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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2016, 32(2):59-69
miRNA 是真核生物体内普遍存在的一类非编
码序列长度约 22 个碱基的单链小 RNA 分子，由
特 定 发 卡 结 构（Stem-loop） 的 前 体 剪 切 加 工 而
成。成熟的 miRNA 与相关蛋白组成沉默诱导复合
体（RNA-induced silencing complex，miRISC） 与 靶
基因 mRNA 结合，降解 mRNA 或者抑制 mRNA 翻
译成蛋白质，从而调控靶基因的表达［1，2］。目前
在英国 Sanger 中心 miRBase 数据库（最新版本 21，
2014 年 6 月释放）（http://www.mirbase.org/）中共有
28 645 条成熟 miRNA 记录，涵盖物种包括囊泡藻界
（Chromalveolata）、后生动物亚界（Metazoa）、黏菌
门（Mycetozoa）、绿色植物亚界（Viridiplantae）及
病毒（Viruses）5 大类，其中记录的成熟 miRNA 人
类（Homo sapiens）2 588 个， 小 鼠（Mus musculus）
1 915 个， 秀 丽 线 虫（Caenorhabditis elegans）434
个，水稻（Oryza sativa）713 个，拟南芥（Arabidopsis
thaliana）413 个［3，4］。
MiRNA 参与生物体生长、发育、衰老和凋亡等
多个进程，其发挥的作用越来越受到研究者的重视。
根据 miRNA 序列短小的特点，开发了多种检测方法，
如 Northern blot 杂交法［5］，Primer extension（引物延
伸法）［6］，Signal-amplifying ribozymes（核酶法）［7］，
Invader assay（侵入探针法）［8］，Bead-based assay（磁
珠 法 ）［9］，qPCR 法［10］，miRAGE（miRNA 表 达 序
收稿日期 ：2015-04-30
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31460178），海南省自然科学基金项目（314042），海南省教育厅项目（HNKY2014-16），海南大学科研
启动项目（kyqd1306）
作者简介 ：冯世鹏，男，博士，讲师，研究方向 ：miRNA 功能与作用机制 ；E-mail ：feng_shipeng@hainu.edu.cn
miRNA qPCR 检测方法研究进展及其应用
冯世鹏
（海南大学农学院 海南省热带生物资源可持续利用重点实验室，海口 570228）
摘 要 ： miRNA 是目前国际研究的热点领域之一，而 miRNA 表达检测是 miRNA 研究的基础内容。针对 miRNA 序列短小的
特点，开发出了多种检测方法，其中 miRNA qPCR 定量检测是应用最广泛的方法。就 miRNA 抽提，miRNA qPCR 定量检测原理及
miRNA qPCR 定量检测流程包括引物设计、反应体系设置、内参基因筛选等方面进行了深入探讨，并对 miRNA 定量检测研究方法
的发展趋势进行了展望，以期为研究者进行 miRNA qPCR 定量检测提供参考。
关键词 ： miRNA ；stem-loop RT-PCR ；poly（A）加尾法 RT-PCR ；延伸法 RT-PCR ；数字 PCR
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.02.008
Research Advance on miRNA qPCR Methods and Its Application
FENG Shi-peng
（Hainan Key Laboratory for Sustainable Utilization of Tropical Bioresource，College of Agriculture，Hainan University，Haikou 570228）
Abstract: miRNA is one of the hottest research fields in the world. The detection of miRNA expression is the fundamental content in
miRNA research. Due to the feature of miRNAs being short and small, varied methods were developed, and quantitative miRNA qPCR is the
most widely used one. This paper reviews the developments of miRNA extraction method, quantitative detection principle of miRNA qPCR,
primer design, the reaction condition, and reference gene selection. The developments of miRNA qPCR methods in the future are also discussed.
All of these may provide a reference for researchers in the field when they detect miRNA by qPCR method.
Key words: miRNA ；stem-loop RT-PCR ；poly（A）tailing RT-PCR ；extension RT-PCR ；digital PCR
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列分析法）［11］，深度测序法［12］等。
以上这些方法的优劣及使用情况已经有相关文
献［13］进行了报道，其中 qPCR 方法使用最多，本
文将对近年 miRNA qPCR 方法的研究进展进行论述，
以期对今后 miRNA 的 qPCR 定量检测提供参考意见。
1 miRNA 抽提方法
目前对于 miRNA 的抽提主要有两类方法。一类
是沉淀法，通过强有机试剂裂解细胞释放 RNA，再
用乙醇、异丙醇、乙酸钠、LiCl 等试剂进行 RNA 沉
淀，常见的裂解液如不同公司的 Trizol 试剂（含有
强有机试剂异硫氰酸胍等）；另一类是柱吸附法，通
过裂解液裂解细胞释放 RNA 后，用吸附柱分离纯化
小 RNA 分子（表 1）。
