全 文 ：第 30卷第 1期
2013年 2月
新疆大学学报(自然科学版)
Journal of Xinjiang University(Natural Science Edition)
Vol.30, No.1
Feb., 2013
利用rDNA ITS序列对新疆桃和普通桃
亲缘关系的分析∗
姜生秀1，兰海燕1†，廖明康2
(1. 新疆大学 生命科学与技术学院，新疆生物资源基因工程重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830046；
2. 新疆农业科学院 园艺所，新疆 乌鲁木齐 830000)
摘 要：对采自新疆地区的4个桃样品的ITS序列进行了PCR扩增、克隆测序和分析，并从基因库中找出6个其
他桃样品的ITS序列，应用DNAMAN软件构建了10个桃样品的系统发育树．结果表明：在系统发育树中，10个
桃样品被分成三个分支，扁桃和野扁桃各自形成独立分支，其它桃样品形成一个分支，其中，新疆桃弧纹核和直
纹核与陕甘山桃亲缘关系为100%，普通桃平行直纹核和孔纹核亲缘关系也为100%，新疆桃与普通桃的亲缘关系
达99%，毛桃、山桃和甘肃桃之间的亲缘关系较近．通过本实验对桃属10种桃样品ITS序列分析初步显示，新疆
桃与普通桃亲缘关系较近，而其与陕甘山桃的亲缘关系更近．
关键词： ITS序列；系统发育树；亲缘关系；新疆桃；普通桃
中图分类号：S662.1 文献标识码：A 文章编号：1000-2839(2013)01-0095-05
Study on the Genetic Relationship between Prunus persica ssp.
ferganensis Kost. et Riab.and P. persica (L.) Batsch by
rDNAITS Sequence
JIANG Sheng-xiu1, LAN Hai-yan1, LIAO Ming-kang2
(1. College of Life Science and Technology，Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic
Engineering，Xinjiang University, Urumqi, Xinjiang 830046, China；2. Institute of Horticultural Crops, Xinjiang
Academy of Agricultural Sciences, Urumqi, Xinjiang 830000, China)
Abstract： The ITS fragments of four peach samples collected from Xinjiang region were amplified by
PCR, and then sequenced and analyzed, combining with ITS sequences of other six peach species (or variety)
found from the GenBank, the phylogenetic tree of ten peach species (or ssp. or var.) was built by DNAMAN
software. The results showed that: the ten peach species (or ssp. or var.) were divided into three branches in
the phylogenetic tree, A. dulcis (Mill) D.A.Webb and A. ledebouriana Schlecht formed their own independent
branch, the other peach species (or ssp. or var.) formed a branch, the phylogenetic relationship among arc-
line of P. persica ssp. ferganensis Kost. et Riab., straight-line of P. persica ssp. ferganensis Kost. et
Riab. and P. davidiana var. Potaninii Rehd was 100%, the relationship between parallel-straight- line of
P. persica (L.) Batsch and hole-line of P. persica (L.) Batsch was also 100%, the relationship of P. persica
ssp. ferganensis Kost. et Riab. and P. persica (L.) was up to 99 %, the relationship among P . persica
(L.) Batsch, P . davidiana (Carr.) Franch and P. kansuensis Rehd. was closer. Above analysis may reach
a preliminary conclusion that Prunus persica ssp. ferganensis Kost. et Riab. and P. persica (L.) Batsch
showed closer genetic relationship, while P. davidiana var. potaninii Rehd. showed much closer relationship
withP. persica ssp. ferganensis Kost. et Riab.
Key words： ITS sequence; phylogenetic tree; genetic relationship; Prunus persica ssp. ferganensis Kost.
et Riab.; P . persica (L.) Batsch
∗收稿日期：2012-10-20
