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Improving the Percentage of Exerted Stigma in CMS Lines of Japonica Hybrid Rice by Molecular Marker-assisted Selection

利用分子标记技术改良粳稻不育系的柱头外露率



全 文 :·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(3):52-57
在 20 世纪 80 年代我国杂交粳稻出现了迅速发
展,但其种植面积所占粳稻总面积的比例仅 3% 左右,
远小于杂交籼稻所占的 70%[1]。近年来,虽然出于
国家粮食安全的需要,国家及科研单位加大力度研
究和推广,但杂交粳稻的发展速度仍然缓慢,究其
原因杂交粳稻的低制种产量严重影响了其产业化的
发展[2]。
粳稻不育系的异交结实率低是制约杂交粳稻制
种产量的主要因素。田大成等[3]研究认为,柱头外
露颖花与非外露颖花异交能力存在巨大差异,前者
结实率比后者一般高 3-4 倍,依靠柱头外露颖花开
花当天及以后接受花粉受精结实是异交结实的重要
收稿日期 :2015-10-06
基金项目 :浙江省重大项目(2010C1202),嘉兴市重点项目(2012AZ1004),嘉兴市中科专项(SQ2012010412)
作者简介 :蔡之军,男,硕士,农艺师,研究方向 :杂交粳稻育种 ;E-mail :czj982002@126.com
通讯作者 :李金军,男,研究员,研究方向 :常规、杂交粳稻新品种选育 ;E-mail :lijinjunjx@163.com
利用分子标记技术改良粳稻不育系的柱头外露率
蔡之军1  李金军1  周德银2  富昊伟1
(1. 浙江省嘉兴市农业科学研究院(所),嘉兴 314016 ;2. 江苏省兴化市农业委员会,兴化 225700)
摘 要 : 提高粳稻不育系的柱头外露率是提高杂交粳稻制种产量最有效途径。通过杂交、回交等常规手段将籼稻中控制柱
头外露率的 QTLs(qPES3、qPES9 及 qPES12)导入粳稻,通过系谱选育和分子检测技术试图选育高柱头外露率粳稻不育系,旨在
探索利用分子标记技术改良粳稻不育系柱头外露率的可行性。研究结果表明,试验中获得的 2 个粳稻不育系为携带 qPES3+qPES12
的双聚体,其柱头外露率及异交结实率表型值显示 :调控籼稻高柱头外露率 QTLs 能够在粳稻背景中表达,但存在基因型差异 ;分
子标记辅助选择技术是改良粳稻不育系柱头外露率的有效手段。
关键词 : 粳稻不育系 ;柱头外露 ;分子标记
DOI :10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.03.009
Improving the Percentage of Exerted Stigma in CMS Lines of Japonica
Hybrid Rice by Molecular Marker-assisted Selection
CAI Zhi-jun1 LI Jin-jun1 ZHOU De-yin2 FU Hao-wei1
(1. Jiaxing Academy of Agricultural Science Research of Zhejiang Province,Jiaxing 314016 ;2. Agricultural Commission of Xinghua City in
Jiangsu Province,Xinghua 225700)
Abstract: It is the most effective way to improve the yield of seed production of Japonica hybrid rice by enhancing the percentage of
exerted stigma in its CMS lines. In this research,QTLs(qPES3,qPES9,qPES12),regulating the percentage of exerted stigma in indica
rice,were transmitted into CMS lines of Japonica hybrid rice through crossing and backcrossing,aiming at selecting the CMS lines of Japonica
hybrid rice with high percentage of exerted stigma by pedigree breeding and molecular detection technique,i.e.,exploring the feasibility of
improving the percentage of exerted stigma in CMS lines of Japonica hybrid rice by molecular marker technique. The research results showed
that Jialong17A and Jialong43A,two CMS lines developed in this study,carried both qPES3and qPES12. The phenotypic values of percentage
of exerted stigma and outcrossing rate indicated that QTLs expressed in Japonica rice,but displaying difference in various genetic background.
Conclusively,molecular marker-assisted selection(MAS)is an efficient method to improve the percentage of exerted stigma in CMS lines of
Japonica hybrid rice.