1.1 细胞类样本及动物组织样本miRNA抽提
对于人、动物、植物细胞，微生物细胞个体及
人与动物组织样本，常用沉淀法法抽提总 RNA，该
方法通过 Trizol 试剂裂解细胞释放 RNA，再进行总
RNA 的沉淀，此方法易于操作，所抽提的 RNA 里
面包含 miRNA 等小 RNA 分子，并可满足大多数情
况下 miRNA 检测之用［14，15］；有些吸附柱可同时吸
附所有类型的 RNA，利用这种吸附柱也可抽提含
miRNA 的总 RNA 分子［16，17］，也有部分吸附柱只
能吸附大片段的 RNA 或者只能吸附小片段的 RNA，
基于这类吸附柱开发的试剂盒对于 RNA 的抽提则需
要将大片段的 RNA（>200 nt）与小片段（<200 nt）
RNA 分别提取［18，19］。有部分实验需要较高纯度的
表 1 常见样本 miRNA 抽提方法汇总表
类型 样本特点 抽提过程 商业化试剂盒 文献
单细胞类
及组织
细胞数量多 ；需液氮研磨 异硫氰酸胍裂解细胞 ；异丙醇沉淀 Trizol，Life technologies，USA ［14，15］
异硫氰酸胍裂解细胞 ；柱吸附 miRNeasy Kit，Qiagen，Germany ［16，17］
胍盐裂解细胞两种柱分别吸附总 RNA
及小 RNA
miRNA extraction Biokit，Norgen，Canada ［18］
mirVana miRNA kit，LifeTechnologies，USA ［19］
液体 细胞数量少 ；含较多水分 浓缩异硫氰酸胍裂解细胞 ；异丙醇沉淀 Trizol LS，Life technologies，USA ［20］
浓缩异硫氰酸胍裂解细胞 ；柱吸附 miRNeasy Serum/Plasma Kit，Qiagen，USA ［21］
石蜡组织 细胞数量多 ；RNA 降解 ；
含石蜡成分 ；需切片 ；
盐酸胍裂解细胞 ；柱吸附 AP PLUS FFPE Kit，Life Technologies，USA ［24］
去石蜡 ；盐酸胍裂解细胞 ；柱吸附 miRNeasy FFPE Kit，Qiagen，USA ［25］
普通叶片 细胞数量多 ；需液氮研磨 异硫氰酸胍裂解细胞 ；异丙醇沉淀 Trizol，Life technologies，USA ［27-31］
多杂叶片 细胞数量多 ；需液氮研磨
含多酚、多糖等
液氮研磨 ；CTAB 去胶乳 ；胍盐溶液裂
解细胞 ；乙酸钠沉淀
Modified Trizol 法 ［32］
miRNA（如 miRNA 测序、miRNA 的表达谱研究等），
可在抽提的总 RNA 基础上进一步采用吸附柱或凝胶
电泳纯化分离纯化 miRNA 分子。
对于血样、唾液、精液等液体样本，因其所含
细胞少、水分多等特点需用浓缩型的 miRNA 抽提
试剂［20，21］。Ho 等［22］比较了不同公司 6 款针对液
体样本的 miRNA 抽提方法，发现其抽提效果稍有
差异，该结果可为研究者进行商业化试剂盒选择时
提供参考。Tzimagiorgis 等［23］对于血浆、血清、唾
液、脑髓液等体液样本游离核酸的来源、样本前处
理及 miRNA 抽提方法进行了综合讨论，可为液体样
本 miRNA 抽提提供参考。
对于石蜡样本，因其 RNA 有不同程度降解，所
含石蜡会影响后续实验反应，样本 miRNA 抽提前需
进行去石蜡操作［24，25］，不同公司开发了针对石蜡样
本的 miRNA 抽提试剂盒，其实际使用使用效果有一
定差异，选择时需谨慎［26］。
1.2 植物组织样本miRNA抽提
由于植物的根、茎、叶、花、果不同组织或者
不同植物的同一组织中所含的次生代谢产物的种类
及含量不一样，导致植物组织的 miRNA 抽提方法更
加多样化。对于模式植物拟南芥、大部分禾本科植
物、部分其他科植物的叶片来说，用 Trizol 进行总
RNA 抽提，其中所包含的 miRNA 分子可用于大多数
情况下的 miRNA 表达检测［27-31］。对于一些特殊植物，
如橡胶树叶片含有较多胶乳成分，香蕉和荔枝等水
2016,32(2) 61冯世鹏 ：miRNA qPCR 检测方法研究进展及其应用
果树叶片含多糖等成分，其总 RNA 及 miRNA 的抽
提需要进行去除这些成分的前期处理［32］。
1.3 miRNA质控
包含 miRNA 的总 RNA 抽提完毕之后需进行质
量检测，包括 RNA 完整性、浓度、纯度的检测。其
中 RNA 的完整性主要用两种方法检测 ：一是 RNA
凝胶电泳（PAGE 或琼脂糖凝胶电泳均可），28S 条
带的亮度约为 18S 条带的 2 倍，则证明所抽提总
RNA 完整性较好 ；二是进行 RIN 值（RNA integrity
number）检测（如用 Agilent 2100 进行芯片电泳），
RIN 值大于 7 则证明样本所抽提 RNA 完整性较好。
RNA 的浓度及纯度可用测吸光度的方法进行测定
检测 260 nm、280 nm 和 230 nm 三个波长的吸光值
A260、A280 和 A230，常用 A260 吸光值与浓度换算关系
是 OD 值相当于 RNA 浓度 44 ng/mL ；A260 与 A280 的
比值可评估是否有 DNA 或者蛋白质污染，该比值大
于 2.0 则证明 RNA 纯度较高 ；A260 与 A230 的比值是
看有机杂质残留，该值越大则认为 RNA 样本含有机
杂质越少［33］。
2 miRNA qRT-PCR 检测
2.1 miRNA前处理
miRNA 由于其自身特点，对其进行特异性检测
面临一些挑战。如序列长度太短，只有 22 bp ；GC
含量不均一 ；缺少类似 polyA 的公共序列 ；存在初
级转录本（pri-miRNA）、前体（pre-miRNA）、成熟
miRNA 三种形式 ；miRNA 家族成员间序列相差几个
碱基，甚至只差一个碱基［14］。因此对于 miRNA 的
检测方法设计，从得到的 RNA 样本即开始综合考虑。
获得含有 miRNA 的高质量 RNA 样本后，在第
一链 cDNA 合成之前，按照对该样本 RNA 的处理方
式分 3 种类型 ：一是不做任何处理（图 1-A）；二是
使用 poly（A）聚合酶（poly（A）polymerase，PAP）
在 miRNA 的 3 端连接 poly（A）尾（表 2，图 1-B）；
三是在 miRNA 的 3 端或两端均添加 linker（图 1-C，
图 1-D）。
2.1.1 Poly（A）加尾法 其最显著的好处在于为所
有待检测 miRNA 引入类似 mRNA 的 poly（A）尾，
便于后续反转录时通过带 poly（T）的反转录引物一
次将所有的 miRNA 反转录为 cDNA，对于用 qPCR
法进行 miRNA 表达谱研究来说非常实用。其缺点是
加尾完毕需进行 RNA 纯化，无论是用乙醇沉淀［34］
