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白鹃梅的离体培养及植株再生试验



全 文 :第41卷 第5期
2013年5月
西北农林科技大学学报(自然科学版)
Journal of Northwest A&F University(Nat.Sci.Ed.)
Vol.41 No.5
May 2013
网络出版时间:2013-05-02 10:55
网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20130502.1055.021.html
白鹃梅的离体培养及植株再生试验
 [收稿日期] 2012-08-15
 [基金项目] 武汉市农科院攻关项目(Y201009)
 [作者简介] 戢小梅(1983-),女,湖北十堰人,工程师,硕士,主要从事园林植物种质资源收集及林业生态工程研究。
E-mail:meihua2010@yahoo.com.cn
 [通信作者] 舒常庆(1966-),男,湖北武汉人,副教授,主要从事园林植物遗传育种研究。E-mail:472933102@qq.com
戢小梅1,2,许 林1,谢焰锋1,董艳芳1,陈卫东1,舒常庆2
(1武汉市林业果树科学研究所,湖北 武汉430075;2华中农业大学 园艺林学学院,湖北 武汉430070)
[摘 要]  【目的】探讨不同植物生长调节剂对白鹃梅芽苗再生和生根的影响,为白鹃梅的开发利用、工厂化育
苗及遗传育种研究奠定基础。【方法】以白鹃梅的嫩茎段为外植体,接种前用1g/L的HgCl2 溶液对材料进行不同时
间(6,8,10,12min)的消毒处理,筛选适宜的消毒时间;采用均匀设计法,将无菌外植体接种在附加有不同质量浓度植
物生长调节剂(0,0.5,1.0,1.5和2.0mg/L 6-BA,0,0.1,0.3,0.5和0.7mg/L NAA)的 MS培养基中,筛选诱导直
接再生芽苗的适宜培养基;将直接再生芽苗接种在附加有不同种类和质量浓度植物生长调节剂(0.1,0.3,0.5和
0.7mg/L 6-BA,0.1,0.3,0.5和0.7mg/L IBA)的1/2MS培养基中,筛选诱导生根的适宜培养基。【结果】1g/L
HgCl2 溶液对白鹃梅嫩茎段的最适宜消毒时间为8min,在该条件下外植体的成活率为95.2%;白鹃梅直接再生芽苗
的最适宜诱导培养基为 MS+6-BA 1.0mg/L,在该培养基上直接再生芽苗的诱导率可达85.7%;生根培养基以
1/2MS+0.3mg/L NAA的生根效果最好,生根率达到70.45%。【结论】获得了白鹃梅嫩茎段适宜的消毒时间及适
宜的再生芽苗和生根培养基配方。
[关键词] 白鹃梅;离体培养;植株再生;均匀设计法
[中图分类号] S685.124+.3 [文献标志码] A [文章编号] 1671-9387(2013)05-0160-05
In vitro culture and plantlet regeneration
of Exochorda racemosa(Lindl.)Rehd
JI Xiao-mei 1,2,XU Lin1,XIE Yan-feng1,DONG Yan-fang1,
CHEN Wei-dong1,SHU Chang-qing2
(1 Wuhan Science Research Institute of Forestry&Fruit-tree,Wuhan,Hubei 430075,China;
2 College of Horticulture and Foresty,Huazhong Agricultural University,Wuhan,Hubei 430070,China)
Abstract:【Objective】The research of the effects of different kinds of plant growth regulator combina-
tion on bud differentiation and the influence on rooting effect were studied to set up a stable regeneration
systerm and to lay a foundation and method for exploitation and application,Industrial Seedling,and the
study of inheritance and breeding of Exochorda racemosa(Lindl.)Rehd.【Method】The tender stems of
Exochorda racemosa(Lindl.)Rehd were used explants in the experiment.Explants were disinfected at vari-
ous time(6,8,10,12min)of using 1g/L Hg solution before inoculated,and slected the best time for disin-
fection of explants;The explants disinfected were cultured in MS medium supplemented with different con-
centration of hormones(0~2.0mg/L 6-BA,0~0.7mg/L NAA)was filtrated and optimized by using uni-
form design;The shoots regeneration cultured in 1/2MS medium supplemented with different hormones
and concentrations(0.1~0.7mg/L 6-BA,0.1~0.7mg/L IBA)was filtrated and optimized.【Conclusion】
DOI:10.13207/j.cnki.jnwafu.2013.05.030
The best time of disinfection in 1g/L Hg solution was 8min,and the survival rate of explants was 95.2%;
the best medium for shoots regeneration was MS+1.0mg/L 6-BA,the rate of induction was 85.7%;the
best medium for rooting was 1/2MS+0.3mg/L NAA,the rate of rooting was 70.45%.【Result】It was
obtained the tender stems of Exochorda racemosa needed a suitable time for sterilization,induction of the
shoots regeneration by the tender stems and rooting of the shoots regeneration needed suitable concentra-
tion of formula of medium.
