全 文 ：在本实验中选用了反相色谱系统，在选择色谱柱时，
比较了 Kromasil C18柱 (250 mm ×4． 6 mm，5 μm)和
CEC-C18柱 (150 mm ×4． 6 mm，5 μm) ，前者他米巴
罗汀在 37． 136 min 出峰，保留时间较长，而后者他
米巴罗汀在 13． 014 min出峰，因此选择 CEC-C18柱。
在选择流动相时，由于 C18链在水相中不易保持伸展
状态，故流动相中有机溶剂的比例应不低于 5%。
经过多次试验，选择乙腈-0． 1%磷酸-甲醇(1 ∶ 1 ∶ 1)
为流动相，流速为 1． 0 mL /min，检测波长为 235 nm。
这种色谱条件既可以使他米巴罗汀在色谱柱上有适
当的保留时间，又可以有效地消除有关物质和辅料
的影响，优于文献报道的方法［6］。试验结果表明，
采用本法测定他米巴罗汀的含量，操作简便、结果准
确可靠、重现性好、专属性强，可用于他米巴罗汀胶
囊的质量控制。
参考文献:
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蛇莓中齐墩果酸对肝癌细胞 SMMC-7721 的抑制作用
吴英俊，王超男，刘洁婷，李洪志，袁晓环
(牡丹江医学院 黑龙江省抗纤维化生物治疗重点实验室，黑龙江 牡丹江 157011)
摘 要:目的 探讨蛇莓中齐墩果酸(OA)对人肝癌 SMMC-7721 细胞增值的抑制作用。方法 建立人肝癌
SMMC-7721 细胞体外培养模型。MTT法检测不同浓度 OA 对人肝癌 SMMC-7721 细胞的影响。结果 与对照组比
较，药物组在 24 h对肝癌细胞具有明显的抑制作用(P ＜ 0． 05) ，并在 48 h 内随着浓度的增加，抑制率增加。结论
OA对人肝癌 SMMC-7721 细胞的抑制作用具有时间和浓度的依赖性，OA有良好的体外抗肿瘤作用。
关键词:齐墩果酸;蛇莓;人肝癌 SMMC-7721 细胞;抗癌活性
中图分类号:R285． 5 文献标识码:A 文章编号:1005-1678(2011)04-0306-03
The effect of oleanolic acid in the Herba Duchesnese indicae
on SMMC-7721 cells line
WU Ying-jun，WANG Chao-nan，LIU Jie-ting，Li Hong-zhi，YUAN Xiao-huan
(Heilongjiang Key Laboratory of