还是通过吸附柱［35］回收来纯化，均会损失一部分
miRNA 表达信息。另外，PAP 酶的反应效率也很难
达到 100%，这也会导致一部分 miRNA 表达信息的
损失，从而导致低表达的 miRNA 无法检测，其他可
检测的 miRNA 表达量下降 ；另外由于不同公司的
PAP 酶及不同的反应条件会导致 poly（A）尾的长短
产生一定的差异，导致 qPCR 检测时出现杂峰，在
反转录引物设计时必须考虑这种情况，并尽力避免。
Poly（A）加尾法所需的总 RNA 量目前文献报道在
0.5 μg 以上，因该方法后续处理纯化的损失，因此
建议起始量在条件许可的情况下可适当增加（如 2
μg），这样有利于检测低表达的 miRNA，同时加尾
处理后的 RNA 可用于其他 miRNA 检测实验，也不
会浪费。
2.1.2 linker 连接法 在成熟的 miRNA 一端或者两
端同时使用 T4 RNA 连接酶进行 linker 连接，其优
点是 ：直接增加了 miRNA 的长度，使引物设计时可
选择引物结合范围增大 ；在 3 端引入 linker，可用
miRNA
PAP
miRNA
T4
3˃ linker
T4
3˃ linker
5 ˃linker
miRNAmiRNA
A B C D
AAAAAAAA
н༴⨶
A ：不处理 ；B ：加入 poly（A）polymerase（PAP）加尾处理使 miRNA 3 端加入 poly（A）尾 ；C ：加入 T4 RNA 连接酶进
行 3 linker 连接 ；D ：加入 T4 RNA 连接酶进行两端 linker 连接
图 1 成熟 miRNA 的前处理
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通用引物进行反转录 ；若同时在一端或者两端引入
公共接头，如需要可设计通用引物。其缺点是 ：受
T4 RNA 连接酶反应效率影响，易导致低丰都表达的
miRNA 难以检测［36］。
2.2 第一链cDNA合成
2.2.1 Poly（A）加尾法 对于通过 poly（A）加尾
处理过的 RNA 样本来说，根据待检测的 miRNA 数
量，取适量 RNA 加入带 poly（T）的反转录引物进
行反应即可（表 2）。该反转录引物常用这种形式表
示 adapter（T）nVN，从 5 端开始依次可分为 3 部
分（ 图 2-C）：（1）adapter 部 分， 用 于 引 入 通 用 反
向引物位点，文献报道其长度范围集中在 32-75 nt，
其结构为线性或者发卡状。为了进一步引入通用
taqman 探针结合位点，或者后续实验有其他应用如
构建文库，该部分可设计为较长的片段，并设计成
发卡结构也增加其稳定性［37，38］。（2）poly（T）n 部分，
于 miRNA 的 poly（A）尾互补配对，长度在 12-25
nt 之间（表 2）。由于 PCR 反应过程中需扩增该片
段，为避免扩增过程中出现聚合酶打滑现象，同时
较长的引物片段会增加引物合成的困难，建议这部
分的序列设计尽量不要太长。（3）VN 部分，V 代表
A、G 和 C 三者之一，N 代表 A、T、G 和 C 四者之
一（表 2），这一部分的作用是与 miRNA 互补配对，
锚定反转录时的起始位置，避免由于 poly（A）尾长
短的差异导致 qPCR 时出现杂峰（图 2-C）。这部分
的 长 度 有 1nt［38］，2nt［24，35］，5-7 nt［39］， 其 中 2 nt
使用最多，该部分长度小于或等于 2 nt 的属于通用
引物，包含由 3 种（1 nt 情况）或者 12 种（2 nt 情况）
引物的混合物，其反转录产物理论上可以检测所有
的 miRNA ；大于 2 nt 的属于特异引物，主要用于进
AAAAAAAA
A
B
C
D
AAAAAAAAAAAAAAAA
༴⨶ਾⲴmiRNA о৽䖜ᖅᕅ⢙㔃ਸ ৽䖜ᖅ
NVTTTTTTTTNVTTTTTTTT
A ：加入线性引物反转录 ；B ：加入 stem-loop 引物进行反转录 ；C ：加入 adapter-poly（T）n VN 引物进行反转录 ；
D ：加入通用（或特异）反转录引物进行反转录
图 2 反转录反应流程图
行特定 miRNA 的检测，提高 qPCR 检测的特异性［39］。
2.2.2 Stem-loop 引物反转录或线性引物反转录 对
于未经加尾处理的 RNA 样本来说，需加入 miRNA
的特异引物进行 miRNA 的反转录（图 2-A，2-B），
若需同时检测多个 miRNA，则必须将这些 miRNA
的特异引物混合后进行反转录反应。miRNA 特异引
物一般包括 2 部分，从 5 端开始依次是 ：（1）延长
部分，该部分的作用是引入反向引物结合位点，其
结构可分为线性和 stem-loop 发卡结构两种。线性结
构反转录引物可通过引物的联合设计取得较理想的
检测效果，如 qPCR 正向引物 LNA 修饰［40］；或通过
RT 反转录引物与反向引物的协同设计，使 miRNA
有特异的 RT 引物及 qPCR 反向引物等［41］。发卡结
构可看成是在线性结构基础上的改进，发卡结构对
于线性结构来说，在反转录时可提高反转录引物与
miRNA 结合的稳定性，并由于发卡结构的位阻效应
可避免反转录引物与前体 miRNA 的结合，从而提高
miRNA 检测的灵敏度和特异性［10］。在发卡结构引
物中还可引入 dU 碱基，在反转录完毕后加入鸟嘧
啶 DNA 糖 基 化 酶（uracil-DNA glycosylase，UDG），
在 dU 碱基处将 DNA 断裂为两段，这样可去除反转
录过程中剩余的 RT 引物，而已经转录完毕的 cDNA
在 dU 处断裂后余下的片段也可作为 qPCR 反应的模
板，这样进一步提高 qPCR 检测的特异性［42］。（2）
2016,32(2) 63冯世鹏 ：miRNA qPCR 检测方法研究进展及其应用
与 miRNA 互补配对部分，这部分与 miRNA 检测特
异性密切相关。这部分的长度集中在 6-8 nt，Lao
等［43］测试这部分长度对于 RT 引物与 miRNA 结合
效率的影响，从 5-10 nt，在 8 nt 之前，随着长度的
增加，RT 引物结合效率显著增加 ；在 8 nt 之后则增
加不明显。Jung 等［44］测试获得了类似的结果，同
时发现发卡结构的序列与 miRNA 结合位点间的 gap
越大，RT 引物与 miRNA 结合的效率越差。
2.2.3 Linker 引物反转录 在 miRNA 的 3 端 连 上
linker 后，由于引入了通用的反转录引物接合位点，
可直接使用通用反转录引物进行反转录反应（图
2-D）；也可设计成 miRNA 特异的反转录引物。若设
计为通用反转录引物，一般分为 2 部分，从 5 端依
