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南岭国家濒危植物长柄双花木遗传多样性研究



全 文 :第 13 卷 第 4 期
2014 年 8 月
广州大学学报(自然科学版)
Journal of Guangzhou University(Natural Science Edition)
Vol. 13 No. 4
Aug. 2014
收稿日期:2013 - 03 - 06; 修回日期:2014 - 05 - 28
基金项目:国家自然科学基金资助项目(31270259,30970191,30470146);全国大学生“挑战杯”课外科技活动项目
作者简介:谢国文(1957 -),男,教授. E-mail:xieguowen126@ 126. com
* 通信作者. E-mail:lhs11@ gdei. edu. cn
文章编号:1671-4229(2014)04-0047-06
南岭国家濒危植物长柄双花木遗传多样性研究
谢国文1 ,李丽卡1 ,赵俊杰1 ,郑毅胜1 ,李象钦1 ,
张嘉茗1 ,刘萍萍1 ,李海生2*
(1.广州大学 生命科学学院,广东 广州 510006;2.广东第二师范学院 生物与食品工程学院,广东 广州 510303)
摘 要:应用 ISSR分子标记技术,对长柄双花木( Disanthus cercidifolius var. longipes) 5 个南岭野生种群的遗传
多样性进行了初步研究. 8 条 ISSR引物扩增出 101 条带,其中 64 条具多态性,多态位点百分率为 63. 37% . 总
的 Neis基因多样性指数为 0. 285 9,种群内基因多样性( Hs ) 为 0. 274 1,长柄双花木在物种水平上遗传多样性
水平较低.在种群水平上,种群多态位点百分率在 60% ~75%之间,Neis基因多样性指数为 0. 269 5 ~ 0. 282 4,
Shannon信息多态性指数为 0. 384 5 ~ 0. 399 9. 道县种群和莽山种群的遗传多样性水平较高. 种群间的基因分
化系数为 0. 041 4,表明长柄双花木绝大多数遗传变异发生在种群内的个体间( 95. 86% ) . UPGMA聚类分析结
果表明: 5 个野生种群未按地理位置进行聚类,连州 2 个种群较为特殊,先与江西井冈山种群聚在一起,具体原
因有待进一步研究.
关键词:长柄双花木; 金缕梅科; 遗传多样性; ISSR
中图分类号:Q 346 + . 5;Q 789 文献标志码:A
应用分子标记技术研究珍稀濒危植物的遗传
多样性仍然是近年的热点研究领域[1 - 3],其中
ISSR分子标记在植物种群遗传多样性研究中得到
了广泛的应用[4].
双花木属(Disanthus)系金缕梅科孑遗的单种
属,长柄双花木(Disanthus cercidifolius var. longi-
pes)是国家Ⅱ级重点保护的珍稀濒危植物,它残存
于广东、江西、湖南和浙江等省的部分山区,在探
讨金缕梅科系统发育及其区系地理演化等方面具
有重要的科学意义[5]. 它分布区局限,植株稀少,
生长于山地矮林或灌丛中,人为干扰大,易遭山火
焚毁,极需采取有效的保护措施.
近年关于长柄双花木的研究报道侧重于种群
特征[6 - 7]与森林特性[8]、种群形态分化[9]、区系与
资源[10]、地理分布[11]、种子生理[12]、濒危原
因[13]、同工酶分析[14]及 ISSR-PCR 反应体系的优
化[15]等方面. 由于材料获取问题,未见国外学者的
相关研究报道. 本项目在笔者以往研究工作的基础
上[15],初步探讨该植物南岭种群的遗传多样性.
本项目应用 ISSR 分子标记技术研究南岭长
柄双花木的遗传多样性,初步探讨种群内、种群间
的遗传变异水平、种群分化程度,旨在为该濒危植
物的保护和可持续利用提供理论依据.
