中培养 ST 细胞 15 d，最终细胞
密度达到 36.6×105 cells/mL，扩增了 13.6 倍。微载体悬浮培养的使用一方面有利于 ST 细胞的贴附与生长，实现高密度生长，另一
方面增加了微载体的使用成本，选择合适的微载体浓度、细胞接种密度，能够最大化利用微载体与培养基中的营养物质实现细胞
的最优生长。
关键词 ： 微载体 ；ST 细胞 ；猪瘟病毒 ；细胞密度
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.033
The Effects of Microcarrier Concentration and Cell Density on the
Growth of Swine Testicle Cells
CHEN Yi-heng TAO Shu-yu LIU Xu-ping TAN Wen-song
（State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237）
Abstract: This study is to select the suitable microcarrier concentration and cell seeding density for enhancing the utilization of
microcarrier，and optimize the adhered growth and maintenance of ST（swine Testicle）cells. The effects of microcarrier concentration and
seeding density on cell growth and maintenance were investigated using 2 different mediums ：DMEM supplemented 10% serum or low serum
medium（LSM）. Further，the utilizations of Cytodex 1 microcarrier by ST cells under different conditions were compared. Results were as
below：continuous culture of ST cells in T150 flask using LSM lasted for 30 days，and the average specific growth rate was 0.626 d-1，which was 1.15
times of that using DMEM supplemented with 10% FBS. The maximum cell density was 38.3×10 cells/mL and the utilization was up to 58.8%
when microcarrier concentration was 3 g/L Cytodex 1 in mixing bottle and seeding density was 10×105 cells/mL. Furthermore，when cultured
in perfusion system for 15 days，the final ST cell density reached 36.6×105 cells/mL，which amplified 14.6 times. Conclusively，the uses of
serum and microcarrier are favorable for ST cell adhesion and growth to achieve high cell density，but also this increases the cost of introducing
microcarrier. Maximum utilization of microcarrier and nutrients in the medium，and the optimal growth and maintenance could be achieved
through selecting suitable microcarrier concentration and seeding density. The results in this work provide guidance for further industrial-scale
