全 文 ：　第 9卷　第 2期
2010年　4月　
广州大学学报(自然科学版)
JournalofGuangzhouUniversity(NaturalScienceEdition)
Vol.9　No.2
Apr.　2010
　　收稿日期:2009-06-13;　修回日期:2010-01-07
　　基金项目;国家自然科学基金项目(30970191, 30470146, 39460011)资助
　　作者简介:谢国文(1957-),男 ,教授 ,硕士.E-mail:xieguowen126@ 126.com
文章编号:1671-4229(2010)02-0045-06
濒危植物长柄双花木 ISSR-PCR反应体系的优化
谢国文1 , 赵俊杰1 , 李荣华1 , 李海生2 , 郭培国1 , 陈雅丽1 , 黄爱平1
(1.广州大学 生命科学学院 , 广东 广州　510006;2.华东师范大学 河口海岸学国家重点实验室 , 上海　200062)
摘　要:采用改进的 CTAB法提取长柄双花木(Disanthuscercidifoliusvar.longipes)基因组 DNA, 并以此 DNA为
模板 ,对 ISSR-PCR的反应体系进行了优化 ,建立了适合长柄双花木 ISSR-PCR的反应体系和程序 , 即 20 μL的
反应体系中 ,含模板 DNA20 ng, Mg2+2.0 mmol· L-1 , 引物 0.25 μmol· L-1 , dNTPs0.20 mmol· L-1 , TaqDNA
聚合酶 1.0 U;扩增程序:94 ℃预变性 5min, 94 ℃变性 30s, 48 ～ 54 ℃复性 45s;72 ℃延伸 90s;共 36个循环;
循环结束后 , 72 ℃延伸 7min.本研究为利用这一分子标记对长柄双花木进行遗传多样性分析奠定了基础.
关键词:长柄双花木;金缕梅科;濒危植物;ISSR;优化
中图分类号:Q943.2　　　文献标志码:A
　　简单重复序列区间扩增多态 DNA(ISSR)分
析是建立在 PCR反应基础上的一种新的分子生物
学技术 ,由 ZIETKIEWICA等 [ 1]创建 ,它结合了 SSR
和 RAPD的优点 ,已广泛用于遗传多样性分析 、绘
制 DNA指纹图谱 、品种鉴定 、生物进化及分子生
态学等领域的研究 [ 2-4] .
长柄双花木(Disanthuscercidifoliusvar.longipes)
为金缕梅科双花木属(Disanthus)的濒危植物 ,仅
零星分布于广东 、江西 、湖南和浙江等省的部分
县 ,属国家二级重点保护的濒危物种 ,在探索双花
木属系统发育及其区系地理演化方面具有重要的
科学意义 [ 5] .长柄双花木居群数量稀少 ,分布区
狭窄 ,一般生长在海拔 1 000m以下的山地北坡阔
叶林或针阔叶混交林中 ,森林的乱砍滥伐和旅游
的不合理开发给该物种带来严重的威胁 ,导致该
物种的数量进一步减少.由于生境破碎化 ,使之呈
现出一种间断的分布模式 ,如果不采取有效的保
护措施 ,该物种将濒临灭绝.
长柄双花木是中国特有植物 ,国外未见相关
研究报道.国内关于长柄双花木的研究报道有数
量及林学特征 [ 6] 、居群间形态分化[ 7] 、幼苗光合特
征[ 8] 、分布群落中优势种的联结性[ 9] 、居群动态及
繁育系统 [ 10-11] 、种子休眠与萌发 [ 12] 、生态遗传分
化和遗传多样性的同工酶分析 [ 13-14]等方面的研
究 ,还未涉及 DNA分子标记方面的研究.本研究
利用硅胶干燥的长柄双花木叶片进行 DNA提取
方法和 ISSR-PCR反应体系的优化 ,为进一步探讨
该珍稀濒危保护植物的遗传多样性提供参考.
1　材料与方法
1.1　材料
南岭山地长柄双花木生于海拔 630 ～ 1 300 m
的低山 ,为耐阴树种 ,冬芽于 3月初萌动 , 4月上旬
展叶 ,花期为 10月下旬 ,果实于翌年 9 ～ 10月成
熟.2008年 7 ～ 8月我们对南岭 5处(连州 、宜章 、
道县 、常宁 、井冈山)记载有长柄双花木分布的地
点进行野外调查 ,采集长柄双花木新鲜嫰叶片 ,并
用硅胶干燥袋密封于袋中.
1.2　方法
1.2.1　总 DNA的提取
取用硅胶干燥的叶片 (约 1 g),采用改进的
CTAB法 [ 15] ,提取基因组总 DNA.
