全 文 ：2002-12-09收到 , 2003-06-27 接受。
国家重点基础研究专项经费(G1999011700)、国家自然科学基金
(39870526)和教育部骨干教师资助计划资助。
＊现工作单位:天津市园艺工程研究所 , 300192。
＊＊通讯作者(E-mail:dqli@sdau.edu.cn)。
西府海棠(Malus micromalus)MaMAPK 基因的克隆及表达特性
彭立新1＊　郑成超2　李德全2＊＊　谷令坤2　束怀瑞1
(山东农业大学 1 园艺学院 , 2 生命科学学院 ,泰安 271018)
摘要:依据高等植物 MAPK 基因的保守区设计简并
引物 ,用 RT-PCR方法 , 首次从西府海棠幼苗叶片中克
隆了促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activa ted pro tein
kinase, MAPK)基因(MaMAPK)的 cDNA 全序列。
Southern 杂交结果表明在西府海棠中存在一个小的
MAPK 基因家族。 20%PEG 处理西府海棠幼苗不同
时间后的 Northern 杂交分析表明 , 该基因在根系和叶
片中均有表达 ,随着胁迫时间延长表达量增加 , 说明西
府海棠 MaMAPK 基因在转录水平上受水分胁迫诱导
表达。
关键词:西府海棠;MAPK;cDNA;表达特性
中图分类号:Q74
　　植物感受干旱 、高盐及低温后 ,这些胁迫信号
经历一系列传递过程 ,最后诱导特定功能基因的表
达 ,在生理上作出调节反应。研究表明 ,蛋白激酶
通过磷酸化与去磷酸化 ,在信号传递过程中起着重
要作用(S tone 和 Walker 1995)。胁迫信号的传递
过程是一个立体网络 , 促分裂原活化蛋白激酶
(MAPK)级联反应途径位于网络的中心 ,通过磷酸
化与去磷酸化将多种胁迫信号逐级放大 、传递 ,从
而调控基因表达。Mizoguchi 等(1998)研究证明 ,
植物细胞中存在 MAPK 级联途径 ,该途径由 MAP-
KKK(ATMEKK1)※MAPKK(MEK1)※ MAPK
(ATMPK4)组成。位于级联途径下游的 MAPK 是
普遍存在于真核生物中的一类保守的丝氨酸/苏氨
酸类蛋白激酶 ,受其上游组分激活 ,发生磷酸化与
去磷酸化作用 ,将多种胁迫信号进行传递。大量研
究表明 , MAPK 基因的表达受各种环境因子(如干
旱 、高盐 、低温 、创伤 、活性氧 、病原菌等)的诱导
(Mizoguchi等 1993 , 1996;Kiegerl等 2000;Yang 等
2001;Zhang 和 Klessig 2001;Xiong 等 2002;Morris
2001)。
苹果是重要的经济作物 ,为了提高抗性 ,常需
嫁接后栽培。海棠类作为砧木 ,根系发达 ,受土壤
水分影响较大 ,水分胁迫严重影响其生长和产量 。
研究表明 ,苹果在水分胁迫下 ,伴随有蛋白质的磷
酸化与去磷酸化过程(杨洪强等2001),说明有蛋白
激酶基因调控苹果对水分胁迫的适应性反应 。为
了研究苹果在水分胁迫下 ,蛋白激酶基因的表达特
性及其调控机制 ,我们从 20%PEG 处理的西府海
棠叶片中克隆了 MaMAPK 基因的 cDNA全序列 ,
并进行了序列分析。通过 Southern杂交初步确定
在西府海棠中存在一个小的 MAPK 基因家族 ,
MaMAPK 基因在西府海棠基因组中是低拷贝的。
Northern杂交分析表明 ,水分胁迫诱导 MaMAPK
基因表达 ,随着胁迫时间延长表达量增加 。因此推
测在水分胁迫下 , MaMAPK 基因的表达产物
MAPK参与了西府海棠体内的磷酸化与去磷酸化
过程 ,MAPK可能作为信号组分调控西府海棠对干
旱的适应性反应。
1　材料与方法
1.1　材料
西府海棠(Malus m icromalus Makino)幼苗培
养至 6片真叶时 ,将其从基质中取出洗净 ,用 20%
的 PEG-6000 处理 0 、30 、60 、90 min后取幼叶和幼
根 ,用液氮冷冻 ,保存于-80℃超低温冰箱备用 。
1.2　促分裂原活化蛋白激酶基因的 cDNA克隆
取 PEG 处理 90 min 的西府海棠叶片 , 用
CTAB法(王官林和方洪筠 1998)提取叶片总
RNA , RNA用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1 , V/ V/ V)萃