microcarrier culture system producing CSFV vaccine.
Key words: microcarrier ；ST cells ；classical swine fever virus ；cell density
2016,32(4) 243陈以衡等：微载体浓度与细胞接种密度对 ST 细胞生长的影响
猪瘟（Classical swine fever，CSF）是由猪瘟病
毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一种急
性、发热、高度接触性的严重传染病［1］。由于猪瘟
流行爆发给养猪业、国际贸易和食品安全带来的严
重危害，世界动物卫生组织（OIE，2002）将猪瘟列
为法定必须上报的动物传染病之一，我国出台的《国
家中长期动物疫病防治规划（2012-2020 年）》中也
将其列为优先防治的五种一类动物疫病之一［2，3］。
目前国内贯彻预防为主的方针，免疫接种猪群猪瘟
兔化弱毒疫苗（HCLV）应对全国各个地区猪瘟的不
间断散发流行［4］。
猪睾丸细胞系（ST）与猪同源，是猪瘟病毒最
为易感的细胞系之一，能稳定猪瘟疫苗生产工艺并
有效提高病毒滴度，在猪瘟细胞源疫苗研究中被广
泛使用［5，6］。目前利用 ST 细胞生产猪瘟疫苗大多
采用传统的滚瓶贴壁培养工艺，操作过程繁琐，疫
苗产量有限［7］。微载体悬浮培养体系具有比表面积
大、易检测、易控制等优点，能为细胞生长及病毒
增殖提供相对优良、恒定的培养环境，在细胞源疫
苗生产中已得到广泛应用，如狂犬病疫苗、流感疫
苗等［8-11］。建立稳定高效的 ST 细胞微载体培养体系，
能克服滚瓶培养工艺的缺陷，是大规模生产细胞源
猪瘟疫苗的重要基础。
许多研究表明，细胞的生长与细胞接种密度和
微载体浓度密切相关［12-19］。一般细胞接种密度越高，
最高活细胞密度（Viable cell density，VCD）也越高，
但易引起营养物的不足与代谢副产物累积造成难以
维持高细胞密度，而较低的接种密度可能使初始细
胞量与微载体的比例过低，影响初期细胞与微载体
的接触及黏附，微载体空球现象增加 ；相应地，提
高微载体浓度可以增加贴壁面积，但同时微载体之
间碰撞的几率增加，造成细胞损伤机会也增多，细
胞扩增倍数未能按理想状况成比例增加，此时，过
高浓度的微载体会增加成本。因此，在 ST 细胞大规
模培养过程中，选择合适的微载体浓度与细胞接种
密度提高微载体利用率，对细胞增殖、维持和后期
接种病毒的扩增效率尤为重要。
本研究在本实验室前期自行设计开发的 ST 细胞
低血清贴壁培养基与 DMEM+10%FBS 两种培养基基
础上，考察微载体浓度及细胞接种密度对细胞生长
代谢的影响，旨在提高微载体利用率，并在灌注培
养体系初步实现 ST 细胞的培养。
1 材料与方法
1.1 材料
实验所用贴壁依赖型猪睾丸传代细胞系 ST 细
胞株（Swine testis cells）购自中国兽医药品监察所。
贴壁型 ST 细胞培养用培养基 ：DMEM（Gibco 公司）
补加 3.7 g/L 碳酸氢钠（Amresco 公司），添加 10%
胎 牛 血 清 FBS（Fatal Bovine Serum， 南 京 Wisent
公司）。
贴壁型 ST 细胞培养用低血清培养基 ：本实验室
自行设计开发，包括葡萄糖、氨基酸、维生素、无
机盐和金属离子等成分，补加 1%FBS。
1.2 方法
1.2.1 ST 细胞培养方法
1.2.1.1 ST 细胞方瓶培养 待贴壁型 ST 细胞生长至
铺满方瓶（TPP 公司）底部约 80%-90% 时，吸去培
养基，PBS 漂洗 2-3 次，加入 0.25%（W/V）胰酶（Sigma
公司）-0.05%（W/V）EDTA（Sigma 公司）消化液
置于 37℃、5%CO2 饱和湿度培养箱孵育，当细胞收
缩变圆，轻摇方瓶至脱落时，稀释接种，接种密度
为 2×105-3×105 cells/mL。
1.2.1.2 ST 细胞搅拌瓶贴壁培养 所用微载体为
Cytodex 1（GE Healthcare）。称量所需微载体于 125
mL 搅 拌 瓶（Corning 公 司 ），PBS 洗 涤 3 次 至 微 载
体水化、膨胀完全后去除多余 PBS，121℃湿热灭
菌 30 min 待用。将消化后的细胞种子液接种至装
