全 文 ：第 45 卷第 5 期
2016 年 5 月
应 用 化 工
Applied Chemical Industry
Vol． 45 No． 5
May 2016
收稿日期:2015-12-10 修改稿日期:2015-12-25
基金项目:广西自然科学基金资助项目(桂科基 2015GXNSFAA139102) ;广西高等学校农作物废弃物功能成分研究协同
创新中心资助项目(CICAＲ 2014-B2 )
作者简介:张笮晦(1979 －) ，女，广西桂林人，助教，博士，主要从事天然产物的生物化工方面的研究。电话:15978195508，
E － mail:zhangzuohui1979@ 126． com
肉桂叶生物转化制备肉桂醇
张笮晦，邓家刚，唐彩云，许霄玲
(广西中医药大学 药学院，广西 南宁 530200)
摘 要:从土壤中筛选到的微生物菌株 MX18 具有降解肉桂叶的能力，其转化产物通过气相色谱-质谱联用仪鉴定
为肉桂醇。该菌株被鉴定为鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp．) ，命名为 Sphingomonas sp． MX18，并用于生物转化肉
桂叶合成天然肉桂醇的反应，考察发酵培养基碳源、氮源、反应体系初始 pH值、温度、底物加入量、转化时间对转化
反应的影响。结果表明，反应优化工艺条件为:糊精为碳源，质量浓度 30 g /L，蛋白胨为氮源，质量浓度 20 g /L，初
始 pH值 5，肉桂叶粉的加入量 10 g /L，30 ℃下反应 72 h。在此条件下，肉桂醇的得率达 0． 77%。
关键词:肉桂叶;肉桂醇;生物转化;鞘氨醇单胞菌
中图分类号:TQ 033 文献标识码:A 文章编号:1671 － 3206(2016)05 － 0882 － 04
Preparation of cinnamyl alcohol from cinnamon
leaves by biotrasformation
ZHANG Zuo-hui，DENG Jia-gang，TANG Cai-yun，XU Xiao-ling
(College of Pharmacy，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning 530200，China)
Abstract:A strain MX18 was isolated from soil which could transform cinnamon leaves and the transfor-
mation product was identified as cinnamyl alcohol by GC-MS． The strain was proved as Sphingomonas sp．
by bacteria identification and was named Sphingomonas sp． MX18． The biotrasformation of cinnamon leav-
es to natural cinnamyl alcohol with Sphingomonas sp． MX18 was studied． The effects of the fermentation
medium carbon，nitrogen，pH，temperature，amount of substrate，conversion time on conversion reaction
were investigated，and the result showed that the optimum trasformation conditions were found as 30 g /L
dextrin，20 g /L peptone，10 g /L cinnamon leaves，pH at 5． 0，30 ℃，reacting for 72 h． The yield of cin-
namyl alcohol was 0． 77% ．
Key words:cinnamon leaves;cinnamyl alcohol;biotrasformation;Sphingomonas sp．
肉桂醇是肉桂油的单离产品之一，是我国允许
使用的食用香料(GBI1043) ，也是香料、药物等精细
化学品合成的重要中间体，常用于香料乙酸肉桂酯、
肉桂酸肉桂酯及医药西尼地平、萘替芬、脑益嗪等的
合成［1］。天然肉桂醇含量低，在国际市场上供不应
求［2］。Yuan等［3］对 27 批肉桂中肉桂醇含量的测定
结果 表 明，肉 桂 醇 在 肉 桂 中 的 含 量 为 0 ～