次是延长部分，进一步引入通用 qPCR 反向引物位
点 ；与 linker 配对部分，实现加尾后的 miRNA 反转
录。若设计为 miRNA 特异的反转录引物，则设计时
会进一步延伸若干碱基与 miRNA 配对，从而实现特
定 miRNA 的反转录［36］。
2.2.4 反转录引物浓度设定 在引物浓度方面，进
行 特 定 miRNA 检 测 时 的 RT 引 物 浓 度 集 中 在 50
nmol/L 范围 ；如果要同时检测多个 miRNA，则将这
些 miRNA 相应的 RT 引物混合，每条引物均为 50
nmol/L ；带 poly（T）的引物浓度序列明显高于其他
非 poly（T）的引物浓度（500 nmol/L 以上）（表 2）。
表 2 miRNA qRT-PCR 方法汇总表
类别
引物特点
总 RNA 起始量 RT 引物浓度
qPCR 引物浓度
循环数 文献
RT qPCR FP RP 染料 / 探针
polyA 加尾 通用 RT
adapter（32）T（12）VN
特异 FP ；
通用 RP
2 μg 0.5 μg 0.2 μmol/L 0.2 μmol/L Sybr green 45x ［34］
通用 RT
adapter（73）T（25）VN
特异 FP ；
通用 RP
0.5 μg 1 μg 5 μmol/L 5 μmol/L Sybr green 40x ［35］
通用 RT
adapter（32）T（12）VN
特异 FP ；
通用 RP ；
通用探针
1 μg 0.5 μg 0.5 μmol/L 0.5 μmol/L 0.05 μmol/L 45x ［37］
特异 RT
Adapter（35）T（11）N
（5-7）
特异 FP ；
通用 RP ；
通用探针
1 μg 0.5 μmol/L 0.2 mmol/L 0.2 mmol/L 0.25 mmol/L 40x ［39］
通用 stem-loop RT
adapter（66）T（12）V
特异 FP ；
通用 RP ；
通用探针
无法获取 无法获取 10 μmol/L 10 μmol/L 10 μmol/L 45x ［38］
Stem-loop
RT-PCR
特异 stem-loop RT 特异 FP ；
通用 RP ；
特异探针
0.025-250 ng 50 nmol/L 1.5 μmol/L 0.7 μmol/L 0.2 μmol/L 40x ［10，43］
特异 stem-loop RT 特异 FP ；
通用 RP ；
通用探针
20 pg 50 nmol/L 0.5 μmol/L 0.5 μmol/L 0.1 μmol/L 35x ［44，45］
特异 stem-loop RT 带 dU 特异 FP ；
半嵌套 RP
100 ng 100 nmol/L
each
0.1 μmol/L 0.1 μmol/L Sybr green 50x ［42］
引物延伸 特异 RT 特异 rev ；
通用 FP ；
通用 RP
5-50 ng 25 nmol/L 0.1 μmol/L 0.1 μmol/L Sybr green 40x ［46］
特异 RT 特异 FP ；
特异 RP
20-100 ng 250 nmol/L
total
NA NA Sybr green 35x ［41］
特异 RT 特异 FP ；
通用 RP
200 pmol/L 0.5 μmol/L 0.8 μmol/L 0.8 μmol/L Sybr green 40x ［40］
注 ：RT ：反转录引物 ；FP ：正向引物 ；RP ：反向引物
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.264
2.3 qPCR反应
miRNA 反转录成 cDNA 后，均经过适当延长，
已经可以进行 qPCR 扩增，其检测方法有染料法（如
Sybr green 染料）（图 3-A）和探针法（如 Taqman 探
针）（图 3-B）。qPCR 的引物根据其特点可分为以下
几种类型。
2.3.1 染料法 （1）特异正向引物（forward primer，
FP）和通用反向引物（reverse primer，RP）。特异正
向引物从 5 端开始依次分为延长部分以及与 miRNA
序列一致部分两部分 ：延长部分，序列为人为设
计，可进行 LNA 修饰，主要用于调节引物的 GC 含
量、Tm 值、长度等，使其与下游引物相匹配 ；与
miRNA 序列一致部分是提供 miRNA 检测特异性的
最重要部分，对于部分 polyA 加尾法来说，miRNA
检测特异性直接决定于这一个部分的特异结合情况。
通用反向引物来自与反转录引物的延长部分，所有
的 miRNA 反转录引物这部分均设计相同的序列，导
致可以采用通用反向引物［34，35］。（2）特异正向引
物及特异反向引物。其中特异正向引物与前一种情
况相同。特异反向引物来源于针对特定的 miRNA
设计的特异反转录引物，这些特异反转录引物除了
与 miRNA 互补配对部分提供特异性外，针对不同
的 miRNA，其反转录引物延伸部分也不完全一样，
而 qPCR 反向引物必须根据反转录引物的序列进行
设计，最终导致各个 miRNA 有不同的特异反向引
物［41］；或者是使用半嵌套引物，反向引物有部分序
列与 miRNA 互补配对，也导致不同的 miRNA 有特
异的反向引物［42］。（3）通用正向引物、通用反向引
物。这是由于在 PCR 体系中除了正反向引物外，还
加入了另一条引物，该引物从 5 端开始依次分两
部分 ：延伸部分，提供了通用正向引物序列 ；与
miRNA 序列一致部分，提供了引物检测的特异性 ；
通用反向引物由反转录引物序列提供［46］。
2.3.2 探针法 （1）特异正向引物、通用反向引物、
特异探针。其中特异探针是由于探针设计的位置有
一部分与 miRNA 序列匹配，导致不同的 miRNA 需
用特异探针，进一步提高了检测的特异性［10］。（2）
特异正向引物、通用反向引物、通用探针。其中探
针的位置设计在反转录引物的延伸部分，由于不同
miRNA 其延伸部分相同或者至少探针结合位置序列
相同，因此可使用通用探针［37-39，44，45］。
2.3.3 qPCR 反应体系 （1）引物浓度确定。qPCR
正反向引物的使用浓度集中在 0.1-1 μmol/L 之间（表
2），其中尤以 0.1-0.2 μmol/L 浓度使用较多，增加
正反向引物的浓度，可提高检测灵敏度，但同时也
可导致非特异扩增现象的产生，因此引物浓度需经
预实验确定，一般起始浓度建议 0.2 μmol/L。探针
的浓度集中在 0.1-0.5 μmol/L 之间，其浓度也需预
实验确定，起始浓度建议 0.1 μmol/L。（2）循环数
设定。qPCR 循环数集中在 35 x-45 x 之间（表 2），
循环数的增加也会导致非特异扩增现象，一般进行