Key words: CMS lines of Japonica hybrid rice ;percentage of exerted stigma ;molecular marker-assisted selection
2016,32(3) 53蔡之军等:利用分子标记技术改良粳稻不育系的柱头外露率
途径,开花当天异交结实一般不到总粒数的 50%,
而开花第 2 天后一般可占 50%。李庆荣[4]认为柱头
外露颖花的结实率占制种异交结实的 70%-80%,是
构成制种产量的主体。杨保汉等[5]研究认为,在自
然条件下,不育系柱头外露率每提高 1%,结实率可
提高 0.74%-0.92%,每公顷可增产 47-68 kg。林建
荣等[6]研究表明保持系柱头外露与不育系柱头外露
存在着极著的遗传关系。由浙江省嘉兴市农业科学
研究院选育的晚粳稻嘉 58,其对应的 BT 型不育系
嘉 58A,不育性稳定、不育度高,综合农艺性状优
良,具有良好的配合力,但柱头外露低(约为 1.0%),
利用嘉 58A 配制的杂交粳稻(组合)皆因制种产量
低而影响在生产上的应用。本研究试图将控制水稻
柱头外露率的 QTL 导入嘉 58A,探索利用分子标记
辅助选择进行人工创制高柱头外露率粳稻不育系的
技术可行性。
1 材料与方法
1.1 材料
以天津市农科院提供的高柱头外露率育种材料
T60B(来自 50S,籼型,柱头总外露率 73%)为父本,
浙江省嘉兴市农业科学研究院(所)三系粳稻保持
系嘉 58B(柱头总外露约为 1.0%)为母本进行杂交
和回交,嘉隆 17B 和嘉隆 43B 是嘉 58B 高柱头外
露率基因导入系。试验在浙江省嘉兴市农业科学研
究院(所)试验农场进行,群体及系圃均采用单本
植,插植规格为 23.0 cm×16.7 cm,水肥管理及病虫
害防治按一般生产用田。
1.2 方法
1.2.1 考察柱头外露率 2014 年 6 月,种植嘉隆
17A、B 系,嘉隆 43A、B 系和嘉 58A、B 系鉴定圃(各
1 000 株),待不育系穗杨花期随机选取 100 个单株
的主茎穗,通过目测调查每穗的总颖花数、单边柱
头外露颖花数和双边柱头外露颖花数,计算单边柱
头外露率和双边柱头外露率及总外露率。
1.2.2 分子标记检测 50S 携带的柱头外露的 QTLs
连锁标记为 SSR 标记。检测目标 QTL 的水稻 DNA
采用赵国珍等[7]提法提取,PCR 反应体系为 :DNA
模板 2 μL,灭菌水 20 μL 和混合物 16 μL。其中混合
物 为 :灭 菌 水 8.0 μL,dNTP 2.8 μL,Buffer 4.0 μL,
左右引物各 0.5 μL,Taq 酶 0.2 μL。PCR 扩增程序为:
94℃ 4 min ;94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 40 s,35 个
循环 ;72℃ 4 min ;25℃ 1 min。扩增产物用 4% 的
琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.3 考察异交结实率 2014 年 6 月至 10 月在浙
江省嘉兴市农业科学研究院(所)农场,用花时中
等偏早的籼粳交恢复系 HR511 为父本,嘉隆 43A、
嘉隆 17A 和嘉 58A 为母本,进行大田小区制种。根
据不育系的始播历期合理安排播种期。试验中父本
HR511 安排在 6 月 13 日播种,母本安排在 6 月 6
日播种,使父母本均能在 9 月 3 日左右始穗。父母
本行比为 2∶4,行距 23.0 cm,株距 16.7 cm,单本
植,每个不育系制种小区面积约为 30 m2,2 次重复。
父母本杨花后,每个小区从不育系中间 2 行选取整
齐一致的穗子 20 个进行挂牌,选其中 10 个穗,午
后观察柱头外露情况,并对柱头单双外露的颖花用
油笔做好记号,每天分 2 个时段(10 :30-11 :00,
11 :30-12 :00)进行人工辅助赶粉,直到父本的颖
花开完为止齐穗后 25 d,同时选取非标记穗 10 个,
调查籽粒的柱头外露粒的柱头夹持及结实情况。采
用 DPS 软件对调查结果进行统计分析。
1.2.4 考察外露柱头的结实率 采用延迟授粉法,
使父本开花时隔离,标记每天开的母本颖花(100
粒),去除闭颖粒和未开花粒,然后在同一天使标
记的颖花接受父本花粉,闭颖后开花标记粒的柱头