0． 09 mg /g。市售肉桂醇大多由化学合成法生产，可
由肉桂醛选择性氢化而得［4-6］，该反应对肉桂醇的
选择性不高，产物成分复杂，多为肉桂醇、3-苯丙醛
和 3-苯丙醇的混合物。此外，化学合成的香料应用
于食品和化妆品时，其安全性一直备受争议。
微生物转化反应具有条件温和、高选择性和产
品天然绿色等特点，利用微生物转化法生产的肉桂
醇可作为“天然品”使用，其商业附加值大大高于化
学合成品。马丽等［7］以 Mucor sp． JX23 催化肉桂醛
选择加氢制备肉桂醇，肉桂醛的转化率为 82． 9%，
肉桂醇的选择性为 90． 4%。笔者曾以 Citrobacter
freundii CG008［8］催化肉桂醛选择加氢制备肉桂醇，
肉桂醛的转化率为 100%，肉桂醇的选择性为
90． 1%，转化液中肉桂醇的质量浓度可达 2． 88 g /L。
在直接以肉桂为原料进行生物转化方面，国内外的
相关报道极少，笔者在前期工作中筛选到的链霉菌
Streptomyces sp ． CG19［9］能转化肉桂皮提油残渣生
成肉桂酰胺，肉桂酰胺的得率可达 0． 32%。
为了进一步研究肉桂的生物转化反应，开发肉
桂系列的新产品。笔者从土壤中筛选具有转化肉桂
叶能力的微生物菌株，并从培养条件和转化条件等
DOI:10.16581/j.cnki.issn1671-3206.20160202.030
第 5 期 张笮晦等:肉桂叶生物转化制备肉桂醇
方面对肉桂叶生物转化的特性进行研究，以期为肉
桂的深加工制备天然香料提供基础和思路。
1 实验部分
1． 1 材料与仪器
肉桂叶;蛋白胨、酵母膏、琼脂为生化试剂;肉桂
醇、葡萄糖、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠、七水
合硫酸镁、七水合硫酸亚铁、乙酸乙酯、无水乙醇等
均为分析纯;土样，采自广西东兴市马路镇屏丰林场
肉桂种植区土壤。
UV-2550 型紫外分光光度计;QP2010 型气相色
谱-质谱联用仪;GC-2010 Plus 型气相色谱仪;ZH-
WY-211B型恒温培养振荡器;SPX-250 型生化培养
箱;SW-CJ-1F 型超净工作台;YX-280B 型高压灭菌
锅;FZ-160 型家用万能粉粹机。
1． 2 培养基
1． 2． 1 富集培养基(g /L) 葡萄糖 10，蛋白胨 10，
磷酸氢二钾 1，氯化钠 0． 5，七水合硫酸镁 0． 5，七水
合硫酸亚铁 0． 01，酵母膏 2． 5，肉桂叶粉 10。
1． 2． 2 平板培养基(g /L) 葡萄糖 20，蛋白胨 10，
磷酸氢二钾 1，氯化钠 0． 5，七水合硫酸镁 0． 5，七水
合硫酸亚铁 0． 01，酵母膏 2． 5，琼脂 20。
1． 2． 3 斜面培养基(g /L) 葡萄糖 20，蛋白胨 10，
磷酸氢二钾 1，磷酸二氢钾 3，氯化钠 0． 5，七水合硫
酸镁 0． 5，七水合硫酸亚铁 0． 01，酵母膏 2． 5，琼
脂 25。
1． 2． 4 发酵培养基(g /L) 葡萄糖 20，蛋白胨 10，
磷酸氢二钾 1，氯化钠 0． 5，七水合硫酸镁 0． 5，七水
合硫酸亚铁 0． 01，酵母膏 2． 5。
所有培养基均在 121 ℃灭菌 25 min。
1． 3 实验方法
分别称取 5． 0 g土样于已灭菌装有 50 mL富集
培养基的 250 mL 三角瓶中，在生化培养箱中于
30 ℃培养 72 h。将所得菌液稀释涂布后于 30 ℃培
养 72 h，得到混合菌落。混合菌落经过平板划线得
到单菌落，并移植于斜面上，放入冰箱 4 ℃保藏备
用。将一环斜面培养基上的菌种接种于已灭菌装有
100 mL发酵培养基的 500 mL 三角瓶中，于 30 ℃恒
温培养振荡器中 180 r /min 培养 72 h，得到各菌株
的发酵液。向发酵液中加入 1． 0 g 肉桂叶粉作为底
物，在 30 ℃、180 r /min 转化 92 h，得到各菌株的转
化液。
转化液用等体积乙酸乙酯萃取，浓缩到适当体
积后采用硅胶薄层层析，进行初步分离。展开剂为
V(氯仿)∶ V(甲醇)= 12∶ 1。将吸附有产物的硅胶刮
出，无水乙醇溶解，4 000 r /min 离心 20 min，倒出上
层清液并抽滤。滤液旋蒸至干，得白色晶体即为转
化产物的粗品。
1． 4 分析方法
1． 4． 1 转化液的 UV 分析 分别取各菌株的转化
液 0． 5 mL到 10 mL离心管中，加入 9． 5 mL 无水乙
醇，于4 000 r /min离心 15 min，取上层清液，进行 UV
分析。其中，参比液为无水乙醇，扫描波长为 200 ～
400 nm。
1． 4． 2 转化产物的 GC-MS分析 将转化产物的粗
品溶于适量无水乙醇，然后进行 GC-MS分析。