1 材料与方法
1. 1 材料调查及采集
南岭长柄双花木生于海拔 630 ~ 1 300 m的低
山地,为耐阴树种,长在林下的植株可形成主干,
位于山脊陡坡的,则因大风和易受日灼,树干多弯
曲丛生. 一般 3 月初萌芽,4 月展叶,10 月下旬开
花,于翌年 9 ~ 10 月果实成熟. 花开时,叶大多已
脱落,花与去年的蒴果并存.
南岭山地系指地处湘、黔、桂 粤、闽、赣 6 省的
边境山地. 北与江南丘陵相接,东与武夷山脉南端
相连,南以粤北山区南缘为界,西以桂江谷地和黔
桂山地相隔.地理位置北纬 24°30″ ~ 26°30″,东经
109° ~ 116°. 南岭是中国著名的纬向构造带之一,
广州大学学报(自然科学版) 第 13 卷
基底由加里东运动形成,地势不高,海拔仅千余
米,气候是典型的亚热带温湿气候,具有山地气候
特色,年平均气温 17. 7 ℃,最高气温 34. 4 ℃,最
低气温 - 3. 6 ℃,降水丰富,年降水量达 1 500 ~
2 000 mm,年平均相对湿度 84%,成土母质多为花
岗岩,土壤为山地黄壤,土层浅薄多岩块,酸性,pH
值 5. 6 左右,土壤有机质含量较高. 水热条件较优
越,适宜各类植物生长. 地表径流发达,溪涧流量
大,水力资源丰富. 笔者对南岭现存的 5 个种群进
行了野外调查和实验材料采集(见表 1).
表 1 长柄双花木取样种群的基本情况
Table 1 The general situation of D. cercidifolius var. longipes sampling populations
种群代号 种群地点 海拔 /m 经度 纬度 采样数
LZX 连州潘家洞小水库 1 006 112°4012. 0″E 24°5530. 0″N 24
LZD 连州潘家洞大水库 1 160 ~ 1 165 112°3940. 1″E 24°5507. 1″N 24
DX 湖南道县 701 111°1947. 1″E 25°2814. 0″N 24
MS 湖南郴州莽山 935 112°5319. 0″E 24°5809. 0″N 24
JGS 江西井冈山 1 239 ~ 1 241 113°5320. 2″E 26°4745. 3″N 24
1. 2 研究方法
1. 2. 1 DNA提取及 ISSR反应体系的优化
实验方法见作者前期研究报道[15]. 选取用硅
胶干燥的叶片(约 1 g),采用改良 CTAB 方法提取
DNA. 应用上海生工合成的 ISSR 引物,从 120 个
样品中随机抽取 4 个 DNA 样品进行筛选. 从 60
条引物中筛选出 8 条扩增条带较多、重复性较高、
背景条带清晰的引物用于全部 DNA 样品的扩增
(见表 2). ISSR-PCR 扩增反应条件经比较和优
化[15],确定 20 μL 的反应体系:2 μL 10 × buffer,
0. 20 mmol·L -1 dNTPs,0. 25 μ mol·L -1引物浓
度,2. 0 mmol·L -1 Mg2 +,1. 0 U Taq DNA聚合酶,
约 20 ng DNA,14. 1 μL 双蒸水. 扩增反应在美国
MJ Research 公司的 PTC-200 型扩增仪上进行. 扩
增程序:94 ℃预变性 5 min,之后进行 36 个循环,每
个循环包括 94 ℃变性 30 s、48 ~54 ℃退火(退火温
度随引物而定)(表 2)45 s、72 ℃延伸 90 s,最后于
72 ℃延伸 7 min,将扩增产物于 4 ℃冰箱保存.
