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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(7):126-130
微生物多糖安全无毒、理化性质优良，在食品、
医药、材料等许多工业领域具有广泛的应用价值，
比动物多糖、植物多糖具有更为广泛的应用前景［1］。
鞘氨醇胶是鞘氨醇单胞菌属菌株合成的一类微生物
多糖的统称，其多糖主链结构相似，侧链基团种类
多样［2］。韦兰胶是由 Sphingomonas sp. ATCC 31555
发酵产生的一种胞外多糖，是继黄原胶和结冷胶之
后最具市场前景的微生物胶之一。韦兰胶的主链由
D-葡萄糖、D-葡糖醛酸、D-葡萄糖和 L-鼠李糖的四
糖重复单元组成，侧链由单链的 L-甘露糖或单链的
L-鼠李糖构成［3］。韦兰胶溶液具有独特的剪切稀释
性能，以及增稠性、悬浮性和乳化性［4］，在石油开采、
水泥及混凝土制品等领域具有广泛的应用，并具备
在食品、医药等领域应用的潜力［5］。
目前韦兰胶的工业化生产仍存在一些问题，其
碳源转化率仅有 40%-50%、产量只有 15-20 g/L，
与黄原胶等微生物胶的发酵生产相比，韦兰胶的碳
源转化率和产量都较低，生产成本较高［6］，为解
决此问题，研究者在培养基和发酵调控方面进行了
大量研究，使韦兰胶的发酵产量得到不同程度的提
收稿日期 ：2015-11-19
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31571790）
作者简介 ：周明明，女，硕士研究生，研究方向 ：微生物多糖 ；E-mail ：zmmydx@126.com
通讯作者 ：黄海东，教授，研究方向 ：资源细菌及工程 ；E-mail ：hhaidong@126.com
韦兰胶合成菌的原生质体制备与再生研究
周明明1  李晓雁2  任梦楠1  程珂萌1  黄海东1
（1. 天津农学院农学与资源环境学院，天津 300384 ；2. 天津农学院食品科学与生物工程学院，天津 300384）
摘 要 ： 旨在研究 EDTA预处理、菌龄、酶解浓度、酶解温度及酶解时间对 Sphingomonas sp. ATCC 31555原生质体制备与
再生的影响。结果表明，菌龄 10 h，12 mmol/L EDTA预处理，溶菌酶浓度 45 μg/mL、酶解温度 28℃、酶解时间 25 min。得到原生
质体的形成率达 97.3%，再生率达 33.9%。研究结果为菌株进行原生质体融合、基因组改组等选育优良菌种提供参考。
关键词 ： 鞘氨醇单胞菌；韦兰胶；原生质体；再生
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.07.019
Conditions for Protoplast Preparation and Regeneration by
Sphingomonas sp. ATCC 31555
ZHOU Ming-ming1 LI Xiao-yan2 REN Meng-nan1 CHENG Ke-meng1 HUANG Hai-dong1
（1. College of Agronomy and Resources & Environment，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384 ；2. College of Food Science and
Biotechnology，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384）
Abstract: The effects of EDTA pretreatment，cell age and the concentration，temperature and work time of enzymolysis on protoplast
formation and regeneration by Sphingomonas sp. ATCC 31555 were studied. The results showed that the formation rate and regeneration rate
reached 97.3% and 33.9% respectively，when the cells cultivated 10 h，pretreated by 12 mmol/L EDTA，using 45 μg/mL of lysozyme，
enzymolysis at 28℃ for 25 min. The result of this paper provides a reference for breeding fine microbial strains by protoplast fusion and genome
shuffling.
