全 文 ：HPLC法检测蛇莓中齐墩果酸的含量
袁晓环 1 , 王伟光1 , 李春彦 2 , 武　艳1 , 张羽飞 1 , 初彦辉 1
(牡丹江医学院 1.黑龙江省抗纤维化生物治疗重点实验室 , 2.药学系 , 黑龙江 牡丹 157011)
　　摘　要:目的 探讨 HPLC测定蛇莓中齐墩果酸含量的方法。方法 采用 ThermoODS-2HYPERTILC18(250 mm
×4.6mm, 5 μm)色谱柱;流动相:0.065 moL/LNaH2PO4溶液-甲醇(14∶86);检测波长:210 nm;流速:0.8 mL/min。
结果 齐墩果酸在 0.19 ～ 2.16 μg范围内呈良好线性关系(r=0.998 2);平均回收率为 98.6%, RSD(n=9)为
1.68%。结论 此法简单 、准确 、可靠 , 可以作为评价蛇莓质量的有效方法。
　　关键词:蛇莓;齐墩果酸;高效液相色谱
　　中图分类号:R284.1　　文献标识码:A　　文章编号:1005-1678(2010)03-0195-03
DeterminationofoleanolicacidinDuchesneaIndicaebyHPLCmethod
YUANXiao-huan1 , WANGWei-guang1 , LIChun-yan2 , WUYan1 , ZHANGYu-fei1 , CHUYan-hui1
(1.HeilongjiangKeyLaboratoryofAnti-fibrosisBiotherapy;2.PharmacyDepartment,
MudanjiangMedicalColege, Mudanjiang157011 , China)
　　Abstract:PurposeToinvestigatethemethodaboutthedeterminationofoleanolicacidinDuchesnea
Indicae.MethodsThechromatographicseparationwasperformedonaThermoODS-2HYPER-TILC18
(250mm×4.6 mm, 5 μm).Thecolumntemperaturewas25 ℃.ThemobilephaseconsistsofNaH2PO4
(0.065 mol/L)-Methylalcohol(14∶86).Examinationwavelengthwas210 nm.Theflowratewas0.8
mL/min.ResultsThelinerrelationshipofoleanolicacidwasgoodwithintherangeof0.19-2.16μg(r=
0.998 2).Theaveragerecoverywas98.6% andRSD(n=9)was1.68%.ConclusionThemethodis
simple, accurateandreliable, anditcanbeusedasanefectivewaytoevaluatethequalityofDuchesnea.
Keywords:DuchesneaIndicae;oleanolicacid;HPLC
收稿日期:2009-10-12
基金项目:黑龙江省卫生厅项目(2009-006)
作者简介:袁晓环(1969-),女 ,黑龙江牡丹江人 , 硕士 ,教授 ,从
事药物化学的研究工作 , Tel:0453-6582156-3647, Email:yuanxiaohuan
@yahoo.cn。
　　蛇莓为蔷薇科多年生草本植物蛇莓 Duchesnea
india(Andr.)Focke的全草 ,为民间常用草药 ,别名
有宝珠草 、三点红 、三叶莓 、鸡冠果 、龙吐珠 、小叶莓
等 ,史载于《别录 》[ 1] ,其性味甘 、苦 、寒 ,具有清热凉
血 、消肿解毒之功效 [ 2] ,蛇莓临床应用历史悠久 ,用
于治疗热病 、惊痫 、痢疾 、咽喉肿痛 、咳嗽吐血 、蛇虫
咬伤等 ,但缺少质量评价方法 。现代研究表明齐墩
果酸具有清热 、消炎 、抑菌 、强心 、利尿和抗肿瘤作
用 [ 3] ,本实验采用高效液相色谱法(HPLC)测定蛇
莓中齐墩果酸的含量 ,可为测定蛇莓中三萜类有效
成分齐墩果酸及评价药材质量提供实验依据。
1　仪器与试药
LC-10AT高效液相色谱仪 (日本岛津公司);
BP211D型电子天平(德国赛多利斯公司);RE-52
旋转蒸发仪(上海安亭科学仪器厂)。
蛇莓饮片(批号 060103/05, 060305/06,哈尔滨
市盛泰中药饮片加工厂);齐墩果酸对照品 (批号
110709-200505,中国药品生物制品检定所);甲醇
(色谱纯 ,天津市科密欧化学试剂开发中心)。
2　方法与结果
2.1　色谱条件
色谱柱:ThermoODS-2HYPERTILC18 (250 mm
×4.6 mm, 5 μm);流动相:0.065 moL/LNaH2PO4
溶液 -甲醇(14∶86);流速:0.8 mL/min;柱温:26 ℃;
检测波长:210 nm。
2.2　标准曲线的制备
精密称取齐墩果酸对照品 9.80 mg,置于 50mL
量瓶中 ,加甲醇溶解并稀释至刻度 ,摇匀 ,得每 1 mL
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含齐墩果酸 0.196 mg的对照品溶液 。分别吸取齐
