全 文 ：第27卷第1期
2008年2月
生态科学
EcologicalS ience
27(1)：24—30
Feb．2008
锯缘青蟹(Scyllaserrata)Hsp70基因cDNA的克隆
及序列分析
袁嘉恩，许忠能，韩博平，孔义军，雷腊梅’，谢数涛’
暨南大学水生生物研究所，广州510632
【摘要】 采用RT．PCR及RACE技术克隆锯缘青蟹(Scyllaserrata)的热休克蛋I圭tHsp70基因并进行序列分析。克隆测序
后拼接得到一条长2482bp的eDNA序列，该序歹IJORF(Openreadingframe，开放阅读框)为1950bp，编码649个氨基酸，
分子量约为71．06kD，理论等电点为5．24。3’UTR(untranslatedregion，非编码区)为158bp， ’UTR为40bp。通过antheprot
分析发现2个Hsp70家族的签名序列：IFDLGGGTFDVSIL，ⅣLVGGSTRIPKIQK；Onak特征基序DLGTT．S-V；非细胞器
基序：RARFEEL：核定位信号标签：KKDPSESKRALRRL；胞质Hsp70特征基序EEVD。同源性分析表明，锯缘青蟹Hsp70
编码区核苷酸序列与凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)、斑节对虾(Penaeusmonodon)、罗氏沼虾(Macrobrachium
rosenbergiO的相似性分别为84．02％、83．87％和79．60％：核苷酸序列所推导出的Hsp70氨基酸序列，与凡纳滨对虾、斑节
对虾和罗氏沼虾的相似性分别为92．79％、92．17％和96．47％。本研究克隆了锯缘青蟹Hsp70基因，为进一步深入研究锯
缘青蟹的抗逆机理及其遗传改良奠定了基础。
关键词：Hsp70基[]；RACE；RT．PCR；锯缘青蟹
中图分类号：Q915．819+．6文献标识码：A 文章编号：1008．8873(2008)01．24—07
RACEcloneHsp70geneORFofScyllaserratandsequenceanalysis
YUANJia-en，XUZhong—neng，HANBo-ping，KONGYi-jun，LEILa-mei’，XIEShu．tao+
InstitutionofHydrobiology,JinanUniversity，Guangzhou510632，China
Abstract：HeatshockproteinHsp70geneofScyllaserratawasclonedbyRACEandRT—PCR．Thefulll ngtheDNAofhsp70
obmined2482b，containingallORFof1950bp，encoding649aminoacidresidueswithestimatedmolecularwei．ghtof71．06kD
andtheoreticalisoc eetricpointof5．24，a3’UTRof158bp，a5’UTRof40bp．Bytheanalyseofantheprot,twosignature
sequencesofHSP70family：IFDLGGGTFDVSIL，肌VGGSTRIPⅪQKDnaksequence：DLGTT-S—V，thenon—organ llar
motif：RARFEEL，bipartitenuclearlocalizafionsignal：KKDPSESKRAI．RItL，andC-terminalfourminoacidsofHsp70：EEVD
、怵detectedinthepredictedaminoacidsequence．Throughblastanalysis．theORFoftheHsp70genesequenceofScylla
serratahas84．02％identitywiththeHsp70CDNAsequenceofLitopenaeusv nnamei．and83．87％identitywithPenaeus
monodon,and79．60％identitywithMacrobrachiumrosenbergii．UnderthealignmentofHsp70aminoaeidseducedfromDNA
sequences，thereis92．17％identitybe weenScyttaserratandPenaeusmonodon，and92．“％identitybe weenScyllaserrata