Key words: Sphingomonas ；welan gum ；protoplast ；regeneration
2016,32(7) 127周明明等：韦兰胶合成菌的原生质体制备与再生研究
高［7，8］。但韦兰胶合成菌原生质体制备与再生条件
的研究还未见报道，本研究以韦兰胶合成菌 Sphingo-
monas sp. ATCC 31555 为出发菌株，对影响菌株原生
质体制备与再生的因素进行了研究，以期获得生产
成本低及产量提高的目的菌株，为利用原生质体融
合及基因组改组等选育更为优良的菌株提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌 株 韦 兰 胶 产 生 菌（Sphingomonas sp.）
ATCC 31555。
1.1.2 试剂 磷酸缓冲液 ：0.1 mol/L 磷酸氢二钠，
0.1 mol/L 磷酸二氢钠 pH7.0 ；高渗缓冲液 ：0.1 mol/L
磷酸氢二钠，0.1 mol/L 磷酸二氢钠，0.8 mol/L 甘露
醇 pH7.0 ；原生质体稳定液（SMM）：0.5 mol/L 蔗糖，
20 mol/L MgCl2，0.02 mol/L 顺丁烯二酸，pH6.5 ；溶
菌酶 ：用 SMM 溶液配制，终浓度 0.5 mg/mL，过滤
除菌，-20℃保存备用。酚藏花红染色剂（Sigma）。
1.1.3 培养基 固体培养基（g/L）：蔗糖 15.0，蛋白
胨 5.0， 牛 肉 膏 3.0， 酵 母 膏 3.0， 琼 脂 粉 15.0，
pH7.0。液体培养基（g/L）：蔗糖 15.0，蛋白胨 2.5，
磷酸氢二钾 2.5，磷酸氢二铵 1.5，硫酸镁 0.1，酵
母 粉 1.5，pH7.0。 补 充 基 本 培 养 基（BNK）（%）：
蔗 糖 18.1， 蛋 白 胨 0.5， 牛 肉 膏 0.3， 琼 脂 粉 2.0，
pH7.0。再生补充培养基（BZNK）（%）：BNK 配方
中琼脂改为 0.8。
1.2 方法
1.2.1 菌种活化 取 -70℃保藏的菌种 Sphingomonas
sp. ATCC 31555，在无菌操作条件下将其划线到固体
平板培养基上，30℃恒温培养 72 h，挑取单菌落在
试管斜面上蛇形划线，30℃恒温培养 72 h。
1.2.2 菌株发酵曲线的测定 在无菌操作条件下，
用 5 mL 无菌水将试管斜面上的菌体冲洗下来，按
10% 的接种量将其接种到含有 100 mL 液体培养基的
250 mL 三角瓶中，30℃，180 r/min 摇床培养 72 h，
定时取样，并测定发酵液的 pH、菌数、黏度和韦兰
胶的产物量。
1.2.3 原 生 质 体 的 制 备 菌 株 Sphingomonas sp.
ATCC 31555 液体培养至对数生长前期，取适量菌液
在 8 000 r/min 条件下离心 5 min，弃上清液，用磷
酸缓冲液洗涤菌体细胞。将菌体悬浮于适量的 SMM
缓冲液中，使溶液中细胞浓度约含 108-109 CFU/mL。
取菌液 0.1 mL，用无菌水倍比稀释，涂布平板培养
基，30℃培养 4 d 后得菌落数 A（菌落总数）。在剩
余的菌悬液中加入溶菌酶，混合均匀后于 37℃保温
一定时间，4 000 r/min 离心 10 min，弃上清液，用
高渗缓冲液洗涤除酶，取菌液 0.1 mL，用无菌水倍
比稀释，进行剩余菌数 B（未被酶裂解的剩余细胞）
的测定。
1.2.4 原生质体的再生 取 0.1 mL 酶解后的原生质
体悬液，用 SMM 缓冲液倍比稀释，取 1 mL 加入底
层 BNK 补充培养基的中央，再倒入上层 BZNK 培养
基，混匀，30℃培养 4-5 d 后计数，将菌落数计为 C
（再生菌落数）。原生质体形成率与再生率的计算公
式 ：原生质体形成率（%）=（A-B）/A×100%，原
生质体再生率（%）=（C-B）/（A-B）×100%。
1.2.5 菌体与原生质体的荧光显微镜观察 用 SMM
溶液作溶剂配制 0.01% 的酚藏花红染色剂［9］。将菌
悬液和制备好的原生质体溶液分别与酚藏花红染色
剂按 1∶1 的比例进行染色，然后取少量滴于载玻片
上，加盖玻片，在荧光显微镜下进行观察。
2 结果
2.1 菌株Sphingomonas sp. ATCC 31555的发酵曲线
对菌株 Sphingomonas sp. ATCC 31555 进行 72 h
的摇瓶发酵，其间进行 pH、黏度、菌数和韦兰胶产
物量的测定。细胞生长曲线（图 1）显示，菌株在
培养 5 h 后进入对数生长期，58 h 进入稳定期，此
时菌数达 9.5×109 CFU/mL ；韦兰胶产物量曲线与细