有微载体的无菌搅拌瓶，培养液体积为 100 mL，
放置于 37℃、5%CO2 饱和湿度培养箱中搅拌平台
（INTEGRA）培养，搅拌转速为 50 r/min，每 24 h 取
样进行细胞计数与代谢分析。
1.2.1.3 ST 细胞灌注培养 采用自制灌注培养设
备进行细胞灌注培养。如图 1 所示，该装置主要由
灌注培养腔（120 mL）、培养基存贮瓶（120 mL）、
灌注循环系统构成。使用 3 g FibraCel disk 微载体
（NBS 公司）。将消化后的细胞种子液转移到经高压
灭菌的灌注培养装置中，接种密度 2×105 cells/mL
于 37℃、5%CO2 饱和湿度培养箱中进行灌注培养，
控制培养基流速为 2.5 mL/min，每 24 h 取样进行代
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4244
谢分析，每 3 d 进行存贮瓶全换液，培养 15 d 后取
出微载体进行细胞密度检测。
1.2.2 有关操作参数的实验方法
1.2.2.1 微载体浓度对 ST 细胞生长代谢的影响 将
5×105 cells/mL ST 细胞接种至 125 mL 搅拌瓶，搅拌
瓶中微载体用量分别为 1、3、5 和 7 g/L。
1.2.2.2 细 胞 接 种 密 度 对 ST 细 胞 生 长 代 谢 的 影
响 接种微载体用量为 3 g/L 的 125 mL 搅拌瓶，接
种 密 度 分 别 为 1×105、3×105、5×105 和 10×105
cells/mL。
1.2.3 分析方法
1.2.3.1 细胞密度与增殖参数测定 微载体上贴附
生长的细胞以 0.1% 低渗结晶（贝基生物科技有限公
司）-0.1 mol/L 柠檬酸（Sigma 公司）染液染色，台
式振荡器 37oC 振荡过夜，PBS 稀释至适当浓度后用
血球计数板计数紫色细胞核。
1.2.3.2 DNA 含量检测 取 10 片 disk 于 EP 管中，
PBS 漂洗后，经 1 mL 0.5 g/L 木瓜蛋白酶（Sigma 公
司）恒温水浴锅 60℃孵育 24 h，-20℃冻存待用。事
先 配 制 100 ng/mL Hoechst 33258（Invitrogen 公 司 ）
TNE 溶液，并提取 2.68×106 cells/mL 细胞悬液所含
DNA，按 Hoechst 荧光定量法在 350 nm 波长下使用
核酸蛋白荧光分析仪（Bio-Rad）测量荧光强度并绘
制 DNA 标准曲线，取 5 μL 样品 DNA 进行含量测定
并换算成细胞密度。
1.2.3.3 搅拌瓶中细胞培养的代谢物浓度测定 葡
萄糖浓度测定采用葡萄糖试剂盒（上海科欣生物试
剂公司），操作按使用说明书进行。乳酸浓度测定采
用乳酸测定试剂盒（南京建成生物工程公司），操作
按使用说明书进行。氨浓度采用尿素氮试剂盒（上
海申索试剂有限公司）测定，操作按使用说明书
进行。
1.2.3.4 灌注装置中细胞培养代谢物浓度测定 培
养过程中葡萄糖、乳酸、氨的浓度和 pH 值均采用
全自动生化分析仪 BioProfile 400 Analyzer 测定。
1.2.4 计算方法
1.2.4.1 细胞比生长速率的计算 比生长速率 μ 通
过以下公式计算 ：
μ=
1
Xv
×
dXv
dt
式中，XV ：活细胞密度（106 cells/mL），t ：培养时
间（d）。
1.2.4.2 葡萄糖比消耗速率、乳酸比生产速率的计
算 葡萄糖的比消耗速率和乳酸的比生成速率计算
方法相似，以葡萄糖比消耗速率为例，通过以下公
式计算 ：
qgluc =
ΔP
ΔIVC
式中，qgluc ：葡萄糖的比消耗速率（mmol/10
9 cells/
day），代表细胞消耗葡萄糖的速率 ；P ：葡萄糖的浓
度（mmol/L）；IVC ：微载体上贴附生长的总细胞数
目对时间的积分（109 cells·day）。
1.2.4.3 乳酸对葡萄糖的转化率的计算 乳酸对葡
萄糖转化率 Ylac/gluc（mmol/mmol）通过下式计算。
Ylac/gluc=qlac/qgluc
2 结果
2.1 两种培养基中ST细胞增殖能力比较
分别使用 DMEM 和 LSM 两种培养基在 T150 方
瓶中连续传代培养 ST 细胞 30 d，比较两者 ST 细
胞 比 生 长 速 率。ST 细 胞 在 DMEM 培 养 基 中 平 均
比生长速率为 0.545 d-1（图 3-A）；在 LSM 培养基