andMacrobrachiumrosenbergiLand96．47％identitybetweenScyllaserratandMacrobrachiumrosenbergii．
Keywords：Hsp70gene；RT—PCR；RACE；Scyttaserrata
收稿日期：2007．10—21收稿．2008．02．12接受
基金项目：国家自然科学基金资助项(04300664)
作者简介：袁嘉恩(1980--)，男，在读硕士研究生，研究方向为甲壳纲动物热休克蛋白与分予免疫。E-mail·pbgain@163．coITI
木通讯作者：雷腊梅，deilam@jnu．edu．cn，谢数涛，stxie@uab．edu
万方数据
1前言(Introduction)
热休克蛋I刍(heatshockproteins，Hsps)是一组广
泛存在于生物体内高度保守的蛋白质家族【11。当机体
受到环境胁迫或有害刺激后会迅速作出细胞代谢机
能的调整，细胞会抑制一些普通状态下常量表达的蛋
白，而激活并大量表达这一组特殊而重要的蛋白，
Hsp70是热休克蛋白质家族当中最重要的一员[1-2]。
Hsp70与机体抗逆性密切相关，对环境刺激反应极为
敏感，当外界温度比机体正常生长温度高约5℃时就
会诱导合成Hsp70[31，Hsp70通过防止蛋白的凝聚及
变性以赋予细胞和组织的耐受性，在其他环境胁迫因
子，如低氧、病原入侵、重金属等的刺激下都可以诱
导机体大量表达Hsp70。Hsp70对维持细胞内稳态，
改善细胞的生存能力和减轻有害刺激损伤有十分重
要作用[4-51。
锯缘青蟹(&serrata)是我国东南部重要的海水
养殖蟹类，对当地水产养殖业有巨大的经济价值⋯。
目前锯缘青蟹主要养殖于潮间带滩涂和风浪较小海
区内湾等浅海海域，天气变化对浅海养殖的制约明
显，如台风带来的强降水、盛夏持续高温等，很容易
使浅水海域养殖水质的理化指标如盐度、pH值等发
生骤变，进而引起蟹类疾病如黄水病、腹水病、黄斑
病等大规模发生，严重威胁锯缘青蟹养殖产业167-s】。
随着养殖规模的不断扩大，天气变化对养殖所能产生
的巨大影响愈发严重，于是诱导青蟹内部的抗逆机
制，增强其自身抵御环境突变能力显得势在必彳亍【"。
因此，研究Hsp70对于锯缘青蟹应激发病的控制有重
要现实意义。
有关锯缘青蟹热休克蛋白方面的研究还很缺乏。
为此，本实验通过RT．PCR(reversetranscriptasechain
reaction,反转录多聚酶链式反应)和RACE(rapid
amplificationofeDNAends，eDNA末端快速扩增)技
术扩增其Hsp70基因编码区，最后拼接而获得全长核
苷酸序列，并进一步分析其推导的氨基酸序列，为深
入研究Hsp70基因与对锯缘青蟹应激发病打下基础。
2材料与方法(Materialandmethods)
2．1锯缘青蟹总RNA的提取
锯缘青蟹购自广州黄沙水产批发市场，体长约
20em，体重约400g，实验室暂养2d(25℃恒温)。
解剖，活体取100mg肌肉组织放液氮中速冻，用
Trizol(invitrogen公司)试剂提取总RNA。提取的RNA
通过琼脂糖电泳进行鉴定后，贮于．80℃冰箱，备用。
2．2引物设计与RT．PCR
根椐GenBank中凡纳滨对虾Hsp70基因eDNA
序列(登录号AY645906)，用oligo6．0软件设计引物，
引物序列如表l所示。
表1实验中所用的引物序列
Table1 Sequencesofprimersusedinthisstudy
引物名称Pfimers引物序列Primerssequences(5’-+3’)
Bf
Cf
Pl
P2
Oligo(dT)17-adapter
Oligo(dGh6
P3
P4
GGCCGATAATCCAAGCAACAC
GGCACGATCTCCCTCATCCAC
CAGGGCCCAGAn门WrGACGT
TGCCCTGATCAAACGTGACAG
GGCCACGCGTCGACTAGl=ACTl7
GGCCACGCGTCGACTAGTACGl6
GGCGArI孙j6玎．ACGTCAATGAA
TCACCGCACTCTATCTl=ATp盯
逆转录反应使用TOYOBO公司的RevecTraAce试
剂盒，合成第一链eDNA，适量DEPC水完全溶解，-20
℃冰箱保存。取lⅣL合成液，引物Bf和Cf进行PCR，
预期扩增基因中间片段约1．1妨。50pLPCR反应体系