基金项目：新疆生物资源基因工程重点实验室开放基金(XJDX0201-2011-03).
作者简介：姜生秀(1987-)，女，硕士生，研究方向为植物分子生物学．
†通讯作者：兰海燕(1969-)，女，博士，教授，博士生导师，研究方向为植物分子生物学.
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0 引 言
桃(Prunus persica Batsch.)属蔷薇科(Rasaceae)李属(Prunus)桃亚属（Amygdalus）植物，具有极其丰
富的种质资源[1]，全世界桃属植物约有40余种，主要分布在中国西部、西北部至中西亚和地中海地区．桃
品种种类多，在我国野生和栽培的有普通桃、山桃、甘肃桃、陕甘山桃、光核桃和新疆桃6个种，其中，新
疆桃是新疆和中亚的一种特殊桃，除叶脉上的特征外，果核表面的纹路有直纹和弧形纹两种，在桃西传时
间问题的探讨中，考古学家发现在普拉古墓和尼雅出土的桃核中均有少数新疆桃的果核出现[2]，推测新疆
桃应该是普通桃西传至新疆和中亚以后变异形成的新品种．另外，普通桃又有蟠桃、油桃和寿星桃3个变
种，核表面也具不同沟点纹路．基于以上情况，因此有必要对桃品种进行分类鉴定，以免造成品种资源的
混乱，同时也有利于桃种质资源的有效保育．
桃果的形状和核表面的纹路可以做为种和品种群的分类依据，但在品种鉴定方面采用形态学方法具
有局限性，随着分子生物学和生物技术的快速发展使得分子标记技术在物种鉴定方面的应用成为可能．近
年来，对于桃种质资源亲缘关系的研究已经从传统的形态学、细胞学、孢粉学转到分子标记方面，例如，
李莉等[1]人利用RAPD技术对桃的新品种进行了鉴定；郑轶琦等人[3]利用SSR对猕猴桃的品种进行了分析；
王福荣等[4]对桃野生种和地方品种种质资源亲缘关系进行了AFLP分析；孙淑霞等[5]利用ISSR技术进行了
桃品种的鉴定．核糖体DNA的内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer，ITS)序列的进化速度快且片段
长度不大，存在种内多态性，目前已成为在序列水平上探讨科内属间及属下种间关系十分有效的手段[6]．
我们在前期观察中发现，在新疆南疆栽培的新疆桃和普通桃中出现了不同的核纹类型（如图1所示），
拟从分子水平初步鉴定其亲缘关系．本实验采集了新疆地区栽培的新疆桃（2种分别具有直纹和弧形核纹）
和普通桃（2种分别具有直纹和孔形核纹）4个样品，对其18S-28S rDNA中的ITS进行扩增及序列分析，利
用DNAMAN软件将其与基因库中其他6个桃种或变种ITS序列进行比对分析，期望为新疆桃和普通桃品
种的分类鉴定提供理论依据．
1 材料与方法
1.1 材 料
4个桃样品采集地点见表1．各样品核纹图形见图1．取各样品的桃仁用于提取基因组DNA．
表 1 供试材料
样品编号 采集点 品种 核表面纹路
1 新疆扎木台 新疆桃 平行直纹核
2 新疆扎木台 新疆桃 弧形核
3 新疆喀什 普通桃 平行直纹核
4 新疆喀什 普通桃 孔纹核
图 1 采集的4个桃核样品
1.2 桃仁基因组DNA的提取
基于朱振雷等[7]有关大豆种子DNA的提取方法并进行了相应改进[8]．改进后具体步骤如下: 取上述
桃仁1粒，切成薄片并研碎后，称取约30 mg至研钵中，向研钵中加入700 µL 65◦C预热的SDS提取液(100
mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)；25 mmol/L EDTA；2.5% SDS；2.5% NP-40；2.5% Tween-20)，充分研磨后转
第 1期 姜生秀，等：利用rDNA ITS序列对新疆桃和普通桃亲缘关系的分析 97
移至1.5 mL离心管中，65◦C水浴30 min；加700 µL酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），轻轻颠倒充分混匀，静置10
min,12 000 r·min−1离心10 min；取上清，加入600 µL氯仿/异戊醇（24:1）抽提两次，轻轻颠倒充分混匀，静
置10 min,12 000 r·min−1离心10 min；取上清，加入6 µL RNase，以及100 µL 5 mol/L KAc（pH4.8）和700
µL预冷的无水乙醇，静置10 min，12 000 r·min−1离心10 min；弃上清，70%乙醇洗涤沉淀，12 000 r·min−1离
心2 min；放置超净台中吹干，用50 µL TE溶液于65◦C水浴溶解约10 min，随后用1%琼脂糖凝胶电泳检
测DNA质量．
1.3 ITS区片段的PCR扩增
本实验使用核果类果树ITS序列[9]扩增引物，引物序列如下：
P1: 5’- AGG GGA TAA CAA TTT CAC ACA GG -3’
P2: 5’- CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC -3’
PCR反应程序为：(1) 94◦C预变性4 min；(2) 94◦C变性1 min，55◦C退火1 min，72 ◦C延伸2 min，共30个
循环；(3) 最后72◦C保温7 min．PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测．PCR产物用回收试剂盒进行纯化．
1.4 PCR产物的克隆和测序
回收后的PCR产物连接到pMD18-T载体中，转化至大肠杆菌DH5α后进行转化菌株及重组质粒的鉴
定，将4个桃样品经PCR鉴定18S rDNA-28S rDNA的间隔序列的阳性克隆各2个送上海生工生物公司测序．
1.5 序列分析
测序结果登陆NCBI，通过Blast 2.0软件与GenBank中已知序列比对；利用DNAMAN软件构建系统发
育树图，用DNAMAN软件中的Kimura双参数法计算10个桃种（亚种，变种）的遗传距离．
2 结果与分析
2.1 4个样品18S-28S rDNA的ITS片段扩增及序
列分析
由图2可知，以提取的桃仁基因组DNA为模板，
以核果类果树ITS序列通用引物进行扩增，4个样品
均获得了一条单一且清晰的PCR条带，扩增产物长
度约750 bp，与预计片段大小相符．