中，ST 细胞平均比生长速率为 0.626 d-1（图 3-B）。
相比 DMEM 培养基，ST 细胞在 LSM 中以更高的比
生长速率连续稳定传代。
2.2 微载体浓度对细胞生长代谢的影响
图 3-A 是使用 DMEM 培养基搅拌瓶培养体系，
不同微载体浓度条件下 ST 细胞密度随时间的变化。
固定细胞接种密度为 5.0×105 cells/mL 时，4 个条件
下的 ST 细胞密度在接种后 24 h 内细胞密度变化基
Pc
rf
us
io
n
ch
am
be
r
Fl
ow
d
ire
ct
io
n
M
cd
iu
m
rc
sc
rv
oi
r
Peristaltic pump
图 1 灌注培养体系装置与示意图
2016,32(4) 245陈以衡等：微载体浓度与细胞接种密度对 ST 细胞生长的影响
本一致，且均在第 3 天达到最大，分别为 16.6×105、
14.6×105、15.1×105 和 9.5×105 cells/mL。 随 着 微
载体浓度的上升，最大细胞密度不升反降，在微载
体浓度为 7 g/L 条件下，细胞生长缓慢仅扩增 0.9 倍。
从 ST 细胞增殖情况较好 5 g/L 微载体浓度的倒置显
微镜明场（图 3-C）可以看出，使用 DMEM 培养基
在培养过程中始终存在微载体未贴满的现象。
对比图 3-B 使用 LSM 培养基搅拌瓶体系培养
ST 细胞，4 组不同微载体浓度实验组 ST 细胞密度分
别在第 4 天、第 7 天、第 9 天、第 10 天时达到最大，
为 23.2×105、29.3×105、39.6×105 和 47.4×105
cells/mL，均显著高于相同条件下 DMEM 培养基对
22
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
22
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
C
el
l d
en
si
ty
/105 cells·mL-1 
C
el
l d
en
si
ty
/105 cells·mL-1 
Culture time/d
μ/
d-
1
μ/
d-
1
Culture time/d
Cell density
μ
Cell density
μ
A B
图 2 ST 细胞 T150 方瓶连续传代曲线
C
A B
D
24 h 96 h
72 h 144 h
120 h24 h
240 h96 h
0
10
20
30
40
50
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
C
el
l d
en
si
ty
/105 cells·mL-1 
Culture time/d
1 g/L
3 g/L
5 g/L
7 g/L
0
4
8
12
16
20
0 1 2 3 4 5 6 7 8
C
el
l d
en
si
ty
/105 cells·mL-1 
Culture time/d
1 g/L
3 g/L
5 g/L
7 g/L
200 μm 200 μm
200 μm 200 μm
200 μm 200 μm
200 μm 200 μm
图 3 不同微载体浓度条件下 ST 细胞生长曲线与贴附情况（40×）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4246
应实验组的最大细胞密度。1 g/L 微载体用量的实验
组在第 4 天细胞密度达到最大后，存在一个维持了
5 d 的平台期。并且从该条件下 ST 细胞显微镜明场
（图 3-D）也可以看出，培养过程中，微载体几乎始
终处于满球的状态。
从细胞培养中葡萄糖、乳酸和氨的浓度变化
来看，使用 LSM 葡萄糖消耗情况并未有显著差别，
4 个微载体浓度条件下第 13 天葡萄糖浓度分别为
5.60、5.99、3.23 和 1.88 mmol/L（ 图 4-A）。 氨 均 未
大量生成，培养结束时分别为 3.77、4.56、3.81 和
3.23 mmol/L（图 4-C）。而副产物乳酸在培养过程
中呈现持续累积的情况，培养结束时分别为 17.2、
20.7、13.4 和 11.3 mmol/L（图 4-B）。从图 4-D 可以看
出，微载体浓度为 7 g/L 的条件下乳酸对葡萄糖的得
率最低，3 g/L 条件下该得率最高。
根据单个 ST 细胞贴壁面积约为 200 μm2，每克
Cytodex 1 能提供的生长表面积为 4 400 cm2。计算不