qPCR 定量检测结果统计时循环数在 18-25 之间，则
数据分析结果比较可信，因此建议 miRNA qPCR 时
的循环数设置在 35x 即可。（3）qPCR 方法选择。在
miRNA 进行 qPCR 检测的众多方法之中，何种是最
好的尚无定论，从检测特异性及实验花费来说有相
同的趋势 ：特异探针法≥通用探针法≥ Sybr green
染料法，在实际操作中应结合实际情况综合考虑。
Adhikari 等［47］ 比 较 poly（A） 加 尾 法 和 stem-loop
RT-PCR 方法对于植物的 miRNA 检测效果，认为由
于植物 miRNA 的甲基化，导致 stem-loop RT-PCR 检
测方法比 polyA 加尾法更准确可信。Jung 等［44］比较
stem-loop RT-PCR 时用通用探针获得的 qPCR 检测特
异性和灵敏度与特异探针一致，但是通用探针可大
幅降低实验消耗费用。Varkonyi-Gasic 等［45］比较认
为 stem-loop RT-PCR 方法使用通用探针法检测的特
异性要优于 Sybr green 染料法。整体来说，poly（A）
A
B
↓ੁᕅ⢙ ৽ੁᕅ⢙↓ੁᕅ⢙ ৽ੁᕅ⢙Taqman
A ：染料法（如 Sybr green 染料）；B ：探针法（如 Taqman 探针）
图 3 miRNA qPCR 反应
2016,32(2) 65冯世鹏 ：miRNA qPCR 检测方法研究进展及其应用
加尾法，操作过程较繁琐，但是由于引入通用 poly（A）
尾，可使用通用反转录引物进行反转录，适合进行
miRNA qPCR 表达谱组学研究 ；stem-loop RT-PCR 方
法检测灵敏度高，比较适合进行少数 miRNA 的特异
检测。如需同时检测多个 miRNA，可将这些 miRNA
的反转录引物混合反转录，但混合后可能会导致非
特异扩增［43］，因此在 miRNA 的反转录引物混合前
最好通过预实验确定这些引物混合的适用性。
2.3.4 其他 qPCR 检测方法 （1）一步法 qRT-PCR。
Yan 等［48］尝试用一步法进行 miRNA 的 qPCR 检测，
该方法的原理是用一条反转录引物 RT1 将 miRNA
反转录为 cDNA，用另一条引物 RT2 与 cDNA 模板
结合并通过聚合酶延伸相互补齐，最后用 P1 与 P2
引物进行 qPCR 扩增，其中 P1 是 RT1 引入的结合位
点，P2 是 RT2 引 入 的 结 合 位 点。 对 于 不 同 的
miRNA 其 RT1 与 RT2 引物均有部分与 miRNA 对应，
因此这 2 条引物是特异的 ；P1 与 P2 可根据需求使
其变为通用引物或者 miRNA 特异引物。该方法的优
点是一步完成 qPCR 检测，减少操作步骤 ；其最大
的缺点是 4 条引物在一起，可能导致非特异扩增。
（2）钳形探针法。Huang 等［49］开发了一种钳形探
针方法（Prince probe）进行 miRNA 二步法 qPCR 检
测，其原理是用长链钳形探针与 miRNA 配对，由于
钳形探针的 5 端与 3 端部分与 miRNA 完全互补配
对，并且第一个碱基与最后一个碱基重叠同时利用
反转录酶的活性特定，在 40℃时 5 端与 miRNA 完
全互补配对，捕获 miRNA ；温度降低至 25℃时，3
端与 miRNA 部分互补配对，实现 miRNA 的反转录 ；
反转录产物即可用于 qPCR 扩增。该方法的灵敏度
与特异性与 stem-loop 方法类似，但是其最大的优点
在于可区分成熟 miRNA 及其前体。（3）数字 PCR
技术。数字 PCR 技术（digital PCR）是一项新的技
术，目前已应用于进行 miRNA 的绝对定量检测［50-52］，
该方法分 4 步完成，第一步将定量 PCR 技术的所
使用的引物、探针或者染料（如 Taqman 探针或者
EvaGreen 染料）、特殊的数字 PCR 反应液混合均匀 ；
第二步使用特殊的仪器及反应板制备微滴，10 000
微滴以上，每一个微滴相当于一个单独 PCR 反应 ；
第三步将制备好含微滴的样本转入普通 96 孔 PCR
板并进行普通 PCR 扩增 ；第四步将 PCR 扩增产物
使用特殊仪器进行荧光信号的检测实现对基因的绝
对定量。该技术最大的特点是仪器和试剂的改进导
致可进行微量样本的绝对定量检测 ；其最大的缺点
是须使用特殊的仪器、试剂、耗材，运行成本昂贵。
3 内参基因选择
目前公认的理想内参基因需要符合以下几个条
件 ：在不同组织及不同生理条件下表达稳定 ；表达
量较高，易于检测 ；与目标基因有相似的性质，如
目标基因与内参基因均为蛋白编码基因或均为非编
码 RNA 等。其中第一条最重要也最难达到，不同
物种不同生理条件下使用的内参基因各不相同（表
3），即使被广泛使用的内参基因 Actin 和 GAPDH，
在一定条件下，其表达会发生改变或受到其他基因
的调控［69］。因此，对特定条件下的内参基因进行
实验筛选是一种严谨的做法，但要求每一位研究者
对所使用的内参基因进行实验测定也不现实。理论
上不存在完全理想的内参基因，只能寻找相对表达
稳定的基因，对于新鲜的组织及细胞样本，用于
miRNA 检测的常见内参基因是 U6 及 5S ；对于血
样，常见的内参基因是 miR-16，借助外源加入其他
物种的 miRNA 作内参，或者联合使用多种内参基因
（表 3）。
4 结语
本文对目前所使用的 miRNA qPCR 定量检测方
法进行了总结，从 RNA 抽提，miRNA qPCR 方法选
择，miRNA qPCR 流程中的引物设计、模板浓度、
引物浓度、循环数等反应条件设置，内参基因选择
等各方面进行了探讨，并指出了在一般条件下进行
实验设计时的相应参数。miRNA qPCR 技术今后的
发展方向将是准确、易操作、所涉及到的试剂性价
比高，如在不损失检测灵敏度与特异性的条件下尽
可能采用通用引物或者通用探针，在样本量珍贵稀
少时仍可准确检测等。未来对于 miRNA 定量检测的
要求将会越发严格，包括样本制备、抽提 RNA 质控、
内参选择、实验重复性方面将会有越来越高的要求，
这样一方面可以保证实验的可重复性，并提高不同
研究者的实验数据可比性 ；另一方面对研究者的实
验设计及实验操作等方面提出了较高的要求，需要
尽快适应。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.266
参 考 文 献
［1］ Rana TM. Illuminating the silence ：understanding the structure and
function of small RNAs［J］. Nat Rev Mol Cell Biol, 2007, 8 （1）：
23-36.