Key words:Exochorda racemosa(Lindl.)Rehd;in vitro culture;plantlet regeneration;uniform design
  白鹃梅(Exochorda racemosa(Lindl.)Rehd)又
名茧子花、珍珠菜,系蔷薇科(Rosaceae)白鹃梅属
(Exochorda)植物,为既可观花又能赏果的有待研
究开发的优良野生园林植物,属落叶灌木,多数呈小
乔木状,其花蕾及嫩梢的营养价值较高,是一种优良
的木本蔬菜,具有较高的开发利用价值[1]。另外,白
鹃梅属于野生资源,是白鹃梅属植物育种的重要种
质资源。白鹃梅利用常规扦插繁殖很难生根[1],多
采用播种繁殖,但种子不易采集,使其开发利用受到
极大限制。目前,关于白鹃梅的研究多集中在食
用[2-4]、繁殖[1]及应用前景分析方面[5],而离体快繁
技术研究尚鲜见报道[6]。为此,本研究采用组织培
养法进行白鹃梅的快速繁殖,建立了从嫩茎段到丛
生芽的无性繁殖体系,所使用的消毒处理和激素组
合与已有报道不同,有利于快速提供大量种苗且不
受季节限制,旨在为白鹃梅的开发利用、工厂化育苗
及遗传育种研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材 料
白鹃梅枝条采自武汉市林业果树科学研究所野
生植物资源圃,该圃位于武汉市东部近郊,海拔67
m,地理坐标为N 30°30′60″,E 114°27′05″;土壤为黄
棕壤,土层深厚;年平均气温16.2~16.7℃,年降雨
量1 140~1 265mm,年均无霜期为237~271d。
本试验以白鹃梅带腋芽的嫩茎段为外植体。
1.2 HgCl2 消毒时间的确定
将带腋芽的嫩枝剪下,在自来水龙头下流水冲
洗20min。在超净工作台上用1g/L的 HgCl2 溶
液分别浸泡6,8,10和12min,浸泡过程中连续振
荡,取出后分别用无菌水反复清洗6次,用无菌纸吸
干水分,切成1.5~2.0cm的茎段,接种于无菌的培
养基中,2周后统计污染率。每30个茎段为1个处
理,每个处理3次重复。
1.3 直接再生芽苗诱导培养基的筛选
以 MS为基本培养基,将消毒好的白鹃梅嫩枝
切成一叶一段,长度约1cm,接入无菌的诱导直接
再生芽苗培养基中培养。培养基配方为:MS培养
基中附加不同质量浓度的6-BA(由预试验确定为
0,0.5,1.0,1.5和2.0mg/L)、萘乙酸(NAA,由预
试验确定为0,0.1,0.3,0.5和0.7mg/L)、30g/L
蔗糖和5.4g/L琼脂(为日本BIOSHARP产品),
pH 为5.6。培养温度为(25±1)℃,光照周期为12
h/d,光照强度2 200lx。采用均匀设计法[7]U5(52)
均匀设计表,每个处理接种白鹃梅嫩茎段30个培
养,重复3次,嫩茎段培养45d后,统计污染数、褐
化数和萌发茎段数,计算诱导率(诱导率=萌发茎段
数/接种茎段数×100%),并计算平均值,以筛选出
适宜的诱导直接再生芽苗的6-BA和NAA质量浓
度配比。
1.4 白鹃梅生根培养基的筛选
将消毒好的白鹃梅嫩枝在芽诱导培养基中培养
22~24d,使基部再生出丛芽,将长度超过2.5cm
的嫩枝从芽丛上分离,接入生根培养基。生根培养
基配方为:1/2MS培养基中单独添加不同质量浓度
的NAA(0.1,0.3,0.5,0.7mg/L)或者吲哚丁酸
(Indole-3-Butytric acid,IBA,0.1,0.3,0.5,0.7
mg/L),以及30g/L蔗糖和5.4g/L琼脂,pH 为
5.6。生根培养温度为(25±1)℃,光照周期为
12h/d,光照强度2 200lx。每处理接种白鹃梅丛芽
30个,重复3次。再生丛芽培养40d后统计生根
数、根长,计算生根率、平均生根条数和平均根长(生
根率=生根数/接种数×100%),结果取3次重复的
平均值,以筛选诱导生根较适宜的 NAA、IBA质量
浓度配比。
1.5 数据处理
白鹃梅的芽增殖诱导试验采用均匀设计法进行
设计,试验数据采用Excel 2003进行处理;生根培
养的试验数据采用SPSS19.0进行方差分析,采用
Ducan’s检验进行多重比较。试验结果用平均值或
“平均值±标准差”表示。
161第5期 戢小梅,等:白鹃梅的离体培养及植株再生试验
2 结果与分析