取 ,用乙醇沉淀 。用 M-MLV 反转录酶(Promega)
合成 cDNA 。比较7种植物促分裂原活化蛋白激酶
基因编码的氨基酸序列的保守区 ,设计一对简并引
物 , P1:5′-gg(act)gc(act)ta(ct)gg(agc)at(act)gt
(agct)tg-3′, P2:5′-g t(agct)ac(agct)ac(ag)ta(ct)tc
(agct)gtc at-3′。利用 RT-PCR反应扩增促分裂原
活化蛋白激酶基因 cDNA 的中间片段;根据中间片
段设计特异引物 P3:5′-tgg tct tgc cag gac aac at-3′
与通用引物 B26(上海生工生物工程技术服务有限
公司)扩增该基因的 3′端 cDNA 序列;根据中间片
段设计特异引物 P4:5′-tct gat g aa gat cag tgt cca t-
431植物生理与分子生物学学报 , Journal of Plant Physiology and Molecular Biology　2003 , 29(5):431-436
3′与通用引物 AAP(上海生工)扩增该基因的 5′端
cDNA序列 。根据中间片段 、3′端和 5′端的 cDNA
序列 ,分别设计特异引物 P5:5′- tag cgg atc cgt tgg
aag tt t gga aat g gc tgc c-3′和 P6:5′- t ta caa cgg tgg
tgg g tg ata gtc -3′,扩增该基因的 cDNA 全序列 。
RT-PCR反应产物从琼脂糖凝胶上回收后 ,克隆进
pGEM-T 载体 ,转化大肠杆菌 DH5α,提取质粒后由
上海生工测序。
1.3　DNA的提取和 Southern杂交
用CTAB法提取西府海棠叶片基因组 DNA 。
用 3种限制性内切酶(EcoR Ⅰ 、Sal Ⅰ 、Xba Ⅰ)分
别消化 10μg 基因组 DNA ,分别以 MaMAPK 的中
间片段和 3′端的 RT-PCR产物为探针进行 South-
ern杂交 。探针标记 、杂交 、放射性自显影等方法参
照颜子颖和王海林(1995)。
1.4　RNA的提取和 Northern杂交
用 CTAB 法提取叶片和根系总 RNA 。RNA
(20μg)在甲醛变性胶上电泳分离后转至尼龙膜
上 , 80℃烘膜 2 h ,固定 RNA。以 MaMAPK 3′端的
RT-PCR产物为探针进行 Northern杂交。探针标
记 、杂交 、放射性自显影等方法同 Southern杂交。
2　结果
2.1　MaMAPK 的 cDNA序列
依据高等植物 MAPK 基因的保守区设计简并
引物 ,用 RT-PCR方法 ,首次从西府海棠叶片中克隆
了 MAPK 基因的 cDNA全序列 ,同源性分析发现其
与苜蓿(Medicago sativa)促分裂原活化蛋白激酶基
因(MMK 4 ,X82270)同源性最高 ,在核苷酸和氨基酸
水平上的一致性分别为 81%和 82%。该基因定名
为 MaMAPK ,在 GenBank 的注册号为 AF435805。
MaMAPK 的 cDNA全长 1 540 bp ,编码 417 个氨基
酸。应用 DNAman 软件将 MaMAPK 编码的氨基
酸序列与 4 种植 物 MAPK 的氨 基酸序 列
比较如图1所示 。在MaMAPK编码的氨基酸序列
图 1　五种植物促分裂原活化蛋白激酶基因的氨基酸序列比较
Fig.1　 Alignment of predicted amino acid sequences of MAPKs from Malus micromalus (AF435805 , MaMAPK), Medicago
sativa (X82270 ,Mmk4), Arabidopsis thaliana (D21839 , Atmpk3), Nicotiana tabacum (D61377 , Wipk), Triticum aestivum
(AF079318 , Wck-1)
Amino acids are shown in the single letter code.Identical amino acids are show n in black.Numbers in RomanⅠ to Ⅺ represent
eleven conserved cataly sis domain.“ TEY” represents threonine and tyrosine phosphory lation site.
