全 文 ：第３６卷第３期
２　０　１　５年５月
西 安 交 通 大 学 学 报 （医 学 版 ）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｘｉａｎ　Ｊｉａｏｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）
Ｖｏｌ．３６　Ｎｏ．３
Ｍａｙ　２０１５
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｄｙｘｂ．ｃｎ；ｈｔｔｐ：／／ｙｘｘｂ．ｘｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
◇中医药研究◇
蜂斗菜素诱导骨髓瘤ＲＰＭＩ　８２２６细胞凋亡及其机制
岳海源１，任冬青２，王东萍３，雷栓虎１，齐　进１，汪玉良１
（１．兰州大学第二医院骨科，甘肃省骨关节疾病重点实验室，甘肃兰州　７３００３０；
２．甘肃省人民医院麻醉科，甘肃兰州　７３００００；３．甘肃省人民医院血液科，甘肃兰州　７３００００）
摘要：目的　观察蜂斗菜素对骨髓瘤ＲＰＭＩ　８２２６细胞凋亡的影响，并探讨其作用机制。方法　采用锥虫蓝拒染法检
测蜂斗菜素对ＲＰＭＩ　８２２６细胞的增殖抑制作用，ＴＵＮＥＬ法检测蜂斗菜素诱导的 ＲＰＭＩＳ２２６细胞凋亡，Ｈｏｃｈｅｓｔ
３３２５８荧光染色法观察细胞核的变化，Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ技术检测Ｃａｓｐａｓｅ－３、８、９蛋白表达和 ＭＥＫ／ＥＲＫ、ｐ３８ＭＡＰＫ蛋白
磷酸化水平。结果　蜂斗菜素作用２４、４８、７２ｈ后对骨髓瘤ＲＰＭＩ　８２２６细胞均有显著的增殖抑制作用（Ｐ均＜０．０１）；
蜂斗菜素呈时间和浓度依赖地诱导骨髓瘤ＲＰＭＩ　８２２６细胞凋亡（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０５），Ｃａｓｐａｓｅ抑制剂预处理可明显
抑制细胞凋亡；蜂斗菜素作用７２ｈ后，Ｃａｓｐａｓｅ－３、８、９蛋白表达显著增加（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．０５），ＥＲＫ１／２及
ＭＥＫ蛋白磷酸化水平显著下降（Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．０５），ｐ３８ＭＡＰＫ蛋白磷酸化水平显著上升（Ｐ＜０．０１）。结论　蜂斗
菜素能够抑制骨髓瘤ＲＰＭＩ　８２２６细胞增殖，诱导细胞凋亡，其机制可能与Ｃａｓｐａｓｅ－３、８、９蛋白激活，ＥＲＫ／ＭＥＫ及
ｐ３８ＭＡＰＫ蛋白磷酸化改变有关。
关键词：蜂斗菜素；骨髓瘤；凋亡；Ｃａｓｐａｓｅ；ＥＲＫ／ＭＥＫ；ｐ３８ＭＡＰＫ
中图分类号：Ｒ７３３．３　　　文献标志码：Ａ
ＤＯＩ：１０．７６５２／ｊｄｙｘｂ２０１５０３０２２
Ｐｅｔａｓｉｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｍｙｅｌｏｍａ　ＲＰＭＩ　８２２６ｃｅｌｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ
ＹＵＥ　Ｈａｉ－ｙｕａｎ１，ＲＥＮ　Ｄｏｎｇ－ｑｉｎ２，ＷＡＮＧ　Ｄｏｎｇ－ｐｉｎｇ３，ＬＥＩ　Ｓｈｕａｎ－ｈｕ１，ＱＩ　Ｊｉｎ１，ＷＡＮＧ　Ｙｕ－ｌｉａｎｇ１
（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ，ｔｈｅ　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｌａｎｚｈｏｕ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／
Ｔｈｅ　Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｇａｎｓｕ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｌａｎｚｈｏｕ　７３００３０；
２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ａｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙ，Ｇａｎｓｕ　Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　Ｐｅｏｐｌｅｓ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｌａｎｚｈｏｕ　７３００００；
３．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｇａｎｓｕ　Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　Ｐｅｏｐｌｅｓ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｌａｎｚｈｏｕ　７３００００，Ｃｈｉｎａ）
ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｐｅｔａｓｉｎ　ｏｎ　ｍｙｅｌｏｍａ　ＲＰＭＩ　８２２６　ｃｅｌｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ
ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｅｔａｓｉｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｙｅｌｏｍａ　ＲＰＭＩ　８２２６　ｃｅｌｓ　ｗａｓ　ｔｅｓｔｅｄ　ｂｙ
ｔｒｙｐａｎ　ｂｌｕｅ　ａｓｓａｙ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ＲＰＭＩ　８２２６　ｃｅｌｓ　ｗａｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ｔｅｒｍｉｎａｌ－ｄｅｏｘｙｎｕｅｌｅｏｔｉｄｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｍｅｄｉａｔｅｄ
ｄＵＴＰ　ｎｉｃｋ　ｅｎｄ　ｌａｂｅｌｉｎｇ（ＴＵＮＥＬ）ａｓｓａｙ　ａｎｄ　Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３２５８　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ａｓｓａｙ．Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｐｅｔａｓｉｎ　ｏｎ　ｃａｓｐａｓｅ－３，８　ａｎｄ　９
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ，ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＥＲＫ１／２，ＭＥＫ（ｐ－ＥＲＫ１／２；ｐ－ＭＥＫ）ａｎｄ　ｐ３８ＭＡＰＫ（ｐ－ｐ３８ＭＡＰＫ）ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗｅｒｅ
ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｐｅｔａｓｉｎ　ｆｏｒ　２４　ｈ，４８　ｈ　ｏｒ　７２　ｈ　ｃｏｕｌｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｔｈｅ　ｐｒｏ－
ｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｙｅｌｏｍａ　ＲＰＭＩ　８２２６　ｃｅｌｓ（Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．０１）．Ｐｅｔａｓｉｎ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｍｙｅｌｏｍａ
ＲＰＭＩ　８２２６　ｃｅｌｓ　ｉｎ　ｔｉｍｅ－ａｎｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｍａｎｎｅｒｓ（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０５）．Ｃａｓｐａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｐｒｅｔｒｅａｔ－
ｍｅｎｔ　ｃｏｕｌｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｍｙｅｌｏｍａ　ｃｅｌｓ．Ａｆｔｅｒ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐｅｔａｓｉｎ　ｆｏｒ　７２　ｈ，ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ
ｏｆ　ｃａｓｐａｓｅ－３，８　ａｎｄ９　ｗｅｒｅ　ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ　ｅｎｈａｎｃｅｄ（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．０５）ａｎｄ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐ－ｐ３８ＭＡＰＫ
ｏｆ　ＲＰＭＩ８２２６　ｃｅｌｓ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０１）．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐ－ＥＲＫ１／２　ａｎｄ　ｐ－ＭＥＫ　ｗａｓ
ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｐｅｔａｓｉｎ　ｃａｎ　ｉｎｈｉｂｉｔ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｙｅｌｏｍａ　ＲＰＭＩ
８２２６　ｃｅｌｓ　ａｎｄ　ｉｎｄｕｃｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｍａｙ　ｂｅ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｓｐａｓｅ－３，８　ａｎｄ　９　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ
ｔｈｅ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐ３８ＭＡＰＫ，ＥＲＫ１／２　ａｎｄ　ＭＥＫ．
ＫＥＹ　ＷＯＲＤＳ：ｐｅｔａｓｉｎ；ｍｙｅｌｏｍａ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ｃａｓｐａｓｅ；ＥＲＫ／ＭＥＫ；ｐ３８ＭＡＰＫ
收稿日期：２０１４－０５－２２　　修回日期：２０１４－０７－０６
基金项目：甘肃省自然科学研究基金计划项目资助（Ｎｏ．０９６ＲＪＺＡ０７７）
Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇａｎｓｕ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ（Ｎｏ．０９６ＲＪＺＡ０７７）
通讯作者：汪玉良．Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｚｕｗｙｌ＠１６３．ｃｏｍ
优先出版：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１３９９．Ｒ．２０１５０１１６．１１０５．００３．ｈｔｍｌ（２０１５－０１－１６）
　 西 安 交 通 大 学 学 报 （医 学 版 ） 第３６卷
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｄｙｘｂ．ｃｎ；ｈｔｔｐ：／／ｙｘｘｂ．ｘｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
　　多发性骨髓瘤（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｍｙｅｌｏｍａ，ＭＭ）是血液