同浓度微载体理论最高 ST 细胞密度，并与实际值相
比得到微载体的利用率进行比较（表 1）发现，3 g/L
的微载体用量既能提供充足的贴壁面积，又能保持
较高的微载体利用率，所以使用该浓度进一步研究
细胞接种密度对细胞生长的影响。
表 1 LSM 不同微载体浓度条件下的微载体利用率
微载体浓度 /
（g·L-1）
理论最高细胞密
度 /（105cells·mL-1）
实际最高细胞密
度 /（105cells·mL-1）
微载体
利用率 /%
1 22 23.2 105.5
3 66 29.3 44.4
5 110 39.6 36.0
7 154 47.4 30.8
2.3 细胞接种密度对细胞生长代谢的影响
图 5-A 是使用 DMEM 培养基搅拌瓶培养体系，
不同 ST 细胞接种密度条件下细胞密度随时间的变
化。固定微载体浓度为 3 g/L 时，不同细胞接种密
0
5
10
15
20
25
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
La
ct
at
e
co
nc
en
tra
tio
n/
mmol·L-1 
Culture time/d
1 g/L
3 g/L
5 g/L
7 g/L
0
2
4
6
8
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
A
m
m
on
iu
m
C
on
ce
nt
ra
tio
n/
mmol·L-1 
Cultue time/d
1 g/L
3 g/L
5 g/L
7 g/L
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
G
lu
co
se
c
on
ce
nt
ra
tio
n/
mmol·L-1 
Culture time/d
1 g/L
3 g/L
5 g/L
7 g/L
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1 3 5 7
Y
la
c/
gl
uc
Microcarrier concentration/g·L-1
A B
C D
A ：葡萄糖 ；B ：乳酸 ；C ：氨 ；D ：Ylac/gluc
图 4 LSM 不同微载体浓度对 ST 细胞代谢的影响
2016,32(4) 247陈以衡等：微载体浓度与细胞接种密度对 ST 细胞生长的影响
度条件下，4 个实验组分别在第 2 天、第 3 天、第 5
天和第 6 天达到最大细胞密度，分别为 17.4×105、
16.2×105、15.9×105 和 14.4×105 cells/mL，并没有
显著差异。对比图 5-B，使用 LSM 搅拌瓶培养体系
考察细胞接种密度对细胞生长的影响，当微载体浓
度为 3 g/L，不同细胞接种密度分别出现在第 5 天，
第 6 天、 第 7 天、 第 8 天 达 到 最 大 细 胞 密 度， 为
37.9×105、29.4×105、29.3×105 和 27.1×105 cells/
mL，与初始接种密度相比，分别增殖了 2.88 倍、4.86
倍、8.80 倍 和 26.10 倍。IVCC 分 别 为 38.1×109、
A B
0
10
20
30
40
50
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
C
el
l d
en
si
ty
/105 cells·mL-1 
Culture Time/d
10×105 cells/mL 5×105 cells/mL
3×105 cells/mL 1×105 cells/mL
0
5
10
15
20
25
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
C
el
l d
en
si
ty
/105 cells·mL-1 
Culture Time/d
10×105 cells/mL 5×105 cells/mL
3×105 cells/mL 1×105 cells/mL
图 5 不同细胞接种密度条件下 ST 细胞贴壁生长曲线
B
C D
A
0
5
10
15
20
25
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
La
ct
at
e
co
nc
en
tra
tio
n/
mmol·L-1 
Culture time/d