432 植物生理与分子生物学学报　　　　　　　　　　　　　　　　　　29 卷
中 ,具有 11个保守的蛋白激酶催化结构域 ,在催化
核心的第 Ⅶ 和第 Ⅷ结构域间 ,有一个“TEY”苏氨酸
和酪氨酸磷酸化位点 ,这是 MAPK激活所必需的 ,
是MAPK 的典型特征(Jonak 等1999)。因此 ,本研
究所克隆的 cDNA 序列为西府海棠的促分裂原活
化蛋白激酶基因(MaMAPK)的 cDNA全序列。
　　20种植物 MAPK 序列系统发生分析表明 ,植
物 MAPK 可分为 3 ～ 4 个组(Jonak 等 1999)(图
2)。虽然每组成员的功能并不完全清楚 ,但是根据
现有研究发现 ,不同组间功能有所不同 。第 1和第
2组成员主要参与了病原菌和非生物胁迫信号传
递过程;第 3组成员主要参与了衰老 、低温及其它
信号传递过程;第 4组成员可能参与了成熟及细胞
周期调控的信号传递过程 ,第 3和第 4也可以归为
一类。另一方面 ,在同一组中不同物种的 MAPK
序列同源性较高 ,说明在系统进化上亲源关系较接
近。
图 2 　植物 MAPKs 的系统发生分析
Fig.2　 Phylogenetic analysis of plant MAPKs
A tmpk3 , Atmpk4 , Atmpk5 , At4g , F9k21 from Arabidopsis
thaliana.MaMAPK from Malus micromalus.M k1 from
Capsicum annuum.Mmk2 , Mmk4 from Medicago sativa .
Ntf4 , NtSIPK , Wipk from Nicotiana tabacum.Bimk1 ,
Mapk2 , Mapk4 , OsMEK1 from Oryza sativa.Mapk3 from
Pisum sativa.Mapk from Prunus armeniaca.Wck-1 from
Triticum aestivum .ZmMPK5 from Zea mays.
2.2　MaMAPK 的基因家族
以 MaMAPK 基因的 3′端的 RT-PCR产物为
探针 ,与基因组 DNA EcoR Ⅰ 、Sal Ⅰ 、Xba Ⅰ酶切
片段进行 Southern 杂交 ,结果显示 , 用 EcoR Ⅰ和
SalⅠ酶切的 DNA 中均有 5条杂交带 ,而 Xba Ⅰ酶
切的 DNA中有 6条杂交带(图 3A)。DNAClub软
件分析 ,在 MaMAPK 的 cDNA 序列中约 1 300 bp
处含有一个 Xba Ⅰ酶切位点 ,没有 EcoR Ⅰ和 Sal
Ⅰ酶切位点。由于 3′端的 cDNA 杂交探针涵盖了
一部分(约 680 bp)编码区 ,说明该探针的特异性并
不强 ,因此 ,我们又以 MaMAPK 中间片段的 RT-
PCR产物为探针 ,分别与基因组 DNA 相同酶切片
段进行 Southern杂交(图 3B),发现两个杂交结果
中有相同的杂交带(图 3A中箭头所示)。由于中间
片段保守性很强(见图 1划横线处),我们推断在西
府海棠中存在一个小的 MAPK 基因家族 ,至少有
4个家族成员;MaMAPK 基因在西府海棠基因组
中是低拷贝的 。
图 3 　西府海棠 MaMAPK 基因的 Southern分析
Fig.3　Southern blotting analy sis of M.micromalus genomic
Lane 1:DNA was digested by EcoRⅠ ;Lane 2:DNA was di-
gested by SalⅠ ;Lane 3:DNA was digested by XbaⅠ .
A.The 3′end RT-PCR product w as used as probe.B.The
middle fragment RT-PCR product was used as probe.
2.3　MaMAPK 基因的表达特性
用 20%PEG 处理不同时间后 ,对 MaMAPK
在叶片和根系中的表达进行 Northern 分析(图 4),
结果表明 , MaMAPK 在根系和叶片中均有表达 ,随
着处理时间延长 ,表达量逐渐增加 ,以处理 90 min表
达量为最大;处理时间相同的情况下 ,根系中表达量
大于叶片;MaMAPK 在水分胁迫下表达量的增加
是对照的3 ～ 4倍 。说明西府海棠MaMAPK基因
4335 期　　　　　　　　 　彭立新等:西府海棠(Malus micromalus)MaMAPK 基因的克隆及表达特性
图 4　20%PEG处理不同时间后 MaMAPK 基因在西府海棠叶片和根系中的表达
Fig.4　 Northern blo ts of MaMAPK expression of M.micromalus in roo ts and leaves under 20%PEG in different time
A:Northern blots o f MaMAPK in leaves under 20%PEG in different time;B:Northern blo ts of MaMAPK in roots under 20%PEG
in different time.1:0 min;2:30 min;3:60 min;4:90 min.