1． 4． 2． 1 色谱条件 色谱柱为 Ｒxi-5Sil(30 m ×
0． 25 mm id × 0． 25 μm) ，载气为高纯度氦气，流速
1． 0 mL /min;柱前压 47． 0 kPa，分流比 60∶ 1;进样口
温度 250 ℃，接口温度 250 ℃;程序升温过程:柱初
温100 ℃，保留1 min，以 5 ℃ /min升至 200 ℃，保留
1 min，再以 8 ℃ /min升至 250 ℃，进样量 0． 4 μL。
1． 4． 2． 2 质谱条件 电子轰击(EI)离子源，电离
能量 70 eV，电子倍增器电压 1． 5 kV，溶剂延迟
3 min，质量扫描范围 33 ～ 550 u，全扫描方式。
1． 4． 3 定量分析 取 100 mL 转化液，用等体积乙
酸乙酯萃取，浓缩后用乙酸乙酯定容于 10 mL 容量
瓶中。采用 GC 进行定量分析。进样口 250 ℃，程
序升温过程:柱初温 100 ℃，保留 1 min，以 5 ℃ /min
升至 200 ℃，保留 1 min，再以 8 ℃ /min升至250 ℃;
载气为 N2，流速 1． 0 mL /min，分流比 30∶ 1，进样量
0． 4 μL。
2 结果与讨论
2． 1 微生物的筛选
经稀释涂布、平板划线分离得到 89 株菌株。分
别对它们的转化液进行 UV 测定，发现菌株 MX18
转化液在 250 nm处有 1 个新吸收峰，表明该菌株具
有转化肉桂叶的能力。
2． 2 菌株MX18 的鉴定
经南宁国拓生物技术有限公司分析，得到菌株
MX18 的 16S rDNA序列。将测定的序列在 NCBI上
BLAST比对后发现，菌株 MX18 与鞘氨醇单胞菌属
的 Sphingomonas melonis 的 16S rDNA 部分序列有
99%的相似性。因此，将该菌鉴定为鞘氨醇单胞菌
(Sphingomonas sp．) ，并 命 名 为 Sphingomonas
sp． MX18。
2． 3 转化产物的分析鉴定
Sphingomonas sp． MX18 对肉桂叶的转化液经分
离纯化后得到转化产物，用 GC-MS对其进行定性分
析，结果见图 1。与 NIST08 质谱检测谱库对照的结
果表明产物是肉桂醇，其质谱与肉桂醇的匹配度为
92%。转化产物的气相色谱保留时间(图 2)与肉桂
醇标准品的一致(见图 3)。
388
应用化工 第 45 卷
图 1 转化产物的 GC-MS质谱图
Fig． 1 MS chromatography of sample
图 2 产物的 GC图
Fig． 2 GC chromatography of sample
图 3 肉桂醇标样的 GC图
Fig． 3 GC chromatography of cinnamyl alcohol standard sample
2． 4 转化反应的工艺条件优化
2． 4． 1 培养基碳源的影响 碳源对微生物的生长
至关重要。考察了不同碳源(葡萄糖、蔗糖、麦芽
糖、淀粉、糊精)对 MX18 转化肉桂叶的影响，结果见
图 4。
图 4 碳源对反应的影响
Fig． 4 Effect of carbon source on the reaction
由图 4 可知，当糊精作为碳源时，肉桂醇的得率
最高。本实验选择糊精为碳源。
2． 4． 2 培养基氮源的影响 氮源对微生物的生长
和产酶均有较大影响。不同氮源(玉米粉、酵母膏、
蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵)对反应的影响见图 5。
图 5 氮源对反应的影响
Fig． 5 Effect of nitrogen source on the reaction
由图 5 可知，不同的氮源对反应影响较大，有机
氮源更有利于 MX18 的生长，且蛋白胨作为氮源时
肉桂醇的得率最高。本实验选择蛋白胨为氮源。
2． 4． 3 反应体系初始 pH 值的影响 反应体系的
pH 能影响微生物的催化能力。pH值对 MX18 转化
能力的影响见图 6。
图 6 pH对反应的影响
Fig． 6 Effect of pH on the reaction
由图 6 可知，MX18 的转化能力受 pH值影响较
大，且适宜的 pH范围较窄。在 pH = 5 时转化能力
最强。
2． 4． 4 转化温度的影响 微生物的生长及所产酶
的活性均受反应体系温度的影响。
图 7 温度对反应的影响
Fig． 7 Effect of temperature on the reaction
488
第 5 期 张笮晦等:肉桂叶生物转化制备肉桂醇
由图 7 可知，在较低温度时，肉桂醇的得率随着
温度的升高而升高，在 30 ℃时达到最高;温度高于