胞生长曲线近乎平行，在 58 h 时达到韦兰胶产量最
高 ；发酵液的 pH 在 6-7 之间小范围波动，因韦兰
胶属于酸性多糖，且使用高碳氮比培养基，发酵期
间 pH 总体呈降低趋势，发酵 67 h 时 pH 最低为 6.31；
发酵液的黏度在对数生长期的后期迅速增加，在 67
h 达到最大值。由于菌株合成产物后，细胞外包裹
高分子多糖不利于原生质体的制备，选择黏度较低
的 10 h 菌龄发酵液进行原生质体制备的研究。
2.2 原生质体的制备与再生
2.2.1 EDTA 预 处 理 对 原 生 质 体 制 备 与 再 生 的 影
响 本研究对不同浓度梯度的 EDTA 对菌体进行预
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.7128
处理，结果（图 2）显示，原生质体的形成率随着
EDTA 浓度的增大而增大，再生率则在 12 mmol/L 之
前呈上升趋势，之后呈下降趋势。随着 EDTA 浓度
的增大，菌体细胞壁的破坏程度越来越大，酶的作
用增强，形成率和再生率上升，再生率在 EDTA 浓
度为 12 mmol/L 之后下降。以原生质体形成率与再
生率乘积作为判别标准［10］，选择 EDTA 浓度为 12
mmol/L 作为原生质体制备与再生的最佳浓度。
生质体的形成率呈下降趋势，青霉素对再生率的影
响比较明显，在青霉素浓度为 10 μg/mL 之后，原生
质体再生率急剧下降，原因是随着青霉素浓度的增
大，抑制了菌体的正常生长，细胞数量下降，再加
上酶对原生质体的伤害，使得原生质体的形成率和
和再生率都降低。综合考虑原生质体的形成率与再
生率，选择不加青霉素作为菌株原生质体制备与再
生的最佳条件。
0
2
4
6
8
10
12
14
0 5 10 19 24 29 34 43 48 53 58 67 72ᰦ䰤/h㧼ᮠ/109 CFU/mL ӗ⢙䟿/g·L-1  pH 051015202530354045 哿ᓖ1000 CPpHӗ⢙䟿㧼ᮠ哿ᓖ
图 1 菌株 Sphingomonas sp. ATCC 31555 的发酵曲线
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100
4 6 8 10 12 14 16
EDTA⎃ᓖmmol·L-1ᖒᡀ⦷/% 051015202530 ޽⭏⦷/%ᖒᡀ⦷޽⭏⦷
图 2 EDTA 浓度对原生质体形成率与再生率的影响
30
40
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0 10 20 40 60 80 100䶂䴹㍐⎃ᓖ/μg·mL-1ᖒᡀ⦷/% 051015202530 ޽⭏⦷/%ᖒᡀ⦷޽⭏⦷
图 3 青霉素浓度对原生质体形成率与再生率的影响
2.2.3 溶 菌 酶 浓 度 对 原 生 质 体 制 备 与 再 生 的 影
响 对 5-245 μg/mL 之间浓度梯度的溶菌酶进行实
验，结果（图 4）显示，随着酶浓度的增加，原生
质体形成率逐渐增大，再生率在酶浓度为 45 μg/mL
时值最大，为 31.1%，之后迅速下降。依据原生质
体形成率与再生率乘积最大原则［10］，选择酶浓度为
45 μg/mL 作为原生质体制备与再生的最佳条件。
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5 45 85 125 165 205 245ⓦ㧼䞦⎃ᓖ/μg·mL-1ᖒᡀ⦷/% 05101520253035 ޽⭏⦷/%ᖒᡀ⦷޽⭏⦷
图 4 酶浓度对原生质体形成率与再生率的影响
2.2.2 青霉素预处理对原生质体制备与再生的影
响 本实验在菌体培养 10 h 时，加入 0-100 μg/mL
浓度梯度的青霉素继续培养 2 h 后，加入 EDTA 预
处理和溶菌酶进行作用，观察青霉素预处理对原生
质体制备与再生的影响，结果如图 3 所示。菌株原
2016,32(7) 129周明明等：韦兰胶合成菌的原生质体制备与再生研究
2.2.4 酶解温度对原生质体制备与再生的影响 本
研究在不同的酶解温度下进行了原生质体制备与再
生实验［11］，结果如图 5 所示。随着温度的升高，原
生质体的形成率一直上升，原因是随着温度的升高，
酶的活性增强。再生率则相反，呈下降趋势，一方
面是因为酶在作用过程中，不仅酶解了细胞壁，还
对早期形成的原生质体膜造成了损伤，另一方面是
因为菌体的最适培养温度为 30℃，温度升高使原生
质体的活性降低，导致其破坏甚至死亡，因而再生
率较低［12］。综合考虑，选择酶解温度为 28℃作为
原生质体制备与再生的最佳条件。