在转录水平上受水分胁迫诱导表达 ,对照在根系中
具有微量的表达 。
3　讨论
水分是影响植物生长发育和产量的重要环境
因子。水分亏缺时 ,在植物体内引起一系列复杂的
分子反应 、基因表达及生理生化变化(Urao 等
1999)。植物如何感受逆境信号 ,传导逆境刺激 ,激
活一系列分子途径 ,并调控相关基因表达和生理反
应 ,以适应逆境 ,在逆境中获得抗性 ,即植物细胞的
信号转导问题 ,已成为现代生物学研究的热点 。因
此 ,研究植物在水分胁迫下与逆境信号转导密切相
关的蛋白激酶基因的表达特性及其所调控的信号
转导过程 ,对于揭示植物耐旱的分子机制具有重要
意义 。
　　本研究报道了西府海棠 MaMAPK 基因 cD-
NA全长 1 540 bp ,编码 417个氨基酸 ,将其氨基酸
序列与苜蓿 、拟南芥 、烟草和小麦 MAPK cDNA 编
码区的氨 基酸序列进行 同源性 比较 , 发 现
MaMAPK 的 11个保守的催化结构域及“TEY”与
其它 4种植物完全吻合(图 1),表明 MAPK 基因家
族具有较高的保守性 。这与 Ichimura 等(2002)的
报告是一致的。因此 ,所克隆的 MaMAPK 确实为
MAPK 基因家族的成员。
本研究中对 MAPK 序列系统发生分析表明 ,
植物 MAPK 可分为 3 ～ 4个组(图 2),由于我们所
选用的 20种植物的 MAPK 均为“TEY”类型 ,这与
Ichimura 等(2002)的报告不完全一致 ,因为他们的
分类中包含了“ TDY”类型。
大量研究证明 MAPKs是一个多基因家族 ,在
拟南芥中已克隆了 24 个 MAPK 基因(Mundy 等
2002)。本研究以保守的中间片段的 RT-PCR产物
为探针 , Southern杂交结果显示 ,在西府海棠中存
在 1个 MAPK 基因家族 ,该家族有 4个成员。关
于该基因家族的其它成员及功能尚待研究 。
我们的研究结果显示 , 在未处理的根系中
MaMAPK 基因具有微量的杂交信号 ,这有两种可
能:一是 MaMAPK 基因在根系中具有微量的组成
型表达 ,二是 MaMAPK 基因家族的其它成员与探
针杂交的结果 。
MaMAPK 基因在水分胁迫下表达量增加 ,我
们还发现在水分胁迫下与海棠类耐旱性相关的抗
氧化酶类活性也随之增加(待发表资料), 说明
MaMAPK 的表达量与海棠类耐旱性 、抗氧化能力
呈正相关;在干旱胁迫信号转导过程中 , MaMAPK
通过磷酸化与去磷酸化作用一方面传递 、放大干旱
信号 ,另一方面 ,可能通过某条信号途径传递活性
氧信号 ,调节抗氧化酶类活性 ,从而影响植物的耐
旱性。Mizoguchi 等(1993)研究发现 ,从拟南芥中
克隆的 ATMPK 3所编码的 MAPK ,不仅在蛋白质
水平上受到磷酸化与去磷酸化的调控 ,在转录水平
上也受到环境胁迫信号的诱导调控 ,在干旱 、高盐
或低温处理条件下 , 5 min 内被诱导表达 ,1 h内显
著增强 , 随后表达持续增加 , 24 h 后达高峰。
MaMAPK 基因是否在蛋白质水平上通过磷酸化
与去磷酸化对 MAPK 进行调控 ,调节功能如何 ,除
434 植物生理与分子生物学学报　　　　　　　　　　　　　　　　　　29 卷
了水分胁 迫 , 其它环境 胁迫信号 是否诱 导
MaMAPK 基因表达等有待进一步研究。
参 考 文 献
王官林 , 方洪筠编著(1998).植物基因工程原理与技术.北
京:科学出版社 , 1-364
颜子颖 ,王海林译(1995).Ausubel FM 等编著.分子生物学
手册.第 3 版.北京:科学出版社 , 55-56
杨洪强 , 贾文锁 , 黄丛林 , 张大鹏(2001).蛋白磷酸化参与
湖北海棠根系中水分胁迫诱导的 ABA 积累.科学通
报 , 46(1):50-53
Ichimura K , Shinozaki K , Tena G , Sheen J ,Henry Y , Champi-
on A , Keris M , Zhang S , Hirt H , Wilson C et al.