外露情况,用柱头外露粒结实率作为衡量柱头活性
的大小。分别于开花后 0、1、2、3、4、5、6 和 7 d
授粉计算柱头外露粒结实率,计算公式为 :某天外
露柱头结实率(%)=柱头外露粒结实粒数 / 柱头外
露粒数 ×100%。
2 结果
2.1 柱头外露QTL分子检测及表型
利 用 分 子 检 测 能 够 将 调 控 柱 头 外 露 的 QTL
(图 1 和表 1)导入粳稻品系中(表 2,部分导入
系)。本试验中 qPES3、qPES12 连锁标记 PSM377、
RM270 在 T60B 和嘉 58B 多态性显著(图 2),导入
系嘉隆 11A、嘉隆 13A 导入了 qPES3+qPES9,嘉隆
17A、嘉隆 43A 和嘉隆 47A 入了 qPES3+qPES12,嘉
隆 51A、嘉隆 53A 导入了 qPES9+qPES12,嘉隆 56、
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.354
嘉隆 62A 导 qPES3+qPES9+qPES12 ;嘉隆 17B 和嘉
隆 43B 早实现综合农艺性状的稳定,株型特征亲
嘉 58B,其不育系为嘉隆 17A 和嘉隆 43A,经多代
分子检测显示嘉隆 17B、嘉隆 43B 均携带 qPES3 和
qPES12 位点(图 3)。表 2 中列出的 9 个系表型值,
有 5 系 的 柱 头 外 露 率 超 过 60.0%,2 系 在 40.0%-
50.0%,2 系在 30.0%-40.0%,较嘉 58A 均表现极显
著提高,且柱头外露率(qPES3+qPES9+qPES12)>柱头外露
率(qPES3 +qPES12 或 qPES3 +qPES9)。
籽粒的结实情况。结果(表 3 和图 4)表明,嘉隆
17A 的柱头单边外露籽粒结实率为 71.22%,柱头双
边外露籽粒为 73.37%,占总结实粒的比率分别为
64.01% 和 28.65%,二者对总结实率的贡献率超过
82.0%,嘉隆 43A 的柱头单双边外露籽粒结实率分
别为 67.53% 和 62.69%,占其总结实粒比例 53.75%
和 28.72%,对总结实粒的贡献率超过 81.0%。
表 3 同时表明,嘉隆 17A 单双边柱头夹持率为
99.65% 和 97.0%,嘉隆 43A 分别为 99.0% 和 97.8%,
单柱头的夹持率略高于双柱头的夹持率,嘉 58A 柱
头不发生夹持现象,嘉隆 17A 单双边柱头夹持粒结
实率分别达 75.16% 和 72.94%,占总结实粒的比超
过 85.0%,嘉隆 43A 表现类似规律 ;研究还表明嘉
隆 17A 和嘉隆 43A 的夹持粒结实率均略高于其外露
粒结实粒。
2.3 花后外露柱头活性的动态变化
图 5 显示,3 个粳稻不育系的杨花当天(花后 0
d)柱头活性最强,均接近 80.0% 的结实率,其中柱
头外露不育系嘉隆 17A 和嘉隆 43A 的柱头略高于柱
头非外露不育系嘉 58A,在花后 1-6 d,嘉 58A 花后
1 d 后柱头活性激剧下降,花后 2 d 后柱头基本没有
హ䲶17A హ58A హ䲶43A
图 1 几个粳稻不育系的柱头外露表现
表 1 50S 控制柱头外露率的 QTL 定位 [8]
性状 位点 染色体 标记 LOD 值 贡献率 /% 加性效应
单边柱
头外露
qPES3 3 PSM377 3.64 6.40 0.045
双边柱
头外露
qPES9 9 RM5112 2.05 4.37 0.031
qPES12 12 RM270 2.29 4.95 0.033
总柱头
外露
qPES3 3 PSM377 2.96 8.70 0.067
qPES9 9 RM5112 2.17 4.90 0.035
qPES12 12 RM270 2.52 5.30 0.04
M
100
bp
1 2 3 4
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A
B
M :标准分子量 ;1,3 :T60B ;2,4 :嘉 58B
图 2 PSM377 和 RM270 在亲本间多态性分析
1-12 :分离世代材料 ;A :qPES3 连锁标记 PSM377 电泳图谱 ;B :qPES12
连锁标记 RM270 电泳图谱
图 3 柱头外露 QTL(qPES3 和 qPES12)的分子标记检测
2.2 柱头外露粳稻不育系的异交结实率
本研究调查了嘉隆 17A、嘉隆 43A 和嘉 58A 三