30 ℃后，得率急剧降低，这是由于温度过高，导致酶
失活。
2． 4． 5 底物加入量的影响 底物加入量能影响菌
体细胞的活性及反应的速度。考察了肉桂叶的加入
量(5 ～ 25 g /L)对反应的影响，结果见图 8。
图 8 底物加入量对反应的影响
Fig． 8 Effect of substrate quality on the reaction
由图 8 可知，肉桂醇得率随着肉桂叶加入量的
增加而逐渐降低。综合考虑，选择肉桂叶的加入量
为 10 g /L。
2． 4． 6 转化时间的影响 考察了转化时间对反应
的影响，结果见图 9。
图 9 转化时间的影响
Fig． 9 Effect of time on the reaction
由图 9 可知，反应 72 h 内，肉桂醇得率不断提
高，并在 72 h 时达到最高，之后再延长转化时间，肉
桂醇得率反而有所下降。
2． 5 重复性实验
以优化工艺条件即糊精为碳源，质量浓度为
30 g /L，蛋白胨为氮源，质量浓度为 20 g /L，反应体
系的 pH 值为 5，肉桂叶用量为 10 g /L，30 ℃转化
72 h，进行 5 次验证实验，结果见表 1。
由表 1 可知，本生物转化反应具有较好的稳定
性，肉桂醇得率达 0． 77%。
表 1 重复性实验中肉桂醇的得率
Table 1 The yield of cinnamyl alcohol
in the repeatability test
实验号 肉桂醇得率 /% 平均值 /% ＲSD /%
1 0． 79
2 0． 77
3 0． 74 0． 77 2． 4
4 0． 78
5 0． 77
2． 6 MX18 转化能力的考察
为了拓展 MX18 的应用，考察了其对肉桂醛和
肉桂醇的转化反应。结果表明，在肉桂醛和肉桂醇
的加入量均为 2． 0 g /L时，MX18 对肉桂醛及肉桂醇
均不具备明显的转化能力。实验结果区别于之前报
道的 Mucor sp． CG10［10］，后者能将肉桂醛、肉桂醇分
别还原成肉桂醇和 3-苯丙醇。
3 结论
开展了肉桂叶的生物转化研究，筛选到的菌株
MX18能将肉桂叶转化生成肉桂醇，该菌株经过 16S
rDNA PCＲ 扩增和序列测定为鞘氨醇单胞菌(Sphin-
gomonas sp．) ，并命名为 Sphingomonas sp． MX18。通
过单因素实验考察各反应条件对转化反应的影响，得
到反应优化工艺条件:糊精为碳源，质量浓度为
30 g /L，蛋白胨为氮源，质量浓度为 20 g /L，反应体系
的 pH值为 5，肉桂叶用量为 10 g /L，30 ℃转化72 h。
在此条件下，肉桂醇的得率稳定且达到 0． 77%。
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588
第 5 期 张楠等:柚皮素分子印迹膜的制备及评价
图 6 1． 4 /0． 6(mPVA ∶ mCS)膜
对 NG和 QC的分离选择性
Fig． 6 The separation selectivity of 1． 4 /0． 6
(mPVA ∶ mCS)film to NG and QC
图 7 0． 6 /1． 4(mPVA ∶ mCS)膜对 NG
及 QC的分离选择性
Fig． 7 The separation selectivity of 0． 6 /1． 4
(mPVA ∶ mCS)film to NG and QC
3 结论
在选定的膜配比 PVA /CS = 0． 6 /1． 4 及 PVA /
CS = 1． 4 /0． 6 下，以柚皮素为印迹分子，乙醇为洗脱
剂，水相共混包埋，制备了以 NG为模板分子的壳聚
糖分子印迹膜。功能聚合物壳聚糖、聚乙烯醇及模
板分子 NG间形成了分子间氢键。当 mNG ∶ mCS = 1 /
15，且在一定致孔剂存在下制备出的 NCP印迹膜印
迹容量较高。在相同的时间内，NCP 印迹膜的透过
量大于空白膜，且印迹容量越大，对 NG的透过量越
大。同一印迹容量下，1． 4 /0． 6 膜对 NG的透过量大
于 0． 6 /1． 4 的透过量。选择透过实验证明，该印迹
膜对相似物 QC存在时在水相中表现出较好的选择
透过性能，在相同的印迹容量下，1． 4 /0． 6 膜对 NG
的分离选择因子达 8． 40;0． 6 /1． 4 膜对 NG 的分离
选择因子高达到 10． 09。综上，mNG ∶ mCS = 1 /15 时，
印迹容量最高。当基膜中 PVA 含量为 30%时印迹
膜的渗透选择性较高，而 PVA 含量为 70%时，膜的
渗透选择性相对较低。
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