系统常见的恶性肿瘤，尽管对骨髓瘤的生物学研究和
临床治疗技术有了较大进展，但对 ＭＭ 的临床治疗
仍是医学界一大难题。蜂斗菜素是药食两用植物蜂
斗菜的提取物，研究表明蜂斗素能够诱导肿瘤细胞凋
亡，发挥抗肿瘤活性［１－２］。蜂斗菜素是否能抑制骨髓
瘤，通过何种途径起作用目前尚未见报道。为寻求新
的能有效治疗 ＭＭ 的药物，我们采用骨髓瘤 ＲＰＭＩ
８２２６细胞，研究了蜂斗菜素的抗 ＭＭ 作用及其相关
的分子机制，以期为蜂斗菜素应用于临床抗骨髓瘤提
供实验依据。
１　材料与方法
１．１　细胞系　骨髓瘤ＲＰＭＩ　８２２６细胞株购自中国
科学院上海细胞库，实验前从液氮中取出培养。
１．２　药品试剂　蜂斗菜素（含量≥９８％，批号：
２０１３０３２１，西安天瑞生物技术有限公司）；ＲＰＭＩ－１６４０
培养基，台盼蓝染色检测试剂盒，Ｃａｓｐａｓｅ抑制剂
Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ购自碧云天生物研究所；ＴＵＮＥＬ细胞
凋亡检测试剂盒，Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３２５８染色液购自武汉博
士德生物制品有限公司；ｐ－ＥＲＫ，ｐ－ＭＥＫ，ｐ－ｐ３８抗体
（鼠抗人）均购自美国ＣＳＴ公司；Ｃａｓｐａｓｅ－３、８、９（鼠
抗人）抗体购自美国Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ公司。
１．３　主要仪器　二氧化碳培养箱（美国ＳＩＭ 公司）；
ＣＪ－２Ｆ超净工作台（苏州冯氏实验动物设备有限公
司）；尼康８０ｉ荧光显微镜（日本尼康）；ＦＡＣＳ　Ｃａｌｉｂｕｒ
型流式细胞仪（美国ＢＤ公司）
１．４　方法
１．４．１　细胞培养　骨髓瘤ＲＰＭＩ　８２２６细胞用含１００
ｍＬ／Ｌ胎牛血清、１００Ｕ／ｍＬ青霉素和１００μｇ／ｍＬ链霉
素的ＲＰＭＩ－１６４０培养基，于３７℃、５０ｍＬ／Ｌ　ＣＯ２ 条件下
培养，常规方法消化、传代。处于对数生长期细胞用于
实验。
１．４．２　锥虫蓝拒染法检测蜂斗菜素对ＲＰＭＩ　８２２６
细胞的增殖抑制作用　实验分为加药组和对照组。
取对数期细胞，重悬于新鲜培养基中，调整合适浓度，
接种于１２孔培养板，细胞孵育箱中培养２４ｈ。参考
文献［２］，加药组蜂斗菜素终浓度设定为１、５、１０、２０、
４０μｍｏｌ／Ｌ，对照组加入同体积新鲜的培养基，分别培
养２４、４８、７２ｈ。收集细胞，锥虫蓝染色３ｍｉｎ左右，
细胞计数板计数，计算抑制率。每个浓度设复孔
３个，所有实验均重复３次。
１．４．３　ＴＵＮＥＬ法检测蜂斗菜素对ＲＰＭＩ　８２２６细
胞凋亡的影响　实验分组及细胞接种同１．４．２。给
予终浓度分别为５、１０、２０μｍｏｌ／Ｌ的蜂斗菜素后，继
续孵育２４、４８、７２ｈ。以２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶消化分
散细胞，制成单细胞悬液，１　０００ｒ／ｓ离心５ｍｉｎ，收集
细胞，根据 ＴＵＮＥＬ细胞凋亡检测试剂盒说明书操
作，用流式细胞仪进行检测。
１．４．４　Ｈｏｃｈｅｓｔ　３３２５８荧光染色法观察细胞核的变
化　实验分对照组、加药组、抑制剂组。取对数生长
期细胞，调整合适细胞浓度接种于１２孔板，细胞培养
箱孵育２４ｈ后，弃旧培养基，加药组给予含５、１０、
２０μｍｏｌ／Ｌ蜂斗菜素的新鲜培养基；抑制剂组以
１０μｍｏｌ／Ｌ　ｃａｓｐａｓｅ 抑 制 剂 Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ 预 作 用
３０ｍｉｎ，弃去培养基，ＰＢＳ冲洗３次后，处理同加药
组；对照组给予新鲜的空白培养基。各组细胞继续孵
育７２ｈ，收集细胞，根据 Ｈｏｃｈｅｓｔ　３３２５８荧光染色说
明书操作，并采用荧光显微镜观察。
１．４．５　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ检测　实验分组同１．４．２。取对
数期生长细胞，调整合适细胞浓度接种于６孔板，细胞
培养箱孵育２４ｈ后，弃旧培养基，加药组给予含５、１０、