表 2 ISSR引物、序列和退火温度
Table 2 Name of ISSR Primers,sequence and annealing
temperature
引物 引物序列 退火温度 /℃
UBC 807 (AG)7AGT 52
UBC 809 (AG)7AGG 54
UBC 817 (CA)7CAA 52
UBC 825 (AC)7ACT 52
UBC 855 (CA)7A AYT 54
UBC 868 (GAA)6 48
UBC 875 (CTAG)4 52
UBC 880 (GGAGA)3 52
1. 2. 2 扩增产物的检测
将 PCR 扩增产物在 0. 5 × TBE 配置的含有
EB的浓度为 1. 5%的琼脂糖凝胶上电泳分离,以
100 bp的 DNA Ladder (100 ~ 3 000 bp)作为相对
分子质量标准,在 80 mA的恒流下电泳 3 h. 电泳
结束后,在紫外检测仪上观察记录扩增产物条带,
并在凝胶成像系统中保存图像.
1. 2. 3 数据处理与分析
在琼脂糖凝胶电泳图谱中,同一 ISSR 位点上
有带记为 1、无带记为 0,建立数据矩阵. 应用
POPGENE Version1. 31[16]软件,对长柄双花木各
个种群分别计算:多态位点百分率(PPB)、观察等
位基因数(Ao)、有效等位基因数(Ae)、Shannon 信
息指数(Ho)、总的基因多样度(Ht)、种群内基因
多样度(Hs)、各种群间的遗传分化指数(Gst)和基
因流(Nm)、Neis遗传距离(D)和遗传一致度(I).
用 NTSYS-pc2. 10e[17]中的 SHAN 和 TREE 程序对
POPGENE得到的遗传距离矩阵进行非加权分组
算术平均法(unweighted pair group with arithmetic
average,UPGMA)聚类分析,建立种群聚类分支图,
确定各种群的相互关系.
2 实验结果
2. 1 南岭长柄双花木 ISSR扩增的结果
8 个 ISSR引物(表 2)扩增了长柄双花木 5 个
种群共 120 个个体,共扩增出 101 个位点,不同引
物扩增的多态位点的数量从 7 ~ 9 个不等,平均每
个引物扩增出 12 个位点,形成了带型丰富、片段大
84
第 4 期 谢国文等:南岭国家濒危植物长柄双花木遗传多样性研究
小及其组合不同的电泳图谱,部分引物扩增结果见
图 1. 其中多态位点 64 个,多态位点百分率
63. 671%,表明长柄双花木具有较低的遗传多样性.
图 1 引物 809 对道县种群(DX)24 个个体的 ISSR-PCR
扩增结果
Fig. 1 ISSR-PCR fingerprints of 24 samples of D. cercidifoli-
us var. longipes from Daoxian population(DX)using
primer 809 M:100 bp DNA ladder.
2. 2 南岭长柄双花木遗传多样性
从表3可见,观测等位基因数(Ao)在1. 549 8 ~
1. 613 9 之间,平均为 1. 592 9,其中道县(DX)种
群的最高(1. 613 9),连州潘家洞大水库(LZD)
种群最低(1. 549 8). 有效等位基因数(Ae)在
1. 496 2 ~ 1. 530 6 之间,平均为 1. 507 6,最高为道
县种群(1. 530 6),最低为井冈山种群(1. 496 2).
Shannon信息指数(Ho)计算的多样性在 0. 384 5 ~
0. 399 9 之间,平均 0. 390 1. 其中道县种群的最
高,为 0. 399 9,连州种群的最低,为 0. 384 5. Nei
的基因多样性(He)在 0. 269 5 ~ 0. 282 4 之间,平
均为 0. 274 1. 其中最高为道县种群(0. 282 4),最
低为连州大水库种群(0. 269 5) ,平均 0. 274 1. 综
合上述指标,5 种群遗传多样性大小顺序为道县
(DX)>莽山(MS)>连州小水库(LZX)>井冈山
(JGS)>连州大水库(LZD). 5 个种群多样性指标
表明,道县种群具有相对较高的遗传多样性.