M D˖NAߚᄤ䞣ᷛޚ DL2000 -˗ 䰈˖ᗻᇍ✻ 1˗. ᮄ⭚ḗ(ᑇ㸠Ⳉ㒍) 2˗. ᮄ
⭚ḗ(ᓻᔶ㒍)˗3. ᱂䗮ḗ(ᑇ㸠Ⳉ㒍)˗4. ᱂䗮ḗ(ᄨ㒍).
M - 1 2 3 4
750bp
图 2 四个桃样品rDNA-ITS的PCR扩增结果
通过对以上4种PCR产物进行测序，并从基因库中找到与本研究样品关系较近的其他6个桃种或变种
的ITS序列进行比较，如表2所示，10个桃样品的完整ITS序列长度范围为655 bp-724 bp，长度变异较小，
普通桃和新疆桃的G+C含量相差不大，普通桃孔纹核的G+C含量最高，甘肃桃和野扁桃G+C含量最低．
表 2 10个桃品种（亚种或变种）ITS(含5.8S rDNA)序列长度及G+C含量
样品 A (%) C (%) G (%) T (%) 全长（bp） G+C(%)
1 18.8 29.4 30.9 20.9 724 60.3
2 18.5 31.1 29.6 20.9 724 60.7
3 18.8 31.1 29.4 20.7 724 60.5
4 18.1 30.8 30.0 21.0 723 60.8
5 18.9 31.0 29.3 20.7 723 60.3
6 19.5 30.8 28.5 21.2 723 59.3
7 18.9 30.5 28.9 21.7 655 59.4
8 18.8 31.0 29.4 20.8 725 60.4
9 19.3 30.8 28.7 21.2 721 59.5
10 19.5 30.7 28.6 21.2 723 59.3
注*：样品编号: 1. 新疆桃(平行直纹核) (P. persica ssp. ferganensis Kost. et Riab.)；2. 新疆桃(弧形核) (P. persica
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ssp. ferganensis Kost. et Riab.); 3. 普通桃(平行直纹核)[P. persica (L.) Batsch]；4. 普通桃(孔纹核)[P. persica (L.)
Batsch]；5. 毛桃[P. persica (L.) Batsch]；6. 甘肃桃(P. kansuens Rehd.)；7. 扁桃[A. dulcis (Mill) D.A.Webb]；8. 陕甘
山桃(P. davidiana var. potaninii Rehd.)；9. 山桃[P. davidiana (Carr.) Franch]；10. 野扁桃(A. ledebouriana Schlecht).
2.2 系统发育分析
利用DNAMAN软件构建了10个桃种（亚种，变种）的系统发育树(图3)．由图3可以看出，10个桃样品
被分成三个分支，扁桃和野扁桃各自形成独立分支，其它桃样品形成一个分支，其中，新疆桃弧纹核和直
纹核与陕甘山桃亲缘关系为100%，普通桃平行直纹核和孔纹核亲缘关系也为100%，新疆桃与普通桃的亲
缘关系达99%，毛桃、山桃和甘肃桃之间的亲缘关系较近．