墩果酸对照品溶液 1, 4, 8, 10, 12 μL注入液相色谱
仪 ,记录色谱图(图 1),测定峰面积(A)。以 A对对
照品的量 (X, μg),进行线性回归 ,得回归方程:A=
1.528 7X-0.204 4, r=0.998 2。齐墩果酸在 0.19
～ 2.16 μg范围内峰面积与浓度呈良好线性关系 。
图 1　齐墩果酸对照品 HPLC图
Fig.1　HPLCchromatogramofreferencestandardoleanolicacid
2.3　方法学考察
2.3.1　系统适用性试验　取 2.2项下对照品溶液
10 μL,注入液相色谱仪 ,理论板数以齐墩果酸峰计
为 11 304。
2.3.2　精密度试验　精密吸取同一蛇莓样品溶液
10 μL,重复进样 6次 ,按上述色谱条件测定其含量 ,
RSD为 1.99%。表明本方法精密度良好。
2.3.3　稳定性试验　精密吸取同一蛇莓样品溶液
10 μL,分别于 0, 3, 6, 9, 24 h注入液相色谱仪 ,测定
峰面积 ,计算齐墩果酸含量 ,其 RSD为 1.29%,表明
本方法稳定 。
2.3.4　加样回收率试验　称量 9份已知含量的蛇
莓粉碎品(批号 060103/05,含齐墩果酸 0.85 μg/g)
200.00 g,分别加入 0.196 mg/mL齐墩果酸对照品
溶液 1, 1, 1, 2, 2 , 2, 5, 5, 5 mL, 按照 2.4项下方法制
备供试品溶液 ,并测定含量 ,计算加样回收率 ,结果见
表 1。平均回收率为 98.6%, RSD(n=9)为 1.68%。
表 1　回收率试验结果
Tab.1　Resultsofextractionrecoveryexperiment
序号 原有量 /mg加入量 /mg测得量 /mg回收率 /%
1 0.170 0.196 0.359 96.4
2 0.170 0.196 0.363 98.5
3 0.170 0.196 0.369 101.5
4 0.170 0.392 0.554 98.0
5 0.170 0.392 0.566 101.0
6 0.170 0.392 0.551 97.2
7 0.170 0.980 1.131 98.1
8 0.170 0.980 1.135 98.5
9 0.170 0.980 1.130 98.0
平均 98.6
2.4　测定方法
2.4.1　供试品溶液的制备　蛇莓干燥全草粉碎 ,称
取 200 g,加入 95%乙醇溶液 300 mL,浸泡过夜 ,过
滤 ,活性炭脱色后抽滤 ,滤液减压浓缩至 50 mL;然
后用等体积石油醚萃取 3次 ,保留萃取后的原料液 ,
再减压浓缩至干 ,加少量醇溶解即为预供试品溶液。
将预供试品溶液分别和对照品做薄层色谱
(TLC)预分离 。 TLC板为:硅胶 G-0.4%羧甲基纤
维素钠水溶液(1∶3),以环己烷 -丙酮 -醋酸乙酯-冰
醋酸(65∶25∶10∶1)为展开剂展开 ,喷以 5%硫酸乙
醇溶液 ,于 105℃加热至斑点显色清晰 ,把与对照品
所显斑点相同位置的供试品斑点抠下 ,用甲醇 50
mL溶解 ,过滤 ,滤液减压浓缩至干 ,再加甲醇至 10
mL,使溶 ,即得供试品溶液 。
2.4.2　测定　精密吸取供试品溶液 10 μL注入液
相色谱仪 ,记录色谱图 ,见图 2。采用外标法以峰面
积计算各蛇莓干燥全草中齐墩果酸含量 ,重复测定
5次。结果批号 060103/05和 060305 /06蛇莓干燥
全草中齐墩果酸含量分别为 0.85和 0.81 μg/g;
RSD(n=5)分别为 1.99%和 1.23%。
图 2　蛇莓样品中齐墩果酸 HPLC色谱图
Fig.2　HPLCchromatogramofoleanolicacidinHerbaDuch-
esneaIndicae
3　讨　论
本实验以 95%乙醇做溶剂 ,用浸泡法 、回流提
取法对其进行了提取并做了含量测定 ,结果表明回
流法提取样品杂质较少 ,但含量也低 ,不易检测;浸
泡法测定含量高 ,但杂质较多 ,两法测定齐墩果酸的
含量分别 0.17%和 0.89%。为了减少杂质 ,我们采
用薄层色谱预分离 ,含量基本没有损失而且杂质大
为减少。所以本实验采用乙醇浸泡加 TLC进行样
品处理。
实验所用的 HPLC条件是在文献 [ 4]基础上 ,
根据实际情况 ,经过多次优化 、筛选而确定的 。齐墩
果酸中无共轭体系 ,紫外吸收波长较短 ,故色谱条件
尤为重要 。实验表明选择 210 nm为检测波长时 ,基
线稳定 ,分离度也较好。流动相也是经过多次筛选 ,
最终确定为 0.065 mol/LNaH2PO4 溶液 -甲醇
(14∶86)。该法简单易行 ,重现性好 ,并且干扰小。
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结果表明 ,蛇莓中的三萜类成分含量很低 ,尤其
齐墩果酸成分含量微少。本实验建立的蛇莓药材中
齐墩果酸的 HPLC含量测定方法 ,操作简便 、结果可
靠 、重复性好 ,可为控制蛇莓药材及其制剂的质量提
供依据 。
参考文献:
[ 1] 　国家中医药管理局《中华本草 》编委会.中华本草 [ M].上海:
上海科学出版社 , 1999:2628.