10×105 cells/mL
5×105 cells/mL
3×105 cells/mL
1×105 cells/mL
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
G
lu
co
se
c
on
ce
nt
ra
tio
n/
mmol·L-1 
Culture time/d
10×105 cells/mL
5×105 cells/mL
3×105 cells/mL
1×105 cells/mL
0
2
4
6
8
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
m
m
on
iu
m
c
on
ce
nt
ra
tio
n/
mmol·L-1 
Culture time/d
10×105 cells/mL
5×105 cells/mL
3×105 cells/mL
1×105 cells/mL
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
10 5 3 1
Y
la
c/
gl
uc
Inoculation density/105cells·mL-1
A ：葡萄糖 ；B ：乳酸 ；C ：氨 ；D ：Ylac/gluc
图 6 LSM 不同 ST 细胞接种密度条件下对细胞代谢的影响
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4248
26.7×109、25.2×109 和 20.5×109 cells.d/L。 微 载 体
利用率分别为 57.4%、44.5%、44.4% 和 41.0%。
从细胞培养过程中葡萄糖、乳酸和氨的浓度变
化来看，使用 LSM 葡萄糖消耗趋势并未有显著差别，
四组细胞接种密度条件下，葡萄糖浓度在培养结束
时分别为 5.63、5.99、3.23 和 1.88 mmol/L（图 6-A）。
氨均未大量生成，培养结束时分别为 2.99、4.02、
3.67 和 2.93 mmol/L（图 6-C）。而副产物乳酸在培
养过程中持续累积，培养结束时分别为 13.8、18.0、
20.7 和 20.9 mmol/L（图 6-B）。从图 6-D 可以看出，
10×105 cells/mL 时，乳酸对葡萄糖的得率最低 ；而
当细胞接种密度为 3×105 cells/mL 时，乳酸对葡萄
糖的得率最高。
2.4 灌注体系培养过程中ST细胞生长与代谢
如图 7 所示，使用 LSM 进行 ST 细胞灌注体系
培养，在第 4 天（第一次换液）后，葡萄糖浓度在
28.25-35.35 mmol/L 的范围内波动，培养结束时浓度
为 25.52 mmol/L，代谢副产物氨的浓度在 2.56-3.72
mmol/L 的范围内稳定波动，培养结束时浓度为 3.02
mmol/L。但代谢副产物乳酸的浓度呈现持续上升的
现象，培养结束时乳酸浓度为 25.00 mmol/L，对应
的 pH 值也呈现持续下降的现象，培养结束时 pH
值 6.87。如图 8 所示，以 2、4、6、9、12 和 15 μL
26.8×105 cells/mL 细胞悬液 DNA 吸光值做标准曲线。
灌注培养 15 d ST 细胞终密度为 36.6×105 cells/mL，
扩增了 13.6 倍，经过计算得到此时微载体利用率为
24.4%。
3 讨论
从上述研究中我们发现，在 1-7 g/L 微载体用量
范围内，使用 DMEM 培养基在搅拌瓶培养体系中接
种相同密度的 ST 细胞，随着微载体浓度的上升，最
大细胞密度不升反降。在初始 24 h 内细胞密度变化
基本一致，说明并不是细胞贴附阶段贴附率的差异
导致高微载体浓度低细胞密度现象的发生，结合倒
置显微镜下 5 g/L 微载体浓度细胞贴附情况，可以得
到即使在提供了充足的微载体贴壁面积条件下，ST
50
40
30
20
10
35
30
25
20
15
10
5
0
5
4
3
2
1
0
7.4
7.2
7.0
6.8
6.6
0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 2 4 6 8 10 12 14 16
0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 2 4 6 8 10 12 14 16
Culture time/d Culture time/d
