全 文 ：第 32 卷 第 1 期 生 态 科 学 32(1): 040-043
2013 年 1 月 Ecological Science Jan. 2013
收稿日期：2012-01-16 收稿，2012-05-15 接受
基金项目：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金（RITFYWZX201111）
作者简介：李玫（1971—）, 女, 博士, 副研, 从事红树林湿地生态研究, E-mail: limei71@ritf.ac.cn

李玫，廖宝文. 红树林湿地烷烃降解菌的分离筛选[J]. 生态科学, 2013, 32(1): 040-043.
LI Mei , LIAO Bao-wen. Isolation and screening of hydrocarbon-degrading bacterial strains from mangrove wetland soils[J].
Ecological Science, 2013, 32(1): 041-044.
红树林湿地烷烃降解菌的分离筛选
李玫，廖宝文
中国林业科学研究院热带林业研究所，广东，广州 510520
【摘要】从受石油污染的红树林湿地土样中分离筛选对烷烃具较高降解能力的细菌菌株, 以期应用于被石油污染滨海湿地的
生物修复。采用富集培养方法，富集、分离和筛选烷烃降解菌；观察各菌落及菌体形态特征；测试菌株 Z2 的生理生化特征，
并用 16S rDNA 序列分析方法进行该菌种鉴定。分离筛选得到 Z1、Z2 和 Z3 这 3 个能以正十六烷为唯一碳源生长的菌株，其
降解率依次为 63.4%、82.5%和 78.3%，其中菌株 Z2 的降解率最高。经过形态学观察、生理生化特性实验和 16S rDNA 序列
分析鉴定，菌株 Z2 为不动杆菌(Acinetobacter sp.)。
关键词：红树林湿地；烷烃降解菌；分离筛选
doi:10.3969/j.issn. 1008-8873.2013.01.007 中图分类号： S796 ,S714 文献标识码：A 文章编号：1008-8873(2013)01-040-04
Isolation and screening of hydrocarbon-degrading bacterial strains from
mangrove wetland soils
LI Mei , LIAO Bao-wen
The Research Institute of Tropical Forestry, CAF, Guangzhou 510520, China
Abstract：Some hydrocarbon-degrading bacterial strains were isolated from the oil-contaminated mangrove soil on Qi-ao Island of
Zhuhai City through selective enriched culture. There were three strains (named Z1, Z2 and Z3) being able to grow with hexadecane as
sole carbon and energy resources. After 5 days culture, the degradation rates of Z1, Z2 and Z3 were 63.4%, 82.5% and 78.3%,
respectively. The morphological and physiological-biochemical identification, 16S rDNA sequence analysis, and phylogenetic study
showed that the strain Z2 belonged to genus Acinetobacter.

Key words: mangrove wetland, hydrocarbon-degrading bacteria, isolation and screening

1 期 李玫，等. 红树林湿地烷烃降解菌的分离筛选 41
1 引言 (Introduction)

随着石油化工工业，海洋交通运输，海洋石油
开发的日益发展，海洋溢油事故频繁发生以及大量
陆源含油废水排入海洋，石油烃类化合物已经成为
我国近岸海域的主要污染物。有关部门检测发现，
我国沿海地区海水的含油量已经超过国家规定的海
水水质标准2-8倍[1]。石油污染治理和污染环境修复
已成为世界范围内的重要课题，而经济性强且无二
次污染的生物修复技术在清除海洋石油污染中的作
用也逐渐被重视，其中微生物降解无疑是最重要的
修复方法之一。目前已知的自然界中能够降解石油
污染物的微生物类群达200多种，有关于石油烃降解
微生物的筛选、鉴定及其在石油烃污染物深度处理
中的应用，国内外已有很多报道[2,3]。从石油污染较
严重的环境中进行石油烃降解微生物的分离、培养，
以及对这些重要降解菌的鉴定是当前海洋环境微生
物学研究的重点和热点。
红树林湿地位于热带亚热带沿海潮间带，是海
岸带的生态关键区（ECR）。以往研究表明，红树林
湿地土壤中蕴藏着丰富的、可降解石油烃的微生物
资源[4]。本文采用富集培养方法，从受石油污染的
红树林湿地土壤中分离筛选出烷烃降解菌株，并对
降解能力最强的菌株Z2进行了菌株鉴定，以期为华
南滨海湿地尤其是红树林湿地石油烃污染的生物修
复提供菌种资源。