1.2.2　DNA纯度检测
取 3μLDNA样品稀释 25倍 ,在 SmartspeeTM
plusspectrophotoMeter(BIO-RAD, U.S.A)上测定浓
度 、260及 280nm处的光吸收值以及 OD260/OD280
的比值.
　　 广州大学学报(自然科学版) 第 9卷　
1.2.3　ISSR-PCR扩增
用上海生工合成的 ISSR引物 ,从 125个样品
中随机抽取 4个模板进行筛选.从 60条引物中筛
选出 8条扩增条带较多 、重复性较高 、背景条带清
晰的引物用于全部 DNA样品的扩增(表 1).变性
温度根据引物的 Tm值变化 5 ℃左右.扩增反应
在美国 MJResearch公司的 PCR-200TM型扩增仪
上进行 ,将 PCR扩增产物置于 4℃冰箱保存.
表 1　ISSR引物序列与适宜的退火温度
Table1　SequenceofISSRprimersandfitingannealingtem-
perature
引物 序列(5 to3 ) 退火温度 / ℃
UBC807 (AG)7 AGT 52
UBC809 (AG)7AGG 54
UBC817 (CA)7CAA 52
UBC825 (AC)7ACT 52
UBC855 (CA)7AAYT 54
UBC868 (GAA)6 48
UBC875 (CTAG)4 52
UBC880 (GGAGA)3 52
1.2.4　ISSR-PCR反应体系的优化
为了确定最佳长柄双花木 ISSR-PCR的扩增
条件 ,选用了通用的引物 UBC809对 ISSR的影响
因素(模板 DNA用量 、Mg2 +浓度 、dNTPs浓度 、引
物浓度 、TaqDNA聚合酶用量)逐个做梯度实验 ,各
因素变化见表 2.
表 2　ISSR-PCR反应体系的因素与水平
Table2　FactorsandgradesofISSR-PCRreactionsystem
因素
水平
Mg2+浓度 /
(mmol·L-1)
dNTPs浓度 /
(mmol· L-1)
引物浓度 /
(μmol·L-1)
模板 DNA
用量 /ng
TaqDNA聚合
酶用量 /U
1 1.0 0.10 0.25 5 1.0
2 1.5 0.15 0.50 10 1.5
3 2.0 0.20 1.00 20 2.0
4 2.5 0.25 1.50 30
5 3.0 0.30 2.00 40
1.2.5　ISSR-PCR产物鉴定
将 PCR产物在用 0.5 ×TBE配置的含有 EB
的 、浓度为 1.5%的琼脂糖上 ,以 120 V稳压 、80
mA的恒流 ,以 100 bp的 DNALadder(100 ～ 3 000
bp)作为相对分子质量标准电泳 3 h.电泳结束
后 ,在紫外检测仪上观察记录扩增产物条带 ,并在
计算机凝胶成像系统中保存图像.
2　结果与分析
2.1　长柄双花木的 DNA提取纯化
获得质量较好大模板 DNA是对长柄双花木
进行植物分子生物学方面研究的必要前提.从 20
世纪 80年代以来 ,国内外常采用 CTAB法提取植
物总 DNA,由于长柄双花木含多酚类化合物 、多糖
和萜类化合物以及某些未知的化合物 , 影响了
DNA的有效提取.
从凝胶电泳图(图 1)可见:改良的 CTAB法 ,
产率较高 ,带型整齐清晰.对这两种方法提取的
DNA的 OD260 /280 nm比值作一比较 , 发现常规
CTAB法提取的 DNA的 OD260/280 nm多在 1.2
～ 2.4之间 ,而改良的 CTAB法所提取的 DNA的
OD260 /280 nm比值一般在 1.8左右.因此 ,改良
的 CATB法提取的 DNA质量比较好.
图 1　CTAB法(左)和改良的 CTAB法(右)提取的基因组
DNA
Fig.1　GenomicDNAextractionbyCTABmethod(left)and
improvedCTABmethod(right)
2.2　长柄双花木遗传多样性的 ISSR-PCR反应体
系及反应程序的优化
　　不同的物种要求的 ISSR反应条件不尽相同 ,
许多因素都会影响 PCR反应的质量和重复
性 [ 16 -17] ,其扩增谱带虽较 RAPD标记稳定 ,但同
样受反应条件和扩增程序变化以及物种不同的影
响 [ 18] .因此 ,在将该技术应用于一种新的植物材
料之前 ,都应先建立一个合适的 ISSR-PCR反应体
系 ,以期获得可靠的结果.