２０μｍｏｌ／Ｌ蜂斗菜素的新鲜培养基，对照组给予新鲜的
空白培养基。各组细胞继续孵育７２ｈ，收集细胞，提取
总蛋白质，ＢＣＡ 法测定蛋白质的含量。Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ
实验时，规定上样量为２０～４０μｇ，一抗（１∶１　０００，鼠抗
人 Ｃａｓｐａｓｅ－３、Ｃａｓｐａｓｅ－８、Ｃａｓｐａｓｅ－９、ｐ－ＭＥＫ、ｐ－
ＥＲＫ１／２、ｐ－ｐ３８抗体）４℃过夜，加入二抗（１∶１　０００，
辣根过氧化物酶标记）于恒温３０℃孵育２ｈ，ＥＣＬ显
色法进行检测，应用Ｉｍａｇｅ　ｐｒｏ　ｐｌｕｓ　Ｖ７．０软件分析
条带的积分吸光度。
１．５　统计学方法　实验数据以珔ｘ±ｓ表示，应用
ＳＰＳＳ　１６．０统计软件进行数据分析。结果２．１、２．２
采用交互设计双因素方差分析，其余所有数据均进行
单因素方差分析及Ｄｕｎｎｅｔ－ｔ组间多重比较，Ｐ＜０．０５
为差异有统计学意义。
２　结　　果
２．１　蜂斗菜素对ＲＰＭＩ　８２２６细胞的增殖抑制作用　
将不同浓度的蜂斗菜素（１、５、１０、２０、４０μｍｏｌ／Ｌ）作用
于ＲＰＭＩ　８２２６细胞２４、４８、７２ｈ后，随时间的延长和
浓度的增加，蜂斗菜素对细胞的抑制率逐渐增加，蜂
斗菜素对ＲＰＭＩ　８２２６细胞的增殖抑制作用具有时间
和浓度依赖性（Ｐ均＜０．０５）。分别作用２４、４８、７２ｈ
后蜂斗菜素处理组细胞与空白对照组细胞抑制率均
有统计学差异（Ｐ均＜０．０１）。蜂斗菜素作用２４、４８、
７２ｈ的ＩＣ５０值分别是２１．４７、１４．２９、９．２３μｍｏｌ／Ｌ
（表１）。
２．２　蜂斗菜素对ＲＰＭＩ　８２２６细胞凋亡率的影响　
将不同浓度的蜂斗菜素（５、１０、２０μｍｏｌ／Ｌ）作用于ＲＰ－
６９３
３期 岳海源，任冬青，王东萍，等．蜂斗菜素诱导骨髓瘤ＲＰＭＩ　８２２６细胞凋亡及其机制
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｄｙｘｂ．ｃｎ；ｈｔｔｐ：／／ｙｘｘｂ．ｘｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
ＭＩ　８２２６细胞２４、４８、７２ｈ后，随时间的延长和浓度的
增加，细胞的凋亡率明显增加，蜂斗菜素诱导ＲＰＭＩ
８２２６细胞凋亡具有时间和浓度依赖性（Ｐ均＜０．０５）。
各时段蜂斗菜素处理组细胞与空白对照组细胞凋亡率
差异均有统计学意义（Ｐ均＜０．０１，表２）。
表１　蜂斗菜素对ＲＰＭＩ　８２２６细胞增殖的影响
Ｔａｂ．１　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｐ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＲＰＭＩ　８２２６ｃｅｌｓ
（珔ｘ±ｓ，ｎ＝３）
组 别
抑制率（％）
２４ｈ ４８ｈ ７２ｈ
对照组 ０ ０ ０
蜂斗菜素组
　１μｍｏｌ／Ｌ　 １１．２５±３．３１　 １９．９１±８．１４　 ２７．２９±３．５６＊
　５μｍｏｌ／Ｌ　 ２３．６８±７．１７＃ ２８．８６±５．１６＃ ３２．１５±９．０１＃
　１０μｍｏｌ／Ｌ　 ３８．１０±９．０６＃ ４２．５７±１４．３６＃４９．５０±８．９８＃
　２０μｍｏｌ／Ｌ　 ５０．６２±１４．６３＃ ５７．６２±１３．６８＃６２．９３±１７．１４＃
　４０μｍｏｌ／Ｌ　 ５９．９６±１１．８５＃ ６６．５４±２１．０３＃７２．３６±１６．２３＃
与对照组比较，＊Ｐ＜０．０５，＃Ｐ＜０．０１。
２．３　蜂斗菜素对ＲＰＭＩ　８２２６细胞细胞核形态的影
响　将不同浓度的蜂斗菜素（５、１０、２０μｍｏｌ／Ｌ）作用
表２　蜂斗菜素对ＲＰＭＩ　８２２６细胞凋亡率的影响
Ｔａｂ．２　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｐｅｔａｓｉｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ＲＰＭＩ　８２２６
ｃｅｌｓ （珔ｘ±ｓ，ｎ＝３）
组 别
凋亡率（％）
２４ｈ ４８ｈ ７２ｈ