表 3 南岭长柄双花木种群遗传变异统计*
Table 3 The genetic variation statistics among populations of D. cercidifolius var. longipes in Nanling
种群 观测等位基因数(Ao) 有效等位基因数(Ae) Nei的基因多样性(He) Shannon信息指数(Ho)
DX 1. 613 9(0. 489 3) 1. 530 6(0. 436 0) 0. 282 4(0. 228 6) 0. 399 9(0. 321 9)
LZX 1. 604 0(0. 491 5) 1. 504 7(0. 422 2) 0. 273 4(0. 224 5) 0. 389 2(0. 318 3)
JGS 1. 592 8(0. 452 3) 1. 496 2(0. 414 5) 0. 270 9(0. 222 5) 0. 386 6(0. 316 2)
LZD 1. 549 8(0. 503 1) 1. 498 3(0. 427 3) 0. 269 5(0. 224 8) 0. 384 5(0. 317 6)
MS 1. 604 0(0. 491 5) 1. 508 3(0. 425 2) 0. 274 4(0. 225 4) 0. 390 2(0. 319 2)
* 括号内数值为标准差
长柄双花木总的基因多样度(Ht)为 0. 285 9,
种群内基因多样度(Hs)为 0. 274 1,基因分化系数
(Gst)为 0. 041 4. 基于种群间的遗传分化系数计
算的基因流 Nm = 11. 583 7,说明不同种群间存在
基因流,防止了由于遗传漂变导致的种群间的遗
传分化.
2. 3 长柄双花木各种群间的遗传距离
各种群间的 Nei 遗传距离(D)和遗传一致度
(I)见表 4. 长柄双花木 5 个种群的遗传一致度较
高,遗传一致度的平均值为 0. 979 7,平均遗传距
离为 0. 024 2,其中连州大水库种群(LZD)和连州
小水库种群(LZX)的遗传距离最小,为 0. 017 4,
这与地理距离近相关.
根据 Nei的遗传距离将所有群体进行 UPGMA
聚类,得到树状图(图 2). 由图 2 可见,5 个种群
大致分为 2 类:首先连州 2 个种群相聚,再与井冈
山种群相聚为一类,道县(DX)种群和莽山(MS)
种群聚为另一类. 5 个野生种群未按地理位置进
行聚类,连州 2 个种群较为特殊,先与江西井冈山
种群聚在一起.
表 4 南岭长柄双花木种群间遗传一致度(右上
角)和遗传距离(左下角)
Table 4 Genetic identity (above diagonal)and genetic dis-
tance (below diagonal)among populations of D.
cercidifolius var. longipes in Nanling
种群 DX LZX JGS LZD MS
DX - 0. 990 4 0. 983 9 0. 971 2 0. 978 0
LZX 0. 018 6 - 0. 981 2 0. 968 6 0. 974 9
JGS 0. 032 6 0. 034 4 - 0. 978 0 0. 980 5
LZD 0. 019 2 0. 017 4 0. 034 2 - 0. 989 6
MS 0. 025 8 0. 019 4 0. 031 2 0. 018 9 -
94
广州大学学报(自然科学版) 第 13 卷
图 2 南岭长柄双花木各种群基于 Neis遗传距离的 UPG-
MA聚类图
Fig. 2 Dendrogram of UPGMA cluster analysis based on Neis
genetic distance among populaions of D. cercidifolius
var. longipes in Nanling
3 讨 论
3. 1 长柄双花木遗传多样性与遗传分化
从种群遗传学角度,对南岭长柄双花木种群
遗传变异进行了 ISSR-PCR 分析. 结果显示:南岭
长柄双花木在物种水平的多态位点比率为
63. 65%,表明长柄双花木种群的遗传多样性处于
较低的水平,与李晓红关于长柄双花木同工酶的
分析(多态性为 62. 70%)[14]结果一致. 长柄双花
木 Nei的基因多样性(He)在 0. 269 5 ~ 0. 282 4 之
间,说明种群间基因多样性水平较低. 基因分化系
数(Gst)表示种群间基因分化的程度,Gst值变化在
0 与 1 之间,值越小,说明种群间基因分化程度越
低;值越大,说明种群间基因分化程度越高,当大
部分遗传变异存在于种群内时,意味着种群之间
的相似程度大而差异小,物种的遗传变异主要取决
于种群内个体的差异. 长柄双花木种群间遗传分化
系数(Gst)为 0. 041 4,表明长柄双花木总的变异主
要发生在种群内的个体间(95. 96%),发生在种群
间的变异只占 4. 14% . 已有的研究表明,植物种
群的遗传结构反映了种的长期进化史(分布区转
移、生境片断化和种群特化)、突变、遗传漂变、交
配系统、基因流和选择等不同过程的相互作
用[18 - 19]. 遗传多样性水平较低可能是其濒危的原
因之一.