2.2.1　引物筛选与退火温度的确定
ISSR-PCR扩增 ,退火温度明显影响扩增谱带
46
　第 2期 谢国文等:濒危植物长柄双花木 ISSR-PCR反应体系的优化 　　　
式样 [ 19] .退火温度过低 ,扩增特异性差 ,杂带较
多 ,背景模糊;退火温度过高 ,引物与模板结合差 ,
电泳条带弱 ,甚至没有扩增.对其他引物进行梯度
PCR,也得到同样结果.退火温度越高 ,扩增的特
异性越高.在选择最佳退火温度时 ,如扩增结果相
近 ,宜选择较高退火温度 , 以提高反应的特异
性[ 20] .
ISSR引物有不同的 GC百分比含量 ,确定一
个合适的退火温度非常重要.具体可用公式 Tm
=4(G+C)+2(A+T)[ 21] .但事实上 Tm值受到
各反应成分的浓度影响很大 ,故由 Tm计算出来的
退火温度只是个大概值 ,具体 PCR反应体系仍需
要实验摸索.
本实验设置了 48 ℃、50 ℃、51 ℃、52 ℃、53
℃、54 ℃、55 ℃共 7个梯度试验 ,结果发现在 52
℃时能扩增出最稳定清晰的条带.因此 , 引物
UBC807在本实验中的最佳退火温度为 52 ℃.在
其他引物退火温度确定的过程中 ,均采用本方法 ,
最后 8条能扩增出稳定 、清晰的条带的退火温度
在 48 ～ 54℃之间.
2.2.2　Mg2 +浓度对 ISSR扩增的影响
Mg2+浓度影响 TaqDNA聚合酶的活性 、退火
温度和产物的特异性 ,从而影响 ISSR-PCR扩增结
果[ 18, 22-23] .在一定范围内 ,随着 Mg2+浓度的增
高 ,扩增的特异性减弱 ,但扩增片段增加 [ 24] .试验
中我们也发现 Mg2+浓度的变化对谱带的数量和
强度影响较大.实验设计了不同 Mg2 +浓度梯度:
1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mmol· L-1 ,实验结果如图
2(左)所示 ,当 Mg2+浓度为 2.0 mmol· L-1时 ,能
扩增出条带较多 ,特异性强的谱带.因此本研究
中 , Mg2+浓度以 2.0mmol·L-1较为适宜.
2.2.3　dNTPs浓度对 ISSR扩增的影响
dNTP作为 PCR反应的原料参与新链 DNA的
合成过程.本研究设置了 dNTP浓度为 0.10、
0.15、0.20、0.25、0.30mmol·L-1共 5个浓度梯度
进行比较.试验显示 dNTP浓度的变化对谱带的
数量和强弱影响很大 ,如图 2(右)所示.结果表
明 ,浓度为 0.15 ～ 0.20mmol·L-1的 dNTP含量均
有扩增产物.在 0.15 mmol· L-1时 , PCR反应的
稳定性不及 0.20 mmol· L-1.所以本试验采用的
dNTP浓度是 0.20 mmol· L-1.
图 2　不同 Mg2+浓度(左)和不同 dNTP浓度(右)扩增结果
Fig.2　Amplificationresultsusingdiferentconcentrationof
Mg2+(left)anddNTP(right)
2.2.4　引物浓度对 ISSR扩增的影响
本研究中 ,引物浓度的变化对 ISSR谱带的数
量和强弱影响较小 ,这与李均敏等[ 25]对七子花
(Heptacodiummiconioides)的研究结果相似 ,如图 3
(左)所示.当引物浓度在 0.25 ～ 2.0 μmol· L-1
之间时 ,带型相差不大 , 考虑到试验成本 ,选用
0.25μmol·L-1为引物的适用浓度.
图 3　不同引物浓度(左)和不同 TaqDNA酶单位(右)扩
增结果
Fig.3　Amplificationresultsusingdiferentconcentrationof
primersandTaqDNApolymerase
2.2.5　TaqDNA酶用量对 ISSR扩增的影响
使用高浓度的 TaqDNA聚合酶不仅成本过
高 ,而且容易产生非特异性扩增产物 , TaqDNA聚
合酶浓度过低则会导致产物的合成效率下降.本
实验设置了 1.0、1.5、2.0 U共 3个 TaqDNA聚合
酶含量梯度.结果(见图 3(右))表明使用 1 ～ 2.0
UTaqDNA聚合酶含量均有扩增产物出现 ,但高于
2个单位时 ,非扩增产物没有出现 , 1.0 U时扩增
反应最佳.