2 材料与方法(Materials and methods)

2.1 实验材料
2.1.1 供试土壤样品
土壤样品采自珠海市淇澳岛被石油污染的红树
林湿地。
2.1.2 培养基
富集用液体培养基：NaCl 24 g，NH4NO3 1 g，
KH2PO4 2 g，Na2HPO4·2H2O 3 g，MgSO4·7H2O 0.7
g，KCl 0.7 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.4，121 ℃湿
热灭菌 20 min 后补加微量元素混合液 2%（V/V）
和原油 1%（V/V）。
分离用培养基：分离用培养基为富集用无机盐
液体培养基中加入 2%琼脂。
直链烃降解菌筛选用培养基[5]：KH2PO4 0.5 g，
K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，(NH4)2SO4
1 g，微量元素溶液10 mL，蒸馏水1 000 mL，pH
7.0-7.2，碳源为正十六烷0.5%（100 mL 含0.386 7
g）。
微量元素混合溶液：ZnSO4·7H2O 0.2 g，
FeSO4·7H2O 0.5 g，CaCl2 3 g，MnSO4·H2O 0.06 g，
蒸馏水 1 000 mL。
2.1.3 药品及化学试剂
正十六烷（市售分析纯试剂）；石油醚（沸程
60-90 ℃），色谱纯，225 nm 透光率≥90%；胰蛋白
胨和酵母浸膏购 Oxid；PCR 所用试剂购于上海申能
博彩生物科技有限公司；DNA 凝胶回收试剂盒购于
Axygen。

2.2 菌株的富集与分离
将 5 g石油污染土壤样品加入 100 mL富集用液
体培养基中，充分混匀，30 ℃、150 r/min 摇床培
养 5 d；如此重复富集 4 代。从第 4 代富集培养物中
取 1 000 μL 进行梯度稀释，取 10-4-10-8 在分离培
养基平板上涂布，30 ℃静置培养 3 d。
从划线平板上挑取单菌落，在牛肉膏蛋白胨培
养基平板上划线分离，30 ℃培养 2 d，在转接至液
体牛肉膏蛋白胨培养基中，30 ℃、150 r/min 摇床培
养 1 d，取菌液以 30%甘油低温保存菌种。将保存的
菌种用牛肉膏蛋白胨培养基平板活化，挑取一环接
种于 100 mL 直链烃培养基中，30 ℃、150 r/min 摇
床培养，能在此培养基中生长的即为直链烃降解菌。