2.1 HgCl2 溶液消毒时间的确定
由表1可以看出,HgCl2 溶液处理6min消毒
效果不好,污染率高达86.7%;处理8min消毒效
果较好,既能保证外植体较高的成活率,又能将污染
率控制在较低的范围内;处理10min虽然污染率较
低,但成活率也降低到82.6%,整体效果不及8min
处理;处理12min污染数最低,但大多数外植体丧
失了再生能力,其成活率仅为20.8%。因此,对白
鹃梅外植体较适宜的消毒处理方法为:在流水下冲
洗20min,放入超净工作台后,用1g/L HgCl2 溶液
消毒8min,取出后用无菌水反复冲洗。
表1 HgCl2 对白鹃梅嫩茎段消毒不同时间污染率的比较
Table 1 Comparison of the tender stems of E.racemosa′s
contamination rate in different sterilize time by Hg solution
消毒时间/min
Disinfec-
tiontime
污染数
Number of
poluted
污染率/%
Contamination
rate
成活数
Number
of survived
成活率/%
Survival
rate
6  26  86.7  4  100.0
8  9  30.0  20  95.2
10  7  23.3  19  82.6
12  6  20.0  5  20.8
2.2 白鹃梅直接再生芽苗诱导培养基的筛选
由均匀设计试验结果(表2)分析可得回归方程
为Y=0.776+0.557 X1-1.249 X2,其中Y 代表诱
导 率,X1代表6-BA质量浓度,X2代表NAA质量
浓度,样本容量n=5,显著性水平α=0.05。通过计
算,复相关系数R2=0.993,检验值Ft=69.879,临
界值F(0.05,2,2)=19.00,可见Ft>F(0.05,2,2),表明试
验结果差异显著。根据数据处理结果检验各项的显
著性,结果表明6-BA、NAA均对诱导率影响显著,
本试验二者较佳的质量浓度分别为1.0和0mg/L,
即白鹃梅直接再生芽苗诱导培养基无需添加NAA,
只需添加1.0mg/L 6-BA,再生芽苗诱导率即可达
85.7%。
表2 白鹃梅直接再生芽苗诱导培养基
的U5(52)均匀设计试验结果
Table 2 U5(52)uniform design test of media for bud
seedling regeneration of E.racemosa
编 号
Treatment
number
6-BA(X1)/
(mg·L-1)
NAA(X2)/
(mg·L-1)
诱导率(Y)/%
Induction rate
1  0.0  0.1  10.0
2  0.5  0.5  17.7
3  1.0  0.0  85.7
4  1.5  0.3  44.3
5  2.0  0.7  3.3
2.3 白鹃梅再生丛芽生根培养基的筛选
对生长情况一致、健壮的白鹃梅组培苗进行生
根培养,接种35d左右可形成完整的白鹃梅小植
株。组培苗接种后18d开始生根,接种后45d对组
培苗生根外植体数、根数和根长等指标进行统计,计
算生根率、平均根数和平均根长,结果见表3。
表3 1/2MS培养基中植物生长调节剂对白鹃梅生根的影响
Table 3 Influence on rooting effect of different kinds of plant growth regulator combination in 1/2MS culture medium
处理编号
Treatment
number
调节剂
Regulator
质量浓度/
(mg·L-1)
Concentration
生根率/%
Rooting
rate
平均生根数
Average
rooted number
根长/cm
Root length
根生长状态
Root growth situation
1 NAA  0.1  39.15±3.40c 0.83±0.15c 2.75±0.08d 根数量少,细弱 Amount smal and gracility
2 NAA  0.3  70.45±3.21c 3.80±0.21e 5.57±0.07f
根数量较多,主根明显,根粗长