2.2.6　模板 DNA量对 ISSR扩增的影响
DNA模板的含量是制约扩增产物得率及特异
47
　　 广州大学学报(自然科学版) 第 9卷　
性的一个重要因子.模板量过多会降低特异性扩
增效率 ,增加非特异性产物;含量过低 ,分子碰撞
的机率低 ,偶然性大 ,扩增产物无或不稳定.
在其它反应条件不变的情况下 ,本文研究了
20 μL反应体系中模板 DNA用量在 5、10、20、30、
4Ong时 ISSR扩增效果.结果表明:模板 DNA浓
度为 5、10、30、40 ng时 ,扩增强度弱且带少 ,当用
量为 20ng时 ,扩增的条带最多并且最清晰 ,可见
模板浓度的改变可导致扩增带型的变化.通过对
比将长柄双花木 ISSR扩增的模板浓度确定为 20
ng为最佳.
2.2.7　长柄双花木 ISSR-PCR扩增效果
应用优化好的反应体系和程序 , 选用重复性
高 、位点清晰的 8个 ISSR引物(表 1)对长柄双花
木进行了扩增 ,形成了带型丰富 、清晰的 ISSR电
泳图谱.产物扩增好后置于 4℃冰箱保存 ,以备进
行长柄双花木种群遗传多样性研究使用.图 4为
对道县居群(24个体)进行 ISSR-PCR扩增得到的
电泳图谱.
图 4　优化的 ISSR-PCR体系对道县居群 24个体扩增的 ISSR图谱(引物(809))
Fig.4　ISSRprofilesof24DaoxiansamplesobtainedbyusingoptimalISSR-PCRsystem(Primer(809))
3　结　论
本研究对长柄双花木 ISSR-PCR各因子的反
应条件进行了优化 ,建立了适合长柄双花木 ISSR-
PCR的反应体系和程序 ,即 20 μL的反应体系中 ,
含模板 DNA20 ng, Mg2+2.0 mmol· L-1 ,引物 0.25
μmol· L-1 , dNTPs0.20 mmol· L-1 , TaqDNA聚合
酶 1.0U;扩增程序:94 ℃预变性 5 min, 94 ℃变
性 30 s, 48 ～ 54 ℃复性 45s;72 ℃延伸 90s;共 36
个循环 ,循环结束后 , 72 ℃延伸 7min.利用此优化
体系 , 能得到清晰 、多态性高的 ISSR-PCR图谱 , 并
具有较好的重复性.本研究为利用这一分子标记
对长柄双花木进行遗传多样性分析奠定了基础.
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OptimizationofISSR-PCRreactionsystemforendangered
plantDisanthuscercidifoliusvar.longipes
XIEGuo-wen1 , ZHAOJun-jie1 , LIRong-hua1 , LIHai-sheng2 , GUOPei-guo1 , CHENYa-li1 , HUANGAi-ping
(1.SchoolofLifeSciences, GuangzhouUniversity, Guangzhou510006, China;
2.StateKeyLaboratoryofEstuarineandCoastalResearch, EastChinaNormalUniversity, Shanghai200062, China)
Abstract:InordertostudythegeneticdiversityofDisanthuscercidifoliusvar.longipes, anendangeredplantin
China, improvedCTABmethodusedtoextractgenomicDNAandthisDNAasatemplateforISSR-PCRreaction
conditionswereoptimized.TheoptimalISSR-PCRsystemforD.cercidifoliusvar.longipeswasestablishedfor
thefirsttime, thatis, 20 μLofthereactionsystem, with2 μL10 ×bufer, 0.20 mmol·L-1 dNTP, 0.25
μmol·L-1concentrationofprimers, 2.0 mmol· L-1 Mg2+, 1.0 UTaqDNApolymerase, about20 ngDNA,
14.1 μLdouble-distiledwater.Theoptimalamplifiedprocedurewasasfolows:afterapre-denaturingof5min
at94 ℃, folowedby36cycleswhichwereperformedwithdenaturingof30sat94℃, annealingof1mindue
todenaturingtemperature48 ～ 54 ℃ofdiferentprimer45s, extension90sof1.5 minat72 ℃, afinalexten-
sionstepof7 minat72 ℃andholdat4℃.Thispapercouldsetlefavorablebasisforstudyingthegeneticdi-
versityofD.cercidifoliusvar.longipesusingISSRmolecularmarkertechniques.
Keywords:Disanthuscercidifoliusvar.longipes;Hamamelidaceae;endangeredplant;ISSR;optimization.
【责任编辑:周　全】
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