中含dNTPs各200／anol·L1，上下游引物各100prnol·L．‘，
Taq酶2．5U，进行PCR扩增，反应程序见表2。
表2实验中各PCR反应程序，括号内为第二轮PCR参数
Table2PCRprocessesu dinthisstudy．inthebracketith
theparametersofsecondroundofPCR(℃．S"1)
万方数据
2．3 5’RACE和3、RACEPCR
采用TaKaRa公司RNaseH酶和TdT酶，分别对
第一链eDNA纯化处理和加尾反应。5’RACE第一轮
使用引物P3和OdGl6，第二轮使用P4和OdGl6。
3、RACE第一轮使用引物Pl和接头引物OdTl7，第二
轮使用引物P2和接头引物OdTl705、RACE和3、RACE
的PCR反应体系与RT．PCR相同，反应程序见表2。
2．4 PCR产物的连接克隆和测序
所有PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳观察扩增
结果，用Qiagen公司的QIAquickgelextractionkit
回收纯化。采用T-A克隆的方法，把PCR产物克隆
到TaKaRa的Pmdl8一T载体。经鉴定后，阳性克隆
产物经广州拓普公司进行双向测序．
3结果与分析(Resultsandanalysing)
3．1总RNA的提取和RT—PCR及RACE
用Trizol试剂提取总RNA，结果如图1。以B印
C伪RT．PCR引物扩增基因中间片断，扩增产物经1％
琼脂糖凝胶电泳，紫外下观察，结果如图2；以P3、P4
和OdGl6为5’RACE引物扩增锯缘青蟹Hsp70基因
eDNA5、片段，结果如图3；以P1、P2和OdTl7为3、
RACE引物扩增锯缘青蟹Hsp70基因eDNA3’片段，
结果如图4。由图可知，扩增片段大小分别约在1100
kb，650kb和900kb左右，与预期扩增片段大小相
近。将此片段在紫外下切割，用QIAquickgel
extractionkit试剂盒纯化回收。
图1锯缘青蟹卵组织总RNA电泳
Fig．1AgarosegelelectrophoresisoftotalRNAofS．serrata
OVUm
理论等电点为5．24。通过BLASTn软件，将锯缘青蟹开
放阅读框的核酸序列凡纳滨对虾化．vannamei)、斑节对
虾(Pmonodon)、虹鳟(Oncorhynchusmykiss)和珠鸡
(Numidameleagris)的Hsp70基凶序列作比较分析，结
果如表3。
M：标准分子量1：eDNA中间片段扩增产物
M：DNAmarkerl：productofeDNAmiddlefragmentamplification
图2锯缘青蟹Hsp70基因cDNA中问片段RT—PcR扩增
Fig．2RT-PCRamplificationofcDNAmiddlefragmentof
HspT0geneinS．serrata
M：标准分子量l：5’PACE扩增产物
M：DNAmarker1：productof5’PACEamplification
图3锯缘青蟹Hsp70基因cDNA片段的5’RACE扩增
Fig．35、RACEamplificationofcDNAfragmentofHsp70
genein&serrata
3．2核苷酸序列分析 M：DNAmafk盯l：吣t。f3-RAcE枷plifi洲。n
用软件DNAm觚分析测序结果，发现该序列含有图4锯缘青蟹Hsp70基因cDNAYf段13J3、RACE扩增
一食长1950b．p的开放阅读框，分布量¨8～2068bp， Fig．43，RACEamp师cati。n。fcDNAragmentofHsp70
共编码“9个氨基酸，总相对分子质量约7l·06kD，
geneinS．serrata
万方数据
3．3氨基酸序列分析
如图5，用蛋白质软件antheprot分析锯缘青蟹
Hsp70基因，发现2个Hsp70家族的签名序列：
IFDLGGGTFDVSIL([LIVMF]一[LIVMFY]-[DN]．[LIVMF
S】-G一[GSH]·【Gs】-[AST]一x(3)·IST]-[LIVM]一[LIVMFC])；
IVLVGGSTRIPKIQK([LIVMY]一x·[LIVMF]·x—G-G-x一【S
T】-{LS)一[LIVM]⋯Px[LIVM]一x一[DEQKRSTA])阴，Dnak
特征基序IDLGTT．S．V，由AEAYLGAA组成的
ATP．GTP结合位点，由RARFEEL组成的非细胞器基