Number of root was more,main roots were signifi-
cant,the length and diameter of roots was long
3 NAA  0.5  49.71±3.86d 1.50±0.27d 3.36±0.04e
根较粗长,生长较慢,数量少
The length and diameter of roots was long,and had
slow growth,amount smal
4 NAA  0.7  33.81±3.88bc 0.70±0.12bc 2.16±0.08c
根粗短,数量较少,生长较慢
The roots were short and thick,amount smal,and
had slow growth
5 IBA  0.1  0a 0a 0a 未见生根 No rooting
6 IBA  0.3  6.45±6.45a 0.07±0.07a 1.94±0.50c 生根极少,根细弱 Rooting rarely,root was thin
7 IBA  0.5  15.00±7.86ab 0.20±0.12b 1.65±0.03b
根数量极少,根细弱,生长缓慢
Rooting rarely,root was thin,nd had slow growth
8 IBA  0.7  12.60±6.31a 0.10±0.05a 2.08±0.06c
根数量极少,根细弱,生长缓慢
Rooting rarely,root was thin,nd had slow growth
9 CK - 0a 0a 0a 未见生根 No rooting
  注:同列数据后标不同小写字母表示经Duncan’s法检验差异极显著(P<0.01)。
Note:Date with different lowercase letters in the same column represent the significante of difference in the P=1%level by Duncan exam-
ine.
261 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第41卷
  由表3可知,未添加植物生长调节剂的处理9
和附加有0.1mg/L IBA的处理5的生根率均为0;
处理5~8均附加了不同质量浓度的IBA,生根率均
低于15%,可见IBA对白鹃梅丛生芽不定根的诱导
作用很小,基本上可以忽略不计。附加了0.3mg/L
NAA的处理2生根率最高,可达70.45%,附加了
不同质量浓度NAA的处理1,3和4对白鹃梅丛生
芽不定根也有一定的诱导作用,其中处理3的生根
率达49.71%,处理1和4的生根率均小于40%,可
见质量浓度0.3mg/L NAA对白鹃梅丛生芽不定
根的生长具有明显的诱导作用,并且 NAA对白鹃
梅丛生芽不定根的诱导作用明显优于IBA。从各处
理的生根状态来看,附加了NAA的试管苗,先在基
部产生愈伤组织然后再生根,而附加了IBA的试管
苗,仅有极少量植株生根,且都是直接从基部生根;
在试验过程中还发现,组培苗生根以后的生长状态
明显优于未生根植株,生根的组培苗植株叶片舒展、
叶色嫩绿、植株健壮,而未生根植株表现为叶片边缘
发黄甚至卷曲,植株低矮。
3 结论与讨论
在植物组织培养过程中,建立无菌外植体、获得
无菌培养材料是试验成功的第一步,外植体消毒时
间的把握则是组培顺利进行的关键一环[8],消毒时
间过短达不到消毒效果,会造成试验材料大量污染,
降低试验效率;消毒时间过长又会伤害植物细胞,甚
至导致试验失败。本试验采用1g/L的 HgCl2 溶
液对白鹃梅嫩茎段进行不同时间消毒处理,结果表
明,白鹃梅嫩茎段在 HgCl2 溶液中消毒8min的灭
菌效果最佳。
  植物组织在离体培养过程中,往往不能自行合
成生长素等内源激素,但其在组织分化与形态建成
等过程中又需要相应激素的调节作用,单纯的培养
基只能维持培养物的最低生理需求[9]。不同植物在
组织培养过程中,对生长调节剂的种类、质量浓度的
需求存在很大差别。有报道指出,植物生长调节物
质互相组合对植物组织分化和器官形成所产生的促
进作用远大于组合中任一种单一的植物生长调节
剂[10]。对于黄连木来说,使用一定质量浓度的