［2］ Schwarz DS, Zamore PD. Why do miRNAs live in the miRNP?
［J］. Genes Dev, 2002, 16 （9）：1025-1031.
［3］ Kozomara A, Griffiths-Jones S. miRBase ：annotating high
confidence microRNAs using deep sequencing data［J］. Nucleic
Acids Res, 2014, 42 ：D68-D73.
［4］ Griffiths-Jones S, Saini HK, Van Dongen S, Enright AJ. miRBase ：
tools for microRNA genomics［J］. Nucleic Acids Res, 2008, 36 ：
D154-D158.
［5］ Lee RC, Feinbaum R, Ambros V. The C. elegans heterochronic
gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity
to lin-14［J］. Cell, 1993, 75（5）：843-854.
［6］ Zeng Y, Cullen BR. Sequence requirements for micro RNA
processing and function in human cells［J］. RNA, 2003, 9（1）：
112-123.
［7］ Hartig JS, Grune I, Najafi-Shoushtari SH, et al. Sequence-specific
detection of MicroRNAs by signal-amplifying ribozymes［J］. J Am
Chem Soc, 2004, 126（3）：722-723.
［8］ Allawi HT, Dahlberg JE, Olson S, et al. Quantitation of microRNAs
using a modified Invader assay［J］. RNA, 2004, 10（7）：1153-
1161.
［9］ Babak T, Zhang W, Morris Q, et al. Probing microRNAs with
microarrays ：Tissue specificity and functional inference［J］.
RNA, 2004, 10（11）：1813-1819.
［10］ Chen C, Ridzon DA, Broomer J, et al. Real-time quantification of
microRNAs by stem-loop RT-PCR［J］. Nucleic Acids Res, 2005,
33（20）：e179.
［11］ Cummins JM, He Y, Leary RJ, et al. The colorectal microRNAome
［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103（10）：3687-3692.
［12］ Kozomara A, Griffiths-Jones S. miRBase ：annotating high
confidence microRNAs using deep sequencing data［J］. Nucleic
Acids Res, 2014, 42 ：D68-D73.
［13］ Benes V, Castoldi M. Expression profiling of microRNA using real-
time quantitative PCR, how to use it and what is available［J］.
Methods, 2010, 50（4）：244-249.
［14］ Ding LF, Jiang Z, Chen QY, et al. A functional variant at miR-520a
binding site in PIK3CA alters susceptibility to colorectal cancer
in a Chinese Han population［J］. Biomed Res Int, 2015, clx.doi.
org/10.1155/2015/373252.
表 3 实验所筛选的内参基因汇总
物种 样本类型 所筛选内参基因 文献
人体组织 乳腺组织 联合 Let-7a 和 miR-16 ［53］
尿路上皮癌
联合 miR-101，miR-125a-5p，miR-148b，miR-151-5p ；或联合 miR-148b，miR-
181b，miR-874 ［54］
肾细胞癌 miR-28 ；或联合 miR-28，miR-103 ；或联合 miR-28，miR-103，miR-106a ［55］
人体血样 前列腺癌、膀胱癌血清 SNORD43 ；或联合 SNORD43，RNU1-4 ［56］
胃癌血清 miR-16 ；或 miR-93 ［57］
结肠腺癌血清 联合 miR-191-5p，U6 ［58］
HBV 感染或肝癌血清 联合 miR-221，miR-191，let-7a，miR-181a，miR-26a ［59］
HBV 感染血清 联合 miR-26a，miR-221，miR-22* ［60］
动物组织或血样 大鼠子宫癌 U87 ［61］
大鼠视网膜 U6 或 miR-16 ［62］
大鼠血浆 miR-103 ［63］
猪组织 miR-17 或 miR-103 或 miR-107 ［64］
妊娠猪 RNU1A ［65］
猪囊胚 miR-16 ［66］
牛组织 联合 miR-191，U6，let-7f ［67］
大西洋鲑鱼 miR-25-3p ；或联合 miR-25-3p，miR-455-5p ［68］
植物组织 柑橘组织 snoR14 或 snoRD25 ；或联合 snoR14 + U6，snoR14 + U5 ［69］
龙眼组织 miR24 ；或联合 miR156c，miR2089*-1，5S ［70］
大麦组织 ADP 或 snoR14 或 snoR23 或 miR168 ［71］
2016,32(2) 67冯世鹏 ：miRNA qPCR 检测方法研究进展及其应用
［15］ Chen R, Jiang N, Jiang Q, et al. Exploring microRNA-like small
RNAs in the filamentous fungus Fusarium oxysporum［J］. PLoS
One, 2014, 9（8）：e104956.
［16］ Halper B, Hofmann M, Oesen S, et al. Influence of age and physical
fitness on miRNA-21, tgF-β and its receptors in leukocytes of
healthy women［J］. Exec Intell Rev, 2015, 21 ：154-163.
［17］ Tominaga N, Kosaka N, Ono M, et al. Brain metastatic cancer cells
release microRNA-181c-containing extracellular vesicles capable
of destructing blood-brain barrier［J］. Nat Commun, 2015, 6 ：
6716. doi ：10. 1038/ncomms7716. .
［18］ Poudel S, Aryal N, Lu CF. Identification of microRNAs and
transcript targets in Camelina sativa by deep sequencing and
computational methods［J］. PLoS One, 2015, 10（3）：
e0121542.
［19］ Cerdá-Olmedo G, Mena-Durán AV, Monsalve V, et al. Identification
of a microRNA signature for the diagnosis of Fibromyalgia［J］.