(2002).Mito gen-activated protein kinase cascades in
plants:a new nomenclature.Trends Plant Sci , 7(7):
301-308
Jonak C , Ligterink W , Hirt H(1999).MAP kinases in plant
signal transduction.CMLS Cell Mol L ife Sci , 55:204-
213
K iegerl S , Cardinale F , Siligan C , Gross A , Baudouin E , Li-
wosz A , Eklof S , Till S , Bogre L , Hirt H , Meskiene I
(2000).SIMKK , a mitogen-activa ted protein kinase
(MAPK)kinase , is a specific activ ator of the salt stress-
induced MAPK , SIMK.Plant Cell , 12:2247-2258
M izoguchi T , Hayashida N , Yamaguchi-Shinozaki K , Kamada
H , Shinosaki K(1993).ATMPKs:a gene family of plant
MAP kinases in Arabidopsis thaliana .FEBS Lett , 336:
440-444
M izoguchi T , Irie K , Hirayama T , Hayashida N , Yamaguchi-
Shinozaki K , Matsumo to K , Shinosaki K(1996).A gene
encoding a mitog en-activ ated protein kinases and an S6 ri-
bosomal protein kinases by touch , cold , and w ater stress
in Arabidopsis thaliana.Proc Natl Acad Sci US A , 93:
765-769
M izoguchi T , I chimura K , I rie K , Morris P , Girauda t J ,
Matsumoto K , Shinosaki K (1998).Identification of a
possible MAP kinase cascade of Arabidopsis thaliana
based on pairwise yeast tw o-hybrid analysis and functional
complementation tests of yeast mutants.FEBS Lett , 437:
56-60
Morris PC(2001).MAP kinase signal transduction pathways
in plants.New Phy tol , 151:67-89
Mundy J , Schneitz K (2002).Pro tein phosphorylation in and
around signal transduction.Trends Plant Sci , 7(2):54-
55
Stone JM , Walker JC (1995).Plant pro tein kinase families
and signal transduction.Plant Physiol , 108:451-457
Urao T , Yakubov B , Satoh R , Yamaguchi-Shinozaki K , Seki
M , Hirayama T , Shinosaki K (1999).A transmember
hybrid-type histidine kinase in Arabidopsis function as an
osmosenso r.Plant Cell , 11:1743-1754
Xiong L , Schumaker KS , Zhu JK(2002).Cell signaling dur-
ing cold , drought , and salt stress.Plant Cell , 14:S165
-S183
Yang KY , Liu Y , Zhang S(2001).Activation of a mitogen-ac-
tivated pro tein kinase pathway is involved in disease resis-
tance in tobacco.Proc Natl Acad Sci US A , 98:741 -
746
Zhang S , Klessig DF (2001).MAPK cascades in plant de-
fense signaling.Trends Plant Sci , 6:520-527
4355 期　　　　　　　　 　彭立新等:西府海棠(Malus micromalus)MaMAPK 基因的克隆及表达特性
Cloning and Expression Characteristics of MaMAPK Gene of Malus
micromalus
PENG Li-Xin 1 , ZHENG Cheng-Chao 2 , LI De-Quan 2＊ , GU Ling-Kun 2 , SHU Huai-Rui 1
(1College of Hort icu lture , 2Col lege o f Li fe S ciences , Shandong Ag ricu ltural University , Taian 271018)
Abstract:A full cDNA sequence of MAPK
(mitogen-activated protein kinase) gene was
cloned from Malus micromalus seedling leaves
by RT-PCR.It w as named MaMAPK , and
the accession number in GenBank was
AF435805.It w as about 1.5 kb long and en-
coded 417 amino acid.There were eleven con-
served subdomains and phosphorylation site
“TEY” in the cDNA sequence , which is the
typical characteristics of MAPK family (Fig.
1).Sequence alignment suggests that it has
the highest homology w ith alfalfa (Medicago
sativa) MMK 4 gene(X82270).It shares
81%and 82% identity in nucleotide and amino
acid w ith alfalfa , respectively.Results of
Southern blotting suggest that there is a small
gene family and MaMAPK gene may be small
copies in genomic DNA of M.micromalus
(Fig.3).Northern blotting result showed that
MaMAPK gene could be expressed in roots
and leaves of MAPK of four members in M.
micromalus af ter being treat w ith 20% PEG
for different time (Fig.4).The expression
level in roots w as higher than that of in leaves.
There was slender expression both in roots and
leaves.These results indicate that the expres-
sion of MaMAPK gene is induced by water
stress.
Key words:Malus micromalus;MAPK;cDNA;expression
characteristics
＊Corresponding author(E-mail:dqli@sdau.edu.cn).
436 Journal of Plant Physiology and Molecular Biology　2003 , 29(5):431-436