NAA和IBA 组合,可有效促进腋芽的诱导萌发
率[9]。本试验采用不同质量浓度的6-BA和 NAA
组合对白鹃梅的嫩茎段进行再生芽苗的诱导,发现
当6-BA的质量浓度达到1.0mg/L、NAA质量浓
度为0时,能够更好地诱导白鹃梅外植体丛生芽的
再生;当6-BA和NAA组合使用时,再生芽苗的生
根率均低于45%,只有当 NAA的质量浓度极低或
为0时才能使白鹃梅再生芽苗达到显著的生根效
果,表明 NAA不利于白鹃梅再生芽苗的生长与分
化。这说明植物组织或器官的发生对植物生长调节
物质的种类和质量浓度具有差异性选择[11]。这可
能与植物自身的基因型有关,即不同的基因型决定
了植物在组织分化和器官形成过程中所需要的植物
生长调节物质的种类和质量浓度[12]。
培养基中营养成分和糖含量的适当减少可以有
效刺激丛生芽生根,这可能是由于较高质量浓度的
营养元素容易使试管苗产生依赖性而不能生根或使
生根迟缓[13]。本研究在预试验中曾使用 MS作为
基本培养基,发现很难诱导生根,丛生芽出现玻璃化
现象;采用1/2MS作为基本培养基,生根率可达
80%,再生芽苗长势良好。试验中选择IBA 和
NAA 2种生长调节物质分别进行生根试验,结果表
明,IBA和NAA均能在一定程度上促进组培苗的
生根,但需要适宜的质量浓度。用IBA诱导生根,
生根率极低且根细弱;使用NAA诱导生根,外植体
会先在基部产生愈伤组织,然后再生根;NAA 为
0.3mg/L时生根率高达70.45%,根粗壮,且整个植
株生长健壮。而有关药用植物白术组织培养生根的
报道表明,IBA和 NAA都能诱导生根,IBA的诱
导作用明显优于NAA,但质量浓度不宜过高,否则
容易产生畸形根[14]。这说明不同植物组织培养生
根对植物生长调节剂的需求也不同,这一方面可能
与植物在前期培养过程中所用的外源激素不同而导
致内源激素出现差异有关,另一方面也可能是由于
外源生长调节物质超过了培养物本身的适应极限,
进而影响到根的形成与分化[15]。
白鹃梅的组培苗生根能力不强,在没有生长素
诱导的情况下不能生根,并且试验的重复操作性很
差。本试验中,白鹃梅组培苗移栽后成活率极低,相
关研究正在进一步深入开展。
目前,白鹃梅属植物基本上还处于野生状态,人
工繁殖并开发利用的极少。白鹃梅在食用和园林观
赏方面都具有重要的价值,是一种难得的野生植物
资源,至今未见推广应用。本研究结果为白鹃梅的
开发利用和工厂化育苗奠定了基础。
[参考文献]
[1] 戢小梅,陈法志,董艳芳,等.野生白鹃梅繁育技术研究 [J].湖
北农业科学,2011,50(20):4225-4227.
361第5期 戢小梅,等:白鹃梅的离体培养及植株再生试验
Ji X M,Chen F Z,Dong Y F,et al.Breeding research of wild
Exochorda racemosa [J].Hubei Agricultural Sciences,2011,
50(20):4225-4227.(in Chinese)
[2] 裴红宾,杜新民.山野菜白鹃梅营养成分分析 [J].中国野生植
物资源,2003,22(1):49-50.
Pei H B,Du X M.Analysis on the nutrients of mountainous ed-
ible Wild Herb Exochordaracemosa [J].Chinese Wild Plant
Resources,2003,22(1):49-50.(in Chinese)
[3] 张家佳,方成武,谢 地,等.白鹃梅嫩叶及花序中重金属和农
药残留检测 [J].安徽中医学院学报,2011,30(2):65-66.
Zhang J J,Fang C W,Xie D,et al.Determination of heavy met-
als and pesticide residues of tender leaves and inflorescences
fromExochorda racemosa(Lind 1.)Rehd[J].Journal of An-
hui TCM Colege,2011,30(2):65-66.(in Chinese)
[4] 戢小梅,陈法志,董艳芳,等.白鹃梅可食部分营养成分分析
[J].园艺与种苗,2011(4):89-90,107.