PLoS One, 2015, 10（3）：e0121903.
［20］ Lo YMD, Tsui NBY, Chiu RWK, et al. Plasma placental RNA
allelic ratio permits noninvasive prenatal chromosomal aneuploidy
detection［J］. Nat Med, 2007, 13（2）：218-223.
［21］ Sarrion I, Milian L, Juan G, et al. Role of Circulating miRNAs as
biomarkers in idiopathic pulmonary arterial hypertension ：possible
relevance of miR-23a［J］. Oxid Med Cell Longev, 2015, 2015 ：
792846.
［22］ Ho YK, Xu WT, Too HP. Direct quantification of mRNA and
miRNA from cell lysates using reverse transcription real time
PCR ：a multidimensional analysis of the performance of reagents
and workflows［J］. PLoS One, 2013, 8（9）：e72463.
［23］ Tzimagiorgis G, Michailidou EZ, Kritis A, et al. Recovering
circulating extracellular or cell-free RNA from bodily fluids［J］.
Cancer Epidemiol, 2011, 35（6）：580-589.
［24］ Wakabayashi K, Mori F, Kakita A, et al. Analysis of microRNA
from archived formalin-fixed paraffin-embedded specimens of
amyotrophic lateral sclerosis［J］. Acta Neuropathol Commun,
2014, 2（1）：173.
［25］ Pan LJ, Huang SN, He RQ, et al. Decreased expression and clinical
significance of miR-148a in hepatocellular carcinoma tissues［J］.
Eur J Med Res, 2014, 19（1）：68.
［26］ Doleshal M, Magotra AA, Choudhury B, et al. Evaluation and
validation of total RNA extraction methods for microRNA
expression analyses in formalin-fixed, paraffin-embedded
tissues［J］. J Mol Diagn, 2008, 10（3）：203-211.
［27］ Reiche M, Li YJ, Li JY et al. Inhibiting plant microRNA activity ：
molecular SPONGEs, target MIMICs and STTMs all display variable
efficacies against target microRNAs［J］. Plant Biotechnol J,
2015, 13（7）：915-926.
［28］ Yin FQ, Qin C, Gao J, et al. Genome-wide identification and analy-
sis of drought-responsive genes and microRNAs in tobacco［J］.
Int J Mol Sci, 2015, 16（3）：5714-5740.
［29］ Wang YL, Zhao ZL, Deng MJ, et al. Identification and functional
analysis of microRNAs and their targets in Platanus acerifolia
under lead（Pb）stress［J］. Int J Mol Sci, 2015, 16（4）：7098-
7111.
［30］ Zhou J, Cheng Y, Yin M, et al. Identification of Novel miRNAs and
miRNA expression profiling in wheat hybrid necrosis［J］. PLoS
One, 2015, 10（2）：e0117507.
［31］ Yu R, Wang Y, Xu L et al. Transcriptome profiling of root micro-
RNAs reveals novel insights into taproot thickening in radish（Ra-
phanus sativus L. ）［J］, BMC Plant Biol, 2015, 15（1）：30.
［32］ Peng J, Xia ZH, Chen L, et al. Rapid and efficient isolation of
high-quality small RNAs from recalcitrant plant species rich in
polyphenols and polysaccharides［J］. PLoS One, 2014, 9（5）：
e95687.
［33］ Becker C, Hammerle-Fickinger A, Riedmaier I, et al. mRNA and
microRNA quality control for RT-qPCR analysis［J］. Methods,
2010, 50（4）：237-243.
［34］ Shi R, Chiang VL. Facile means for quantifying microRNA
expression by real-time PCR［J］. Biotechniques, 2005, 39（4）：
519-524.
［35］ Ro S, Park C, Jin JL, et al. A PCR-based method for detection
and quantification of small RNAs［J］. Biochem Biophys Res
Commun, 2006, 351（3）：756-763.
［36］ Mishim T, Mizuguchi Y, Kawahigashi Y, et al. RT-PCR-based
analysis of microRNA（miR-1 and -124）expression in mouse
CNS［J］. Brain Res, 2007, 1131（1）：37-43.
［37］ Reichenstein I, Aizenberg N, Goshen M, et al. A novel qPCR assay
for viral encoded microRNAs［J］. J Virol Methods, 2010, 163（2）：
323-328.
［38］ Luo X, Zhang J, Wang HJ, et al. PolyA RT-PCR-based quantification
of microRNA by using universal TaqMan probe［J］. Biotechnol
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2016,Vol.32,No.268
Lett, 2012, 34（4）：627-633.
［39］ Kang K, Zhang XY, Liu HT, et al. A novel real-time PCR assay
of microRNAs using SPoly（T）, a specific oligo（dT）reverse
transcription primer with excellent sensitivity and specificity［J］.
PLoS One, 2012, 7（11）：e48536.
［40］ Raymond CK, Roberts BS, Garrett-engele P, et al. Simple,
quantitative primer-extension PCR assay for direct monitoring or
microRNAs and short-interfering RNAs［J］. RNA, 2005, 11（11）：
1737-1744.
［41］ Wang XW. A PCR-based platform for microRNA expression
profiling studies［J］. RNA, 2009, 15（4）：716-723.
［42］ Wan GQ, Lim QE, Too HP. High-performance quantification of
mature microRNAs by real-time RT-PCR using deoxyuridine-
incorporated oligonucleotides and hemi-nested primers［J］.
RNA, 2010, 16（7）：1436-1445.
［43］ Lao KQ, Xu NL, Yeung V, et al. Multiplexing RT-PCR for the
detectio n of multiple miRNA species in small samples［J］.
Biochem Biophys Res Commun, 2006, 343（1）：85-89.
［44］ Jung U, Jiang XO, Kaufmann SHE, et al. A universal TaqMan-
based RT-PCR protocol for cost-efficient detection of small
noncoding RNA［J］. RNA, 2013, 19（12）：1864-1873.
［45］ Varkonyi-Gasic E, Wu RM, Wood M, et al. Protocol ：a highly
sensitive RT-PCR method for detection and quantification of
microRNAs［J］. Plant Methods, 2007, 3 ：12.
［46］ Sharbati-Tehrani S, Kutz-Lohroff B, Bergbauer R, et al. miR-Q ：a
novel quantitative RT-PCR approach for the expression profiling of
small RNA molecules such as miRNAs in a complex sample［J］.