个不育系的杨花期外露柱头籽粒和柱头发生夹持
2016,32(3) 55蔡之军等:利用分子标记技术改良粳稻不育系的柱头外露率
活性,与嘉 58A 相比,嘉隆 17A 和嘉隆 43A 的柱头
在花后 1.5-5 d 仍有较高的授粉结实能力,柱头活力
下降幅度较平缓。其中花后 1-5 d 嘉隆 43A 柱头活
性高于嘉隆 17A,这可能与嘉隆 43A 双柱头外露率
高于嘉隆 17A,表 3 中嘉隆 17A 和嘉隆 43A 的双柱
头外露籽粒结实率均高于其对应的单柱头外露籽粒
表 2 柱头外露 QTLs 部分导入系的 A/B 系柱头外露表现
实验材料 目标基因 柱头单边外露率 /% 柱头双边外露率 /% 柱头总外露率 /%
嘉隆 11 A 系 qPES3+qPES9 32.17Aa 17.37Aa 49.54Aa
B 系 qPES3+qPES9 23.53Bb 11.36Bb 34.89Bb
A 比 B 系(±%) / +36.67 * +52.90 * +41.98 *
嘉隆 13 A 系 qPES3+qPES9 29.15Aa 13.69Aa 39.84Aa
B 系 qPES3+qPES9 17.64Bb 10.45Bb 28.09Bb
A 比 B 系(±%) / +28.87 * +33.28 * +41.82 *
嘉隆 17 A 系 qPES3+qPES12 42.21Aa 20.32Aa 62.53Aa
B 系 qPES3+qPES12 32.46Bb 12.53Bb 44.99Bb
A 比 B 系(±%) / +30.01 * +62.17 * +38.98 *
嘉隆 43 A 系 qPES3+qPES12 26.39Aa 15.48Aa 41.87Aa
B 系 qPES3+qPES12 17.65Bb 8.54Bb 26.19Bb
A 比 B 系(±%) / +49.52 * +81.26 * +59.87 *
嘉隆 47 A 系 qPES3+qPES12 39.26Aa 22.25Aa 61.51Aa
B 系 qPES3+qPES12 27.32Bb 14.93Bb 42.25Bb
A 比 B 系(±%) / +43.70 * +49.02 * +47.65 *
嘉隆 51 A 系 qPES9qPES12 40.67Aa 19.36Aa 60.03Aa
B 系 qPES9qPES12 28.89Bb 13.28Bb 42.17Bb
A 比 B 系(±%) / +40.77 * +45.78 * +43.53 *
嘉隆 53 A 系 qPES9qPES12 32.58Aa 18.52Aa 51.10Aa
B 系 qPES9qPES12 21.76Bb 12.49Bb 34.25Bb
A 比 B 系(±%) / +49.72 * +48.27 * +48.28 *
嘉隆 56 A 系 qPES3+qPES9+qPES12 46.53Aa 23.87Aa 70.40Aa
B 系 qPES3+qPES9+qPES12 37.56Bb 17.43Bb 54.99Bb
A 比 B 系(±%) / +23.88 * +34.53 * +28.74 *
嘉隆 62 A 系 qPES3+qPES9+qPES12 42.71Aa 25.66Aa 68.37Aa
B 系 qPES3+qPES9+qPES12 31.24Bb 18.35Bb 49.59Bb
A 比 B 系(±%) / +39.91 * +38.63 * +35.66 *
嘉 58(CK) A 系 / 1.15Cc 0.00Cc 1.15Cc
B 系 / 0 0 0
A 比 B 系(±%) / / / /
注 :*表示差异极显著 ;不同字母分别表示在 1%(大写字母)和 5%(小写字母)水平差异显著,下同
表 3 不育系柱头外露粒和夹持粒的结实情况
试验材料
柱头单边外露粒 柱头单边夹持粒 柱头双边外露粒 柱头双边夹持粒 总结实
率 /%总粒数 实粒数 结实率 % 总粒数 实粒数 结实率 /% 总粒数 实粒数 结实率 % 总粒数 实粒数 结实率 %
嘉隆 17A 40.25Aa 28.66Aa 71.22Aa 40.07Aa 30.12Aa 75.16Ca 17.46Ba 12.81Bc 73.37Cb 16.93Bb 12.35Bc 72.94Cb 46.32Aa