对照组 ４．８９±１．７４　 ７．５６±２．１７　 １０．６３±１．８６
蜂斗菜素组
　５μｍｏｌ／Ｌ　 １１．３０±１．４７＃ ２１．４０±２．２０＃ ３０．８７±２．３３＃
　１０μｍｏｌ／Ｌ　 ２１．１９±１．７３＃ ３４．１８±２．４６９＃ ４０．８５±１．６９＃
　２０μｍｏｌ／Ｌ　 ３３．７２±１．０８△ ４３．０６±２．４３△ ５１．７２±２．７２△
与对照组比较，＃Ｐ＜０．０１，△Ｐ＜０．００１。
于ＲＰＭＩ　８２２６细胞７２ｈ后，与对照组比较，随药物浓
度增加，细胞核碎裂浓缩程度增加，蓝色荧光增强，出
现大量凋亡小体，表明蜂斗菜素浓度依赖性地诱导
ＲＰＭＩ８２２６细胞凋亡，验证了 ＴＵＮＥＬ法检测结果
（图１）。给予Ｃａｓｐａｓｅ抑制剂Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ预作用
３０ｍｉｎ后，发现细胞凋亡受到明显抑制，提示蜂斗菜
素诱导的ＲＰＭＩ　８２２６细胞凋亡可能是通过Ｃａｓｐａｓｅ
激活来介导的。
图１　蜂斗菜素对ＲＰＭＩ　８２２６细胞核形态的影响
Ｆｉｇ．１Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｐｅｔａｓｉｎ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ＲＰＭＩ　８２２６ｃｅｌ　ｎｕｃｌｅｉ（×２００）
Ａ：对照组；Ｂ：蜂斗菜素５μｍｏｌ／Ｌ组；Ｃ：蜂斗菜素１０μｍｏｌ／Ｌ组；Ｄ：蜂斗菜素２０μｍｏｌ／Ｌ组；Ｅ：蜂斗菜素２０μｍｏｌ／Ｌ＋Ｃａｓｐａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ组。
２．４　蜂斗菜素对ＲＰＭＩ　８２２６细胞Ｃａｓｐａｓｅ蛋白和
ＭＥＫ／ＥＲＫ、ｐ３８ＭＡＰＫ蛋白磷酸化水平的影响　１０
～２０μｍｏｌ／Ｌ蜂斗菜素作用７２ｈ后，与对照组相比，
Ｃａｓｐａｓｅ－３、８、９蛋白表达显著性增加（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜
０．０１，Ｐ＜０．０５），其中低浓度蜂斗菜素（５μｍｏｌ／Ｌ）能
明显增加Ｃａｓｐａｓｅ－８蛋白的表达（Ｐ＜０．０５），证实蜂
斗菜素诱导的ＲＰＭ　Ｉ８２２６细胞凋亡是通过Ｃａｓｐａｓｅ
激活来介导的（图２）。１０～２０μｍｏｌ／Ｌ蜂斗菜素作用
７２ｈ后，ＥＲＫ１／２及 ＭＥＫ蛋白磷酸化水平显著下降
（Ｐ＜０．０１，Ｐ＜０．０５），ｐ３８ＭＡＰＫ蛋白磷酸化水平显
著上升（Ｐ＜０．０１），提示 ＭＡＰＫｓ参与了蜂斗菜素诱
导的ＲＰＭＩ　８２２６细胞凋亡（图３）。
３　讨　　论
蜂斗菜素是药食两用植物蜂斗菜的提取物，在抗
炎、抗过敏及治疗偏头痛领域已经进行了一定的研
究［３］。近来研究发现，蜂斗菜酯类提取物具有潜在的
抗癌活性［４－５］。硫蜂斗菜素可诱导前列腺癌细胞凋
亡［６］；也有报道显示蜂斗菜素具有显著的抗神经母细
胞瘤细胞增殖作用［２］。本研究结果显示，蜂斗菜素对
骨髓瘤ＲＰＭＩ　８２２６细胞具有显著的增殖抑制作用，
能够诱导ＲＰＭＩ　８２２６细胞凋亡；进一步研究发现，蜂
斗菜素能够激活 Ｃａｓｐａｓｅ蛋白并能够改变 ＭＥＫ／
ＥＲＫ及ｐ３８ＭＡＰＫ磷酸化水平。
Ｃａｓｐａｓｅ是半胱氨酸家族蛋白酶，广泛参与细胞
凋亡过程［７］。Ｃａｓｐａｓｅ的活化是有顺序的多步水解
的过程。基本机制有两种，即同源活化和异源活化。
发生同源活化的Ｃａｓｐａｓｅ，包括Ｃａｓｐａｓｅ－８、９、１０，开启
细胞内的死亡程序，通过异源活化方式水解下游
Ｃａｓｐａｓｅ，将凋亡信号放大，同时将死亡信号向下传
递。被异源活化的Ｃａｓｐａｓｅ，包括Ｃａｓｐａｓｅ－３、６、７，执
行死亡程序［８－９］。因此，干预Ｃａｓｐａｓｅ家族促凋亡相关
７９３
　 西 安 交 通 大 学 学 报 （医 学 版 ） 第３６卷
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｄｙｘｂ．ｃｎ；ｈｔｔｐ：／／ｙｘｘｂ．ｘｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
图２　蜂斗菜素对Ｃａｓｐａｓｅ－３、８、９蛋白表达的影响