Culture time/d
A
m
m
on
iu
m
c
on
ce
nt
ra
tio
n/
mmol·L-1 Glucose concentration/
m
m
ol
·L
-1

pH
La
ct
at
e
co
nc
en
tra
tio
n/
mmol·L-1 
Culture time/d
A B
C D
A ：葡萄糖 ；B ：乳酸 ；C ：氨 ；D ：pH
图 7 LSM 灌注培养体系 ST 细胞代谢
2016,32(4) 249陈以衡等：微载体浓度与细胞接种密度对 ST 细胞生长的影响
细胞仍不能以较高效率利用提供的贴附面积。这很
有可能是在平均每个微载体接种细胞数较少的情况
下，DMEM 培养基不能较好地支持 ST 细胞在微载
体上良好的延伸和增殖导致的。此时，1 g/L 与 5 g/L
微载体浓度下能得到相对较高的细胞密度，相对 1 g/L
微载体 75.5% 的利用率，5 g/L 微载体利用率仅为
13.7%，过多微载体的使用并没有显著增加细胞密度
反而大大增加了成本。何锡忠等［20］对 PK-15 细胞
搅拌瓶培养的研究同样发现，微载体浓度与 PK-15
细胞密度仅有一定程度的相关性，高浓度微载体的
表面积并没有被充分利用。
使用 LSM 培养基，搅拌瓶体系中最大细胞密度
随着微载体浓度的上升而上升，且出现时间也随之
推迟。1 g/L 微载体用量的实验组在达到最大细胞密
度后存在为期 5 d 的平台期，结合该条件下倒置显
微镜可以看出是贴附面积有限导致的。此时，3 g/L
是较为理想的浓度，既能提供充足的贴壁面积，又
能保持 44.4% 的微载体利用率，最大细胞密度可以
达到 29.3×105 cells/mL。在此基础上进一步考察优
化细胞接种密度，提高细胞接种密度可以增加最大
细胞密度，选择 10×105 cells/mL 接种，最大细胞密
度达到 37.9×105 cells/mL，扩增了 2.88 倍，微载体
利用率达到 57.4%，并且存在一个维持 5 d 的平台
期，代谢副产物积累对培养环境造成压力较小，这
对于我们最终生产猪瘟病毒的目的是有利的。但需
要注意的是，在 DMEM 培养基中，高密度接种虽然
减少了达到最大细胞密度的时间，但最大细胞密度
并没有显著增加，并且也不能较好维持细胞密度，
0 2 4 6 8 10 12 14 16
DNA Content/μL
y=39.202x+77.101
R2=0.9968
H
oe
ch
st
/O
D
800
700
600
500
400
300
200
100
0
图 8 灌注系统 DNA 含量 Hoechst 检测
此时不能盲目增加接种密度。有很多研究得到细胞
与微载体的最优接种比［16，20］，如 PK-15 细胞以 10-
15 cells/MC 接种时生长状态最优。我们的结论进一
步证明微载体的用量与接种密度仍需要根据细胞在
不同培养基中增殖延伸能力的差异设置更为合理的
范围。
最终，使用 LSM 培养基在灌注培养体系中培养
ST 细胞，细胞密度达到 36.6×105 cells/mL，扩增了
14.6 倍，FibraCel disk 微载体利用率为 24.4%，与使
用 Cytodex 1 搅拌瓶培养体系有一定差距，为期 3 d
的换液间隔导致大量乳酸的累积可能是其原因。后
续实验拟减少换液时间，提高细胞接种密度，保持
培养过程中低浓度乳酸含量，以期在灌注培养体系
得到高细胞密度并提高微载体利用率。
4 结论
本研究使用 DMEM 补加 10%FBS 与 LSM 两种
培养基，通过考察微载体浓度与细胞接种密度对搅
拌瓶培养体系中 ST 细胞增殖维持能力的影响，提高
了微载体利用率，优化了细胞生长。进一步在灌注
培养体系中初步实现了 ST 细胞片状微载体培养。
参 考 文 献
［1］ Fernandez-Sainz IJ, Largo E, Gladue DP, et al. Effect of specific
amino acid substitutions in the putative fusion peptide of structural
glycoprotein E2 on classical swine fever virus replication［J］.
Virology, 2014, 121（30）：456-457.
［2］孙石静 , 董彦鹏 , 缪芬芳 , 等 . 我国当前猪瘟疫苗特点及科学免
疫［J］. 畜禽业 , 2014（3）：4-6.