嘉隆 43A 28.14Bb 19.01Bb 67.53Bb 27.85Bb 21.27Bb 76.37Ca 16.22Ac 10.16Bc 62.69Cb 15.86Ac 10.58Bc 66.71Cb 33.75Bb
嘉 58A 1.13Cc 0.00Cc 0.00Cc 0.00Cc 0.00Cc 0.00Cc 0.00Cc 0.00Cc 0.00Cc 0.00Cc 0.00Cc 0.00Cc 7.53Cc
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.356
的结实率,进一步验证上述结论。
3 讨论
李晨等利用栽培稻和野生稻的 BC1 群体,将 2
个控制水稻柱头外露的 QTL 分别定位于第 5 染色
体 R2289-CT1553 间和第 8 染色体的 G1149-R1963
间,且认为在 5 号和 8 号染色体的 QTL 贡献率达
到 10.9% 和 11.4%[9];Miyata 等[10] 在 第 3 条 染 色
体 的 C53358-AL607101 间 定 位 了 1 个 控 制 柱 头 外
露率 QTL,并利用分子标记进行前景选择和背景
选择,获得含有 IR24 柱头外露率主效基因的新品
系,证明可以利用分子标记辅助选择柱头外露主效
QTL。邓应德等[11]利用籼粳交宜糯 5 号 / 优 B F2 群
体在第 2、5 和 8 染色体上定位到控制柱头外露率
的 QTL。尹成[12]和沈圣泉等[13]在考虑到基因互作
和 GE 互作的前提下,检查出位于 6 号染色体贡献
率达到 19.1% 的主效 QTL,虽然以上研究发现的水
稻柱头外露的 QTL 贡献率都达到 10% 以上,但是对
其应用限制,还主要是对 QTL 的紧密连锁的分子标
记发掘不够,不能高效精确实现标记辅助选择。笔
者试图利用 T60B 携带控制柱头外露的 QTL 连锁标
记,将 qPES3、qPES12 成功导入粳稻背景中并获得
qPES3+qPES12 的稳定表达粳稻不育系,研究结果再
次证明利用分子标记可以有效辅助人工创制高柱头
外露率的粳稻不育系。本研究中的两个不育系柱头
外露表现差异明显,可能与人工选择背景有关,即
qPES3、qPES12 表达存在基因型差异,与其保持系
相比,不育系的柱头外露率显著高于对应保持系,
这可能因为在粳稻背景下控制柱头外露 QTL 也存在
不育胞质效应,与籼稻中报道一致。
籼稻不育系的柱头外露颖花在开花当天及其后
的 3 d 内都具有较强的受精能力,有花粉供给时柱
头外露率在 60% 以上,则结实率一般不低于 60%,
活性柱头率 98% 以上,柱头活性强的不育系能够有
效利用父本的非及时花粉提高不育系结实率[14]。笔
者研究了粳稻不育系的杨花后柱头活力的动态变化,
结果表明,粳稻不育系的柱头活性在开花当天均表
现较强,活性柱头率 80% 左右,不育系间差异不显著,
但花后 1-7 d,柱头外露不育系的柱头在花后 1-5 d
表现较强的接受花粉结实的能力,无柱头外露不育
系的花后 2 d 柱头活性急剧下降、3 d 后基本不具备
活性,与柱头外露的籼稻不育系相比,柱头外露的
粳稻不育系活性柱头率表现较低,但柱头的活性持
续时间较长。本研究比较了粳稻不育系外露柱头的
夹持情况,结果认为柱头外露粒 95% 以上柱头发生
了夹持现象,粳稻不育系杨花闭颖时柱头外露粒和
籽粒蜡熟黄熟期柱头夹持粒表现趋势一致,在育种
实践中可通过考察籽粒的柱头夹持率来选择柱头外
露性状的目的。
4 结论
本研究通过分子标记与常规育种技术相结合,
有效改良了粳稻不育系的柱头外露率,来自籼稻的
QTLs 能够在粳稻中稳定表达。研究结果证实了分子
标记技术在选择水稻 QTLs 的可能性和有效性,同
时表明要提高粳稻的异交特性仍然要通过利用籼稻
的有利性状来实现。
参 考 文 献
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嘉隆17A 嘉58A 嘉隆43A
图 4 几个粳稻不育系柱头夹持情况
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7㣡ਾཙᮠ/d
హ䲶17Aహ䲶43Aహ58A㔃ᇎ⦷/%
图 5 几个粳稻不育系外露柱头籽粒花后活性动态
2016,32(3) 57蔡之军等:利用分子标记技术改良粳稻不育系的柱头外露率
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(责任编辑 马鑫)