BMC Mol Biol, 2008, 9 ：34.
［47］ Adhikari S, Turner M, Subramanian S. Hairpin priming is better
suited than in vitro Polyadenylation to generate cDNA for plant
miRNA qPCR［J］. Mol Plant, 2013, 6（1）：229-231.
［48］ Yan JL, Zhang N, Qi C, et al. One-step real time RT-PCR for
detection of microRNAs［J］. Talanta, 2013, 110 ：190-195.
［49］ Huang TH, Yang J, Liu GP, et al. Quantification of mature micro-
RNAs using pincer probes and real-time PCR amplification［J］.
PLoS One, 2015, 10（3）：e0120160.
［50］ Faragó N, Kocsis ÁK, Lovas S, et al. Digital PCR to determine
the number of transcripts from single neurons after patch-clamp
recording［J］. Biotechniques, 2013, 54（6）：327-336.
［51］ Miotto E, Saccenti E, Lupini L, et al. Quantification of circulating
miRNAs by droplet digital PCR ：comparison of EvaGreen- and
TaqMan-based chemistries［J］. Cancer Epidemiol Biomarkers
Prev, 2014, 23（12）：2638-2642.
［52］ Li N, Ma J, Guarnera MA, et al. Digital PCR quantification of
miRNAs in sputum for diagnosis of lung cancer［J］. J Cancer Res
Clin Oncol, 2014, 140（1）：145-150.
［53］ Davoren PA, McNeill RE, Lowery AJ, et al. Identification of
suitable endogenous control genes for microRNA gene expression
analysis in human breast cancer［J］. BMC Mol Biol, 2008, 9 ：
76.
［54］ Ratert N, Meyer HA, Jung M, et al. Reference miRNAs for
miRNAom e Analysis of urothelial carcinomas［J］. PLoS One,
2012, 7（6）：e39309.
［55］ Wotschofsky Z, Meyer HA, Jung M, et al. Reference genes for the
relative quantification of microRNAs in renal cell carcinomas and
their metastases［J］. Anal Biochem, 2011, 417（2）：233-241.
［56］ Sanders I, Holdenrieder S, Walgenbach-Brünagel G, et al.
Evaluation of reference genes for the analysis of serumn miRNA
in patients with prostate cancer, bladder cancer and renal cell
carcinoma［J］. Int J Urol, 2012, 19（11）：1017-1025.
［57］ Song JN, Bai ZG, Han W, et al. Identification of suitable reference
genes for qPCR analysis of serum microRNA in gastric cancer
patients［J］. Dig Dis Sci, 2012, 57（4）：897-904.
［58］ Zheng G, Wang H, Zhang X, et al. Identification and validation
of reference genes for qPCR detection of serum microRNAs in
colorectal adenocarcinoma patients［J］. PLoS One, 2013, 8（12）：
e83025.
［59］ Li Y, Zhang LQ, Liu F et al. Identification of endogenous controls
for analyzing serum exosomal miRNA in patients with hepatitis B or
hepatocellular carcinoma［J］. Dis Markers, 2015, 893594 doi ：
10.1155/20151893594.
［60］ Zhu HT, Dong QZ, Wang G, et al. Identification of suitable
reference genes for qRT-PCR analysis of circulating microRNAs in
hepatitis B virus-infected patients［J］. Mol Biotechnol, 2012, 50
（1）：49-56.
［61］ Jurcevic S, Olsson B, Klinga-Levan K. Validation of suitable
endogenous control genes for quantitative PCR analysis of
microRNA gene expression in a rat model of endometrial
cancer［J］. Cancer Cell Int, 2013, 13（1）：45.
［62］ Tea M, Michael MZ, Brereton HM, et al. Stability of small non-
2016,32(2) 69冯世鹏 ：miRNA qPCR 检测方法研究进展及其应用
coding RNA reference gene expression in the rat retina during
exposure to cyclic hyperoxia［J］. Mol Vis, 2013, 19 ：501-508.
［63］ Wang Y, Tang NP, Hui TT, et al. Identifi cation of endogenous
reference genes for RT-qPCR analysis of plasma microRNAs levels
in rats with acetaminophen-induced hepatotoxicity［J］. J Appl
Toxicol, 2013, 33（11）：1330-1336.
［64］ Giu Y, Li M, Zhang K, et al. Identification of suitable endogenous
control microRNA genes in normal pig tissues［J］. Anim Sci J,
2011, 82（6）：722-728.
［65］ Wessels JM, Edwards AK, Zettler C, et al. Selection and validation
of reference genes for miRNA expression studies during porcine
pregnancy［J］. PLoS One, 2011, 6（12）：e28940.
［66］ Li J, Wei HX, Li Y, et al. Identification of a suitable endogenous
control gene in porcine blastocysts for use in quantitative PCR
analysis of microRNAs［J］. Sci China Life Sci, 2012, 55（2）：
126-131.
［67］ Li D, Liu H, Li Y, et al. Identification of suitable endogenous control
genes for quantitative RT-PCRanalysis of miRNA in bovine solid
tissues［J］. Mol Biol Rep, 2014, 41（10）：6475-6480.
［68］ Johansen I, Andreassen R. Validation of miRNA genes suitable as
reference genes in qPCR analyses of miRNA gene expression in
Atlantic salmon（Salmo salar）［J］. BMC Res Notes, 2014, 7 ：
945.
［69］ Kou SJ, Wu XM, Liu Z, et al. Selection and validation of suitable
reference genes for miRNA expression normalization by quantitative
RT-PCR in citrus somatic embryogenic and adult tissues［J］.
Plant Cell Rep, 2012, 31（12）：2151-2163.
［70］ Lin YL, Lai ZX. Evaluation of suitable reference genes for normaliza
tion of microRNA expression by real time reverse transcription PCR
analysis during longan somatic embryogenesis［J］. Plant Physiol
Biochem, 2013, 66 ：20-25.
［71］ Ferdous J, Li Y, Reid N, et al. Identification of reference genes for
quantitative expression analysis of microRNAs and mRNAs in bar-
ley under various stress conditions［J］. PLoS One, 2015, 10（3）：
e0118503.
［72］ Sikand K, Singh J, Ebron JS, et al. Housekeeping gene selection
advisory ：glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（GAPDH）
and b -Actin are targets of miR-644a［J］. PLoS One, 2012, 7（10）：
e47510.
（责任编辑 狄艳红）