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100
18 23 28 33 38 43 48⑙ᓖ/ćᖒᡀ⦷/% 051015202530 ޽⭏⦷/%ᖒᡀ⦷޽⭏⦷
图 5 酶解温度对原生质体形成率与再生率的影响
2.2.5 酶解时间对原生质体制备与再生的影响 对
不同的酶解时间进行研究，结果（图 6）显示，酶
解时间在 25 min 之前，原生质体的形成率上升较快，
之后增长缓慢，再生率则一直处于下降趋势。原因
是随着酶解时间的延长，在 25 min 时原生质体基本
释放完全，再延长酶解时间，原生质体形成率也不
会大幅度增加。由于酶解时间过长，细胞脱壁太彻
底，使细胞失去再生的引物，且杂酶的损害程度也
增强［13］，因而再生率下降。综合考虑，选择酶解时
间为 25 min 作为原生质体制备与再生的最佳条件。
2.3 原生质体制备条件的验证
在最佳条件下，菌体培养至对数生长前期 10 h，
12 mmol/L EDTA 预处理，溶菌酶浓度 45 μg/mL，酶
解温度 28℃，酶解时间 25 min 的条件下进行实验。
结果表明，原生质体形成率达 97.3%，再生率达
33.9%。 菌 株 Sphingomonas sp. ATCC 31555 及 其 原
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10 15 20 25 30 35 40ᰦ䰤/minᖒᡀ⦷/% 0510152025303540 ޽⭏⦷/%ᖒᡀ⦷޽⭏⦷
图 6 酶解时间对原生质体形成率与再生率的影响
生质体经酚藏花红染色后，在荧光显微镜下的细胞
形态。由图 7 可以看出菌株 Sphingomonas sp. ATCC
31555 的 细 胞 为 杆 状， 两 端 略 窄， 大 小 为（0.5-
0.7）μm×（1.0-1.7）μm。其原生质体大多数菌体呈
类球状，直径 0.6-0.9 μm，实现了原生质的制备。
A B
图 7 韦兰胶合成菌的细胞（Ａ）及其原生质体（Ｂ）形态
（1 000×）
3 讨论
本研究用酶法去除菌株细胞壁制备原生质体，
在原生质体的形成与再生过程中，要获得较高的原
生质体形成率与再生率，应综合考虑各个影响因
素［14］。微生物的生理状态对原生质体的形成非常重
要，对数生长期的细胞生长比较旺盛，活力较强，
酶解易于释放原生质体［15］，但随着培养时间的延
长，胞外多糖产物会阻挡酶对实验菌株的作用，因
此选择对数生长期初期作为原生质体制备的最佳菌
龄。原生质体制备时，溶菌酶作用于细胞壁肽聚糖
主链的 β-1，4-糖苷键上，从而破坏细菌的细胞壁结
构［16］，但革兰氏阴性菌的原生质体制备更为复杂，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.7130
阴性菌细胞壁的肽聚糖结构外还有脂多糖层，会阻
挡溶菌酶的作用，EDTA 可以螯合 Ca2+ 和 Mg2+，使
脂多糖解体，进而暴露内层的肽聚糖分子被溶菌酶
所水解［17］，结果显示 EDTA 有利于对实验菌株的酶
解。青霉素可以与转肽酶的活性中心结合，抑制肽
桥的形成，从而抑制细菌细胞壁中肽聚糖的交联，
使细胞壁结构疏松，有利于溶菌酶的作用［18］，但本
实验的结果显示青霉素影响菌株生长，降低了原生
质体形成率，因此不选择使用青霉素进行预处理。
不同的微生物菌种细胞壁组分有差异，因而对酶的
敏感性不同，不同厂家溶菌酶的活性差异以及实验
菌株的生长温度范围，都会影响酶促反应的条件，
如酶浓度、酶解温度及时间等，进而影响原生质体
的形成率与再生率，因此，有必要对酶促反应条件
进行研究。原生质体制备时，随着溶菌酶浓度的增
加，酶与菌体的作用更加充分，所以原生质体形成
率上升，但过高的酶浓度，使溶菌酶中混有的杂酶
（核糖核酸酶、过氧化物酶等）作用呈现，造成原生
质体的活力降低［19］。酶解时间过短，原生质体释放
不充分 ；酶解时间过长，会使形成的原生质体皱缩，
且损害细胞质膜或造成原生质体破裂，导致再生率
下降［20］。
4 结论
本研究通过对影响韦兰胶合成菌 Sphingomonas
sp. ATCC 31555 原生质体制备与再生的最佳条件 ：
菌 龄 10 h，12 mmol/L EDTA 预 处 理， 溶 菌 酶 浓 度
45 μg/mL、酶解温度 28℃、酶解时间 25 min，在此
条件下菌株原生质体的形成率和再生率分别达到
97.3% 和 33.9%。
参 考 文 献
［1］张伟 , 沈年汉 , 陈秀芳 . 几种微生物多糖的特性及在食品工业
中的应用［J］. 食品工业科技 , 2010, 31（6）：358-360.