2.3 菌株降解能力测定
将保存的菌种用牛肉膏蛋白胨培养基平板活
化，挑取一环接种于 5 mL 液体牛肉膏蛋白胨培养
基，30 ℃、150 r/min 摇床培养 1 d，再取 100 μL
培养液接种至直链烃培养基中，30 ℃、150 r/min
摇床培养 5 d。
取培养 5 d 的培养物加入 250 mL 的离心管中
5 000 r/min 离心 10 min，取其上清液加 50 mL 的
石油醚萃取，用分液漏斗除去下层水相，上层有机
相倒入旋转蒸发仪 80 ℃加热蒸发除去大部分石
油醚，剩余少量石油醚倒入干燥的已称重的平皿
中，置于通风橱中自行挥发，余下的即是正十六烷。
使用分析天平进行称量，减去空平皿质量即为正十
六烷质量。
生 态 科 学 Ecological Science 32 卷 42
2.4 菌株 Z2 鉴定
对菌株Z2进行菌体形态观察、生理生化测试、
16S rDNA序列同源性比对分析，确定其分类地位。
2.4.1 形态观察和生理生化测试
菌体形态观察和生理生化测试方法参照文献[6]
进行。
2.4.2 菌株基因的克隆、测序和系统发育分析
取培养好的新鲜菌液，离心收集菌体，用酶-化学
裂解和酚仿抽提的办法提取并纯化基因组DNA [7]。用
此基因组DNA为模板，通过PCR扩增菌株16s rDNA基
因。正向引物为5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’,
反向引物5’-TACCTTGTTACGACTT-3’[8]。PCR反应程
序为94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1
min，共30个循环。1%琼脂糖电泳，紫外灯观察鉴
定。取40 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外
灯下切出目的条带，按琼脂糖DNA回收试剂盒操作
说明书进行回收纯化。
取纯化后样品送上海基康公司测序。将测得序
列提交 NCBI 进行 blast，选取同源性较高的序列以
作进一步分析；用 MEGA 软件对选取的序列进行分
析，用邻接法（Neighbor-Joining）构建系统发育树。
3 结果与分析 (Results and analysis)
3.1 直链烷烃降解菌的富集与分离
采用富集培养法，从红树林湿地的土样中分离
得到一批菌株，并进行革兰氏染色，初步判断得到
10个不同菌株，其中3个可在直链烃培养基上生长
即为直链烃降解菌，分别编号为Z1 、Z2、Z3。各
菌株的形态学特征见表1。根据降解效果测试，Z1、
Z2、Z3的5 d降解率依次为63.4%、82.5%和78.3%，
菌株Z2的降解率最高（82.5%）。
表 1 3 个菌株的形态学特征
Tab. 1 Morphologic characteristics of the three strains
菌株
Strain
菌落特征
Colony
characteristics
革兰氏染
色 Gram
stain
细胞形态
Cell
morphology
芽孢
Spore
Z1 浅黄色,圆形,表
面褶皱 ,边缘锯
齿,不透明
阳性 杆状 有
Z2 白色 ,圆形 ,光滑
湿润 ,表面凸起,
边缘平整,不透明
阴性 球杆 无
Z3 黄白色,圆形,光
滑,湿润,扁平,边
缘锯齿,透明
阴性 短杆 无
3.2 菌株 Z2 的鉴定
3.2.1 生理生化鉴定
对降解菌株Z2进行了生理生化鉴定（见表2）。
根据鉴定结果，查《细菌学鉴定手册》，得知Z2为
不动杆菌11（未命名的菌种）。
表 2 降解菌株的生理生化特征
Tab. 2 Physiological and biochemical characteristics of
strain Z2
项目
Item
结果
Result
项目
Item
结果
Result
过氧化氢 + 纤维乙糖产酸 +
淀粉水解 - 麦芽糖产酸 +
明胶液化 + 水杨素产酸 +
V.P.反应 - D-半乳糖产酸 +
H2S 产生 + 山梨醇产酸 -
运动性 - 甘露醇产酸 +
D-木糖产酸 + 葡萄糖产酸 +
D-果糖产酸 + 葡萄糖产气 -
注：+表示反应呈阳性；–表示反应呈阴性。
Note: + Reaction shows positive, –Reaction shows negative

3.2.2 16S rDNA 序列测定及比对
与 Z2 同源性最高的菌属均是 Acinetobacer sp.
（不动杆菌属），其中遗传距离最接近的是
Acinetobacer calcoaceticus 和 Acinetobacer
venetianus。结合菌株生理生化特性分析，鉴定 Z2
为不动杆菌属 Acinetobacer sp.。












图 1 菌株 Z2 的系统发育树
Fig. 1 Phylogenetic tree of strain Z2
1 期 李玫，等. 红树林湿地烷烃降解菌的分离筛选 43
4 结论与讨论 (Conclusions and discussion)
从受石油污染的红树林湿地土壤中分离筛选出
具有降解直链烷烃能力的细菌菌株3株，分别编号为
Z1、Z2和Z3；在摇瓶培养5d ，菌株Z1、Z2和Z3的
正十六烷降解率依次为63.4%、82.5%和78.3%。经形
态观察、生理生化测试和16S rDNA序列分析，降解
率最高的菌株Z2被鉴定为不动杆菌属（Acinetobacer
sp.）。不动杆菌属的菌曾多次被研究报道具有石油降
解能力[9,10]。初步认为，菌株Z2可作为备选的烷烃降
解菌，应用于被石油污染的滨海湿地（尤其是红树
林湿地）的生物修复，下一步将就其降解条件的优
化、菌体的固定化技术等开展研究。

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