［3］Kleiboeker SB. Swine fever ：classical swine fever and African swine
fever［J］. Vet Clin North Am Food Anim Pract, 2002, 18（3）：
431-451.
［4］Stegeman A, Elbers A, de Smit H, et al. The 1997-1998 epidemic
of classical swine fever in the Netherlands［J］. Veterinary
Microbiology, 2000, 73（2-3）：183-196.
［5］Grummer B, Fischer S, Depner K, et a1. Replication of classical
swine fever virus strains and isolates in different porcine cell
lines［J］. Dtsch Tierarztl Wochenschr, 2006, 113（4）：138-142.
［6］平玲 , 魏园园 , 王家敏 , 等 . 猪瘟疫苗的研究进展及 ST 细胞苗
的研究现状［J］. 当代畜禽养殖业 , 2014（3）：3-6.
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.4250
［7］Barrias CC, Ribeiro CC, Lamghari M, et al. Proliferation, activity,
and osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells cultured
on calcium titanium phosphate microspheres［J］. Journal of
Biomedical Materials Research Part a, 2004, 72（1）：57-66.
［8］Paillet C, Forno G, Kratje R, et al. Suspension-Vero cell cultures as a
platform for viral vaccine production［J］. Vaccine, 2009, 27（46）：
6464-6467.
［9］ Rourou S, van der Ark A, Majoul S, et al. A novel animal-component-
free medium for rabies virus production in vero cells grown on
Cytodex 1 microcarriers in a stirred bioreactor［J］. Applied
Microbiology and Biotechnology, 2009, 85（1）：53-63.
［10］Bock A, Schulze-Horse J, Schwarzer J, et al. High-density
microcarrier cell cultures for influenza virus production［J］.
Biotechnology Progress, 2011, 27（1）：241-250.
［11］ Souza MC, Freire MS, Schulze EA, et al. Production of yellow fever
virus in microcarrier-based Vero cell cultures［J］. Vaccine,
2009, 27（46）：6420-6423.
［12］郭燕华 , 郭勇 , 罗立新 . 微载体培养技术的研究进展［J］. 中
国生物工程杂志 , 2001, 21（5）：56-58.
［13］Bock A, Schulze-Horse J, Schwarzer J, et al. High-density
microcarrier cell cultures for influenza virus production［J］.
Biotechnology Progress, 2011, 27（1）：241-250.
［14］ Hu WS, Meier J, Wang DIC. A mechanistic analysis of the
inoculum requirement for the cultivation of mammalian cells on
microcarriers［J］. Biotechnology & Bioengineering, 2006, 95（2）：
306-316.
［15］ Forestell SP, Kalogerakis N, Behie LA, et al. Development of the
optimal inoculation conditions for microcarrier cultures［J］.
Biotechnology & Bioengineering, 1992, 39（3）：305-313.
［16］Bock A, Sann H, Schulze-Horsel J, et al. Growth behavior of
number distributed adherent MDCK cells for optimization in
microcarrier cultures［J］. Biotechnology Progress, 2009, 25（6）：
1717-1731.
［17］ Gnzel Y, Olmer RM, Schafer B, et al. Wave microcarrier cultivation
of MDCK cells for influenza virus production in serum containing
and serum-free media［J］. Vaccine, 2006, 24（35-36）：6074-
6087.
［18］Conceição MM, Tonso A, Freitas CB, et al. Viral antigen production
in cell cultures on microcarriers［J］. Vaccine, 2007（45）：
7785-7795.
［19］Hu AY, Weng TC, Tseng YF, et al. Microcarrier-based MDCK cell
culture system for the production of influenza H5N1 vaccines［J］.
Vaccine, 2008, 26（45）：5736-5740.
［20］何锡忠 , 李春华 , 倪建平 , 等 . 微载体培养 PK-15 细胞试验条
件的优化［J］. 动物医学进展 , 2010, 31（8）：20-23.
（责任编辑 李楠）