［2］黄海东 , 刘云 , 刘如林 . 合成生物聚合物的重要微生物资源 -
鞘氨醇单胞菌［J］. 微生物学报 , 2009, 49（5）：560-566.
［3］Jansson PE, Widmalm G. Welan gum（S-130）contains repeating
units with randomly distributed L-mannosyl and L-rhamnosyl
terminal groups, as determined by FABMS［J］. Carbohydrate
Research, 1994, 256（2）：327-330.
［4］郭建军 , 李建科 , 陈芳 , 等 . 韦兰胶的特性、生产和应用研究进
展［J］. 中国食品添加剂 , 2008（2）：87-91.
［5］吉武科 , 赵双枝 , 等 . 新型微生物胞外多糖 - 韦兰胶的研究进
展［J］. 中国食品添加剂 , 2011（1）：210-215.
［6］姬彬 . 威兰胶发酵及其流变性研究［D］. 无锡 ：江南大学 ,
2012.
［7］吴萌萌 , 罗影 , 等 . 鞘氨醇单胞菌 TP-5 发酵生产韦兰胶的条件
优化研究［J］. 南开大学学报 ：自然科学版 , 2014（1）：72-
79.
［8］ 赵燕 , 陈芳 , 李建科 , 等 . 微生物多糖韦兰胶生产工艺优化［J］.
食品科学 , 2010（23）：219-223.
［9］龙建友 , 唐世荣 , 吴文君 . 原生质体融合技术对秦岭霉素产量
提高的影响［J］. 中国农业科学 , 2007, 40（7）：1416-1421.
［10］岑沛霖 . 工业微生物学［M］. 北京 ：化学工业出版社 , 2001 ：
335-344.
［11］姚曼 , 张予心 , 宋秋梅 , 等 . 产琥珀酸放线杆菌原生质体制备
与再生研究［J］. 食品科技 , 2014, 39（6）：30-34.
［12］祁咏春 , 徐军庆 , 高艳华 , 等 . 黄色短杆菌原生质体制备与再
生条件的研究［J］. 食品与药品 , 2013, 15（1）：18-22.
［13］余健秀 , 李建华 , 庞义 . 芽孢杆菌原生质体融合技术［J］. 生
物技术 , 2000, 10（3）：45-47.
［14］甘邱锋 , 张晓琳 , 王洁颖 , 等 . 刺糖多孢菌原生质体制备与再
生条件优化［J］. 中国抗生素杂志 , 2011, 36（1）：18-24.
［15］郑重谊 , 谭周进 , 肖克宇 , 等 . 不同因素对两株细菌原生质体
制备的影响［J］. 生物技术通报 , 2007（5）：131-135.
［16］李淼 , 曾柏全 , 等 . 高产纤维素酶菌株原生质体制备及再生条
件［J］. 中南林业科技大学学报 , 2013, 33（12）：174-180.
［17］沈萍 , 陈向东 . 微生物学［M］. 北京 ：高等教育出版社 ,
2006 ：40-43.
［18］朱宏莉 , 宋纪蓉 , 张嘉 , 等 . 果胶酶产生菌 ZH-g 的原生质体
形成与再生研究［J］. 食品科学 , 2006, 27（8）：68-71.
［19］黄磊 . 原生质体制备和再生的影响因素［J］. 科技致富向导 ,
2013（32）：172-172.
［20］呼吉雅 , 卢萍 , 等 . 小花棘豆 Embellisia 内生真菌原生质体的
制备与再生研究［J］. 生物技术通报 , 2015, 31（5）：134-
139.
（责任编辑 李楠）