Ji X M,Chen F Z,Dong Y F,et al.Nutrient analysis of the edi-
ble part in Exochorda racemosa [J],Horticulture&Seed,2011
(4):89-90,107.(in Chinese)
[5] 赵国建,董周永,杨公明.白鹃梅的开发利用 [J].资源开发与
市场,2004,20(6):456-457.
Zhao G J,Dong Z Y,Yang G M.Utilization and development of
Exochorda acemesa [J].Resource Development & Market,
2004,20(6):456-457.(in Chinese)
[6] 周丽艳,秦子禹,张兴霞.白鹃梅离体快繁技术的研究 [J].安
徽农业科学,2008,36(19):8014-8016.
Zhou L Y,Qing Z Y,Zhang X X.Study on rapid propagation
technique of Exochora racemosa in vitro [J].Anhui Agricul-
tural Sciences,2008,36(19):8014-8016.(in Chinese)
[7] 顾地周,陆 爽,把春影,等.烈香杜鹃的离体培养和高效植株
再生 [J].植物生理学报,2012,48(4):381-385.
Gu D Z,Lu S,Ba C Y,et al.In vitro culture and efficient plant-
let regeneration of Rhododendron anthopogonoides Maxim
[J].Plant Physiology Journal,2012,48(4):381-385.(in Chi-
nese)
[8] 沈海龙.植物组织培养 [M].北京:中国林业出版社,2005.
Shen H L.Plant tissue culture[M].Beijing:Beijing Forestry
Press,2005.(in Chinese)
[9] 何敬房,苏淑钗,冷平生,等.黄连木组培快繁育苗研究 [J].北
京农学院学报,2011,26(3):44-47.
He J F,Su S C,Leng P S,et al.On rapid propagation for tissue
culture seedlings of Pistacia chinensis [J].Journal of Beijing
University of Agriculture,2011,26(3):44-47.(in Chinese)
[10] 高新一,王玉英.植物无性繁殖实用技术 [M].北京:金盾出
版社,2003.
Gao X Y,Wang Y Y.Practical plant asexual reproduction
techniques[M].Beijing:Jindun Publishing House,2003.(in
Chinese)
[11] 顾地周,从小力,姜云天,等.色木槭的组织培养与快速繁殖
[J].植物生理学通讯,2008,44(2):314.
Gu D Z,Cong X L,Jiang Y T,et al.Tissue culture and rapid
propagation of Acer mono Maxim[J].Plant Physiology Jour-
nal,2008,44(2):314.(in Chinese)
[12] 梁钻姬,潘超美,赖珍珍,等.药用植物华泽兰组织培养和快速
繁殖 [J].植物生理学报,2012,48(1):85-89.
Liang Z J,Pan C M,Lai Z Z,et al.Tissue culture and rapid
propagation of medicinal plant Eupatorium chinense L.[J].
Plant Physiology Journal,2012,48(1):85-89.(in Chinese)
[13] 汤桂均,张建安,蒋建平,等.高山杜鹃的组织培养快速繁殖技
术研究 [J].上海农业学报,2004,20(3):15-18.
Tang J J,Zhang J A,Jiang J P,et al.Study on rapid propaga-
tion of Rhododendron lapponicum [J].Acta Agriculturae
Shanghai,2004,20(3):15-18.(in Chinese)
[14] 珠玉球,夏国华,方慧刚,等.白术组培快繁技术 [J].中药材,
2006,29(3):212-213.
Zhu Y Q,Xia G H,Fang H G,et al.Study on tissue culture
and rapid propagation of Atractylodes macrocephala [J].
Journal of Chinese Medicinal Materials,2006,29(3):212-
213.(in Chinese)
[15] 龙 华,胡雪峰,黄衡宇.獐牙菜的组织培养 [J].中草药,
2009,40(3):462-466.
Long H,Hu X F,Huang H Y.Tissue culture of mussoti[J].
Chinese Traditonal Drug,2009,40(3):462-466.(in Chinese)
461 西北农林科技大学学报(自然科学版) 第41卷