3. 2 长柄双花木的保护建议
生物多样性的保护与持续利用研究已经受到
人类社会的普遍关注,物种濒危机制和保护对策
的研究是主要内容之一,生态系统遭受破坏的过
程尚在继续,大批物种正在急剧减少乃至灭绝. 因
此,全面深入地开展生物多样性保护等基础研究
已成为当务之急[20]. 物种保护的最终目的是保护
它们的进化潜力. 濒危物种遗传多样性信息的研
究是设计合理的保护策略的前提[21].
长柄双花木为国家Ⅱ级重点保护的珍稀濒危
植物. 其种群大多为小种群,生境要求特殊,分布
区狭窄. 此次野外调查发现,长柄双花木生长的地
点主要集中在温凉多湿的山地北坡阔叶林或混交
林中,森林的乱砍滥伐、火烧[6]和旅游的不合理开
发等人为活动给该物种带来严重的威胁,导致该
物种的个体数量进一步减少和更新困难. 作为一
个狭域分布的濒危种,应该对现存所有野生的长
柄双花木种群进行保护. 由于生境破碎化,使之呈
现出一种间断的分布模式,如果不采取有效的保
护措施,该物种将濒临灭绝. 因此,笔者特提出如
下保护建议:加强就地保护工作,在该物种各分布
点建立自然保护小区,严禁砍伐,以便让各种群能
够天然更新,在整体上保护该物种的遗传变异水
平. 进行迁地保护,多种群引种繁殖. 作为观赏树
木,应做好开发利用工作.
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Genetic diversity of national endangered plant
Disanthus cercidifolius var. longipes in Nanling
XIE G uo-wen1,LI Li-ka1,ZHAO Jun-jie1,ZHENG Yi-sheng1,LI Xiang-qin1,
ZHANG Jia-ming1,LIU Ping-ping1,LI Hai-sheng2
(1. School of Life Sciences,Guangzhou University,Guangzhou 510006,China;
2. School of Biology and Food Engineering,Guangdong University of Education,Guangzhou 510303,China)
Abstract:The genetic diversity of Disanthus cercidifolius var. longipes from five wild populations in Nanling was
studied by means of ISSR markers,in order to provide theoretical basis for the protection and sustainable utiliza-
tion of the endangered plant. Eight ISSR primers gave rise to 101 discernible bands,of which 64(63. 37%)
were polymorphic. The total Neis genetic diversity index was 0. 285 9,genetic diversity within populations
(Hs)was 0. 274 1,indicating a relatively lower genetic variation at the species level. At the population level,
the percentage of polymorphic bands were 60% ~75%,Neis genetic diversity index were 0. 269 5 ~ 0. 282 4,
Shannons information index were 0. 384 5 ~ 0. 399 9. Daoxian population and Mangshan population had higher
genetic diversity levels. Genetic differentiation among populations was 0. 041 4,indicating a large proportion of
genetic diversity (95. 86%)was resided among individuals within populations. The UPGMA cluster analysis
showed that the five populations were not basically clustered according to their geographic distances,it was sur-
prising that the two Lianzhou populations (LZX and LXD) clustered firstly with Jinggangshan population
(JGS),the reason should be explored further.
Key words:Disanthus cercidifolius var. longipes;Hamamelidaceae;genetic diversity;ISSR
【责任编辑:周 全】
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