ᮄ⭚ḗⳈ㒍Ḍ

ᮄ⭚ḗᓻ㒍Ḍ
䰩⫬ቅḗ

᱂䗮ḗⳈ㒍Ḍ
᱂䗮ḗᄨ㒍Ḍ

↯ḗ

ቅḗ

⫬㙗ḗ

᠕ḗ
䞢᠕ḗ
N1
N8
N2
N15
N16
N5
N9
N7
N6
N10
100%
100%
100%
99%
99%
99%
99%
98%
97%
100% 95%
图 3 基于10个桃品种ITS序列构建的进化树
2.3 ITS序列相似性分析
用DNAMAN软件中的Kimura 双参数法计算10个桃样品的遗传距离（表3），这些样品间的同源性均
很高，达到95%以上，遗传分化距离变异范围为0.000∼0.038，新疆桃平行直纹核和新疆桃弧形核遗传距离
为0.003，普通桃平行直纹核和孔纹核之间的遗传距离为0.006．
表 3 10个桃样品之间的相似度和遗传距离ITS(含5.8S rDNA)序列长度及G+C含量
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 - 99.7% 99.9% 99.6% 99.0% 98.9% 98.9% 99.9% 99.0% 97.2%
2 0.003 - 99.6% 99.3% 98.8% 98.6% 98.8% 99.6% 98.8% 97.2%
3 0.001 0.004 - 99.4% 99.2% 98.7% 98.8% 100% 98.9% 97.2%
4 0.004 0.007 0.006 - 98.6% 98.5% 98.5% 99.4% 98.6% 96.8%
5 0.010 0.012 0.008 0.014 - 98.1% 97.8% 99.2% 98.1% 96.2%
6 0.011 0.014 0.013 0.015 0.019 - 98.2% 98.7% 98.2% 96.4%
7 0.011 0.012 0.012 0.013 0.022 0.018 - 98.8% 98.5% 96.5%
8 0.001 0.004 0.000 0.006 0.008 0.013 0.012 - 98.9% 97.1%
9 0.010 0.012 0.011 0.014 0.019 0.018 0.015 0.011 - 96.5%
10 0.028 0.028 0.029 0.032 0.038 0.036 0.035 0.029 0.035 -
注*1. 新疆桃(平行直纹核) (P. persica ssp. ferganensis Kost. et Riab.)；2. 新疆桃(弧形核) (P. persica ssp.
ferganensis Kost. et Riab.); 3. 普通桃(平行直纹核)[P. persica (L.) Batsch]；4. 普通桃(孔纹核)[P. persica (L.)
Batsch]；5. 毛桃[ P. persica (L.) Batsch]；6. 甘肃桃(P. kansuens Rehd.)；7. 扁桃[A. dulcis (Mill) D.A.Webb]；8.
陕甘山桃(P. davidiana var. potaninii Rehd.)；9. 山桃[P. davidiana (Carr.) Franch]；10. 野扁桃(A. ledebouriana
Schlecht). “-”上面为同源性，下面为遗传距离
第 1期 姜生秀，等：利用rDNA ITS序列对新疆桃和普通桃亲缘关系的分析 99
3 讨 论
新疆桃产于我国新疆并一直做为地方品种栽培，本种形态近似普通桃，有关新疆桃是普通桃变异后形
成的新种的证据在分子生物学层面有分歧[4]，杨英军等[10]对常见桃属植物RAPD多态性及亲缘关系的分
析中认为新疆桃是普通桃的变种，而Quarta等[11]的RAPD分析则认为新疆桃是与普通桃亲缘关系很近的
种，郭振怀等[12]通过对桃属植物中的甘肃桃、山桃、新疆桃、普通桃种间的染色体核型及其亲缘演化关系
分析的结果也表明新疆桃和普通桃亲缘关系相近．真核生物的rDNA成簇排列在一起，由18S rDNA、5.8S
rDNA和28S rDNA组成一个转录单位，彼此被转录单元内间隔区ITS分开．rDNA及ITS区目前被广泛用
作研究系统发育、进化及分类鉴定的分子指标，特别是ITS区，因它在进化速率上较核糖体大小亚基的保
守区快，可以提供比较丰富的信息，因此近几年来常被用作许多生物属下种间水平上分类鉴定的分子指
标[13]．本实验基于rDNA ITS序列对新疆桃、普通桃及其他6个桃种或变种亲缘关系的分析结果显示：新
疆桃和普通桃亲缘关系达99%，初步显示新疆桃是普通桃的近缘种，细分则新疆桃弧形核和直纹核与陕甘
山桃在同一个分支，普通桃直纹核和孔纹核在同一分支，虽然新疆桃平行直纹核与普通桃平行直纹核的
核表面纹路相似，新疆桃平行直纹核和弧形核表面纹路不同，但前两者的亲缘关系却没有后两者的亲缘
关系高，普通桃直纹核和孔纹核也属于这种情况，由此显示，依据某一个局部的形态指标也许不能全面
反映一个物种的特性，因为形态指标进行植物分类易受环境影响，而在此基础上借助分子标记技术可以
在大范围内对高等生物的遗传物质进行较全面的比较，从而提高植物分类的准确性和可靠性[14]．从基因
库中找出的6个桃品种中，野扁桃构成一单系分支，位于系统发育树的基部，毛桃、山桃和甘肃桃亲缘关
系较近，这一结果与刘艳玲[9]等基于ITS序列探讨核果类果树桃、李、杏、梅、樱的系统发育关系中桃属
的分类地位一致．本研究表明，新疆桃弧形核和直纹核以及普通桃直纹核和孔纹核rDNA ITS序列高度一
致，同源性极高，要进一步鉴别其亲缘关系还有待其它深入研究证明．
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责任编辑：周 蓉