序，由KKDPSESKRALRRL组成的核定位信号标签，
如图6。靠近C未端有一段简并重复的GGMP四肽
(627～642)，C末端是保守的GPTIEEVD序列，这个
保守的末端氨基酸存在于绝大多数真核生物的
Hsp70qb，是一种细胞质特异性调控基序，它影响ATP
酶结构域的活性和与底物结合的活力，在热休克状态
下调控Hsp70mRNA的转录量[io-i1】。由此表明所克隆
的锯缘青蟹Hsp70基因是Dnak类型的细胞质Hsp70基
因【21。
表3不同物种的Hsp70核苷酸序列相似性的比较(％)
Table3 ComparisonofHsp70Nucleotidesequencesof
differentspecies(％)
类别 凡纳滨对 斑节对虾 虹鳟 珠鸡
Species蓊L．P． OncorhyncNumida
vannameimonodonhusmyk括smeleagris
4讨论(Discussion)
Hsp70家族在进化上高度保守，具有一个普遍的
结构：N端分子量45kDa大小，具有ATPase活性的功
能结构域；C端分子量为25kDa大小的多肽底物结合
域【12】。热休克蛋白70家族包括诱导型Hsp70和组成型
Hsp70，大部分诱导型Hsp70不含内含子，转录后不
需要经过剪接加工，在应激状态下可优先表达【ll】。本
研究克隆的Hsp70基因经氨基酸序列分析显示，该基
因含有Dnak的特征基序DLGTT．S．V和2个签名序
列：靠近C端有GGMP4肽序列，C末端是高度保守的
细胞质特异性EEDV调控基序，表明所克隆的锯缘青
蟹Hsp70基因是Dnak类型的细胞质Hsp70基因【¨21。
在环境胁迫因子刺激下，机体内最明显的生理变化之
是Hsp70表达量的上升，Hsp70能协助蛋白质折叠、
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图5锯缘青蟹Hsp70基因的核苷酸序列和推测的氨基酸序列
注：下直划线序列表示Dnak特征序列，虚下划线序列为签名
序列签名序列，四个真核细胞特征基序用方框标出。推测的多
聚腺苷酸加尾信号位点用下点线标出，终止子TAA用t号标出
F追．5cDNAsequenceofHsp70geneandpredictedamino
acidsequenceofHSP70ofS．serrata
Note：ThestraightunderlineindicatesDnakequence，the
underlinedwithdotsindicatetwosignaturesequences，four
functionsequencesof ilareboxed，theunderlineofpoints
indicatesPoIyadenyla60nsignalsite．Thestopcodonis
markedwithanasterisk．
，。叭8m绱吼伯龇韶瓢鼯鳓m埘啪坝mⅢ姗蛳增眦罢詈似猫l圣琊蛳詈孳鲥罩§吼蛳嵫铋m撕m啪啪黜m栅m镪啪懈m蝴啪伽娜辩撇罾；m啪小詈搴啪嚣}啪瞄垒}嗽m晰敬啪|!暑
万方数据
正确构象的维持和修复D0-11】。热休克蛋白也可由冷休
克诱导，冷休克是在低温但非结冰温度下迅速而短暂
的暴露过程。夏季光滑鳖甲(Anatolicapolitboreal妇)
的冰点大概为．8℃，经．5℃冷休克处理后，光滑鳖
甲Hsp70的表达水平明显高于．10℃和4℃处理组，表
明冷休克诱导-j"Hsp70的表达【131。作为重要的分子伴
侣，Hsp70与多种蛋白之间的相互作用不仅有助于维
持逆境下这些蛋白的折叠能力和保持其正确的折叠
状态，还能协助降解体内错误折叠或变性蛋白，从而
避免细胞受损伤[川。有研究提出，对于一直生存在稳
定、相对隔绝生境下的物种，其Hsp70的应激表达机
制依然存在。南极海域水温常年接近0℃，寒冷而稳
定，南极油鱼(antarcticno othenioidfish)在此海域已生
存超过百万年，当南极油鱼在实验室进行温水驯养
时，其机体的Hsp70表达量出现了明显上升，说明在
隔离、寒冷且缺乏温度波动的生境下，生物体的
Hsp70应激机制依然能够保留下来【15】。
机体受胁迫因子诱导而表达Hsp70，有研究发现
部分水生生物的应答策略，鲎(horseshoecrab)通过维
持应激蛋白如结构型Hsp70的高基准表达水平以适
应环境的热胁迫，而不是在温度到生存极限的时候再
合成诱导型Hsp70，特别对于鲎的幼虫，是其应对潮
汐变动所带来的温度波动的有效策略【161。Eckwert等