Ｆｉｇ．２Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｐｅｔａｓｉｎ　ｏｎ　Ｃａｓｐａｓｅ　３，８ａｎｄ　９ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘ－
ｐｒｅｓｓｉｏｎｓ（珔ｘ±ｓ，ｎ＝３）
与对照组比较，＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１。
图３　蜂斗菜素对 ＭＥＫ／ＥＲＫ、ｐ３８ＭＡＰＫ蛋白表达的影响
Ｆｉｇ．３Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｐｅｔａｓｉｎ　ｏｎ　ＭＥＫ／ＥＲＫ　ａｎｄ　ｐ３８ＭＡＰＫ　ｐｒｏ－
ｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ（珔ｘ±ｓ，ｎ＝３）
与对照组比较，＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１。
蛋白可以成为肿瘤治疗的靶点［１０］。本研究结果表
明，蜂斗菜素作用后，Ｃａｓｐａｓｅ－３、８、９蛋白表达显著增
加。为了进一步证实Ｃａｓｐａｓｅ蛋白参与蜂斗菜素诱
导的ＲＰＭＩ　８２２６细胞凋亡，本研究采用Ｃａｓｐａｓｅ抑
制剂Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ预作用后，发现Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ能
够明显抑制蜂斗菜素诱导的ＲＰＭＩ　８２２６细胞存活率
下降，同时细胞凋亡受到明显抑制。这就提示蜂斗菜
素诱导的ＲＰＭＩ　８２２６细胞凋亡可能是通过Ｃａｓｐａｓｅ
激活来介导的。
丝裂原活化蛋白激酶（ＭＡＰＫ）途径是介导细胞
增殖、分化、凋亡等生理过程的重要信号通路，分为
ＥＲＫ１／２通路、ｐ３８ＭＡＰＫ通路等５个亚家族［１１］，其
信号转导步骤遵循 ＭＡＰＫｓ的三级酶促级联反应，
即Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ途径［１２］。大量研究显示，在
ＭＡＰＫ通路中，ＥＲＫ的磷酸化激活与 ＭＭ细胞增殖
有关［１３－１４］。但是，ＭＡＰＫ通路的ｐ３８和ＪＮＫ通路的
激活则可以促进 ＭＭ细胞调亡［１５－１６］。程月芳等［２］证
明，蜂斗菜素抗神经母细胞瘤细胞增殖的分子机制是
下调ＥＲＫ１／２蛋白的磷酸化水平。本实验发现，１０
～２０μｍｏｌ／Ｌ蜂斗菜素７２ｈ后，能显著下调ＥＲＫ１／２
及 ＭＥＫ蛋白磷酸化水平，同时我们发现蜂斗菜素能
显著上调ｐ３８ＭＡＰＫ蛋白磷酸化水平，这与其他人的
报道是一致的。提示蜂斗菜素的作用机制可能是通过
影响 ＭＥＫ／ＥＲＫ及ｐ３８ＭＡＰＫ信号转导发挥的。
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３期 岳海源，任冬青，王东萍，等．蜂斗菜素诱导骨髓瘤ＲＰＭＩ　８２２６细胞凋亡及其机制
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｄｙｘｂ．ｃｎ；ｈｔｔｐ：／／ｙｘｘｂ．ｘｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
总之，蜂斗菜素对骨髓瘤ＲＰＭＩ　８２２６细胞的增殖
具有明显的抑制作用，能够诱导ＲＰＭＩ　８２２６细胞产生
凋亡，其分子机制可能是通过活化Ｃａｓｐａｓｅ蛋白从而开
启细胞内的死亡程序，放大凋亡信号，并将死亡信号向
下传递，同时改变 ＭＥＫ／ＥＲＫ及ｐ３８ＭＡＰＫ磷酸化水
平，影响细胞增殖、分化、凋亡等生理过程，最终导致细
胞凋亡。另外，蜂斗菜素作为来源于蔬菜类的化合物，
其低毒特点更为其应用于临床骨髓瘤的治疗提供了
优势。
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（编辑　卓选鹏）
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