[ 2] 　江苏新医学院.中华大辞典(下册)[ M] .上海:上海科技出版
社 , 1985:2115.
[ 3] 　ChenLi, ZhangYihua, KongXiangwen, etal.Synthesisandbiolog-
icalevaluationofnitricoxide-releasingderivativesofoleanolicacid
asinhibitorsofHepG2celapoptosis[ J] .BioorgMedChemLet,
2007, 17(11):2979-2982.
[ 4] 　杨林 ,裴瑾 ,万德光.威灵仙药材中三萜苷元齐墩果酸含量的
HPLC测定 [ J] .天然产物研究与开发 , 2006, 18:313-315.
高效毛细管电泳法测定硫酸软骨素含量
沈建如 , 陈振德 , 于荣敏
(暨南大学 药学院 , 广东 广州 510632)
　　摘　要:目的 建立高效毛细管电泳测定原料药及片剂中硫酸软骨素含量的方法。方法 采用区带毛细管电泳
为分离模式 , 操作电压 -30kV,毛细管温度 25℃,检测波长 200 nm,操作缓冲液为 15mol/L磷酸二氢钠溶液(磷酸
调 pH至 3.0), 压力进样(50 mbar×15s), 外标法定量。结果 硫酸软骨素在 0.04 ～ 2.02 mg/mL的浓度范围内呈
良好的线性关系(r=0.999 8), 平均回收率为 100.2%。 结论 该法快速 、简单 、准确 , 可用于原料药及片剂中硫酸
软骨素的含量测定。
　　关键词:硫酸软骨素;毛细管电泳;含量测定
　　中图分类号:R927.2　　文献标识码:A　　文章编号:1005-1678(2010)03-0197-03
Determinationofchondroitinsulfatebyhighperformancecapilaryelectrophoresis
SHENJian-ru, CHENZhen-de, YURong-min
(SchoolofPharmacy, JinanUniversity, Guangzhou510632, China)
　　Abstract:PurposeToestablishahighperformancecapilaryelectrophoresismethodfordetermina-
tionofchondroitinsulfateinrawmaterialandtablets.MethodsCapilaryzoneelectrophoresiswasper-
formedat30 kVusingreversedpolarityin15mmol/Lsodiumdihydrogenphosphateinwater(pH3.0).
Pressureinjectionmodewaswith50 mbar×15 s, andthetemperaturewas25 ℃.Detectionwavelength
wasperformedat200 nm.ResultsChondroitinsulfateshowedagoodlinearrelationshipintherange
0.04-2.02 mg/mL(r=0.999 8).Theaveragerecoverywas100.2%.ConclusionThismethodissim-
ple, rapidandaccurate.Itcouldbeusedinthedeterminationofchondroitinsulfateinrawmaterialand
tablets.
Keywords:chondroitinsulfate;highperformancecapilaryelectrophoresis;determination
收稿日期:2009-09-14
作者简介:沈建如(1984-), 女 , 硕士研究生;于荣敏(1955-),
男 , 通信作者 , 博士 , 教授 , 博导 , Tel:020-85220386, E-mail:tyrm@
jnu.edu.cn。
　　硫酸软骨素 (ChondroitinSulfate, CS)是从牛 、
猪 、羊等动物软骨中提取的一种酸性黏多糖 ,临床上
主要作为骨关节炎和类风湿性关节炎的防治药物 。
此外 , CS对冠心病 、动脉粥样硬化等心血管疾病 、骨
关节炎等有一定的治疗效果 [ 1-3] 。目前 , CS含量测
定方法包括比浊法 、分光光度法 、液相色谱法等 [ 4-7] ,
但均属于间接测定 ,且操作繁琐 。本文旨在利用高
效毛细管电泳 ,建立一套快速 、准确的直接测定原料
药及制剂中 CS含量的方法 ,以满足实际生产中的
日常大批量检验需要。
197中国生化药物杂志 ChineseJournalofBiochemicalPharmaceutics2010年第 31卷第 3期