认为，生物体Hsp70的高表达量，能够持续到机体摄入
毒物剂量超过机体自身蛋白质合成能力或直至体内
毒物被去除为止【"。Hsp70对胁迫因子(高温、缺氧、
创伤、辐射、重金属)的耐受现象具有交叉性，即一
表4甲壳纲五个物种Hsp70核苷酸序列之间的相似性(％)
种胁迫因子诱导机体表达Hsp70后，机体对其他胁迫
因子的耐受性也同样增JJl：ltl7。8】。淡水海绵(Ephydatia
17uviatilis)受亚致死热刺激后，表现出对化学污染物有
很强的抵抗力[19】。通过化学物质或者其它的方法来诱
导贻贝产生热休克蛋白，同样能增强对其他破坏性因
子的抗性【181。生物体年龄和体内器官和Hsp70基因的
表达情况也有密切关系。用溶藻弧菌(Vibrio
alginDlyticus)感染剑尾鱼(XiphophD舢helleri)能诱导其
组织内的Hsp70表达，并且发现脾脏和头肾组织中
Hsp70蛋白出现的要早于肝胰脏【201。而银大马哈鱼
(cohosalmD以)在感染了肾病细菌后，其肝、肾组织
dpHsp70表达量随即增加，或说明机体内各器官之间
的Hsp70表达可能具有一定的联动关系【2¨。Hsp70在
机体对不良环境的抵御，维持机体内部的稳定起到重
要作用，因此作为一种重要的内源性细胞保护因子，
Hsp70具有重大研究价值。 ．
锯缘青蟹主要产地为浅海滩涂及河口区等咸淡
水交汇区，甲壳纲其他物种：中华绒螯蟹(Esinensis)、
罗氏沼虾(Mrosenbergii)为淡水生物，凡纳滨对虾伍．
vannamei)、斑节对虾(P．所Dnodo一)为海水生物。对比它
们的Hsp70基因序列发现，两种海水对虾和亲缘关
系较近的罗氏沼虾的Hsp70核苷酸序列之间存在明显
差异，但淡水物种中华绒螯蟹和罗氏沼虾之间的相似
性却较高一些，而锯缘青蟹和罗氏沼虾的相似性则介
乎于淡水物种和海水物种之间(见表4)。这可能表
明，物种间亲缘关系和生长环境对甲壳纲动物Hsp70
的核酸序列的分子进化机制都存在着影响[22-23】。锯缘
Table4ComparisonofnueleotidesequencesofHsp70inCrustacea(％)
万方数据
青蟹和中华绒螫蟹、凡纳滨对虾的Hsp70基因的氨基
酸序列的相似性分别为96．47％和92．94％，证明Hsp70
氨基酸序列的高度保守性。经对照，这种不同有一部
分存在于密码子的第3个碱基，因为密码子的简并
性，编码氨基酸没有发生改变，即沉默替代
(silentmutation)【251。在一般情况下，虽然碱基不同，但
沉默替代对编码蛋白质无影响，不会对蛋白质功能产
生影响。似乎HSP70存在某种机制，在保证获得最大
的碱基不同的基础上保持编码蛋白质氨基酸稳定f26】。
锯缘青蟹Hsp70基因成功克隆，为深入研究sp70
介导的生物抗逆能力，进一步探索Hsp70实现其重要
的分子伴侣功能打下基础。通过对Hsp70基因表达调
控规律的深入研究，探讨提高锯缘青蟹机体应激能力
的途径，进而筛选和培养抗逆、抗病优良品种，更好
地发展养殖生产。
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《生态科学》论文写作格式要求
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4．量和单位：按GB3100—93(《国际单位制及其应用》)、GB3101—93(《有关量、单位和符号的一般原则》)
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代替。③表中量和单位应按GB3101—93的规定标示，即量符号与单位间用斜线隔开。例如：时间及其单
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万方数据
锯缘青蟹(Scylla serrata) Hsp70基因cDNA的克隆及序列分
析
作者： 袁嘉恩， 许忠能， 韩博平， 孔义军， 雷腊梅， 谢数涛， YUAN Jia-en， XU Zhong-
neng， HAN Bo-ping， KONG Yi-jun， LEI La-mei， XIE Shu-tao
作者单位： 暨南大学水生生物研究所,广州,510632
刊名： 生态科学
英文刊名： ECOLOGICAL SCIENCE
年，卷(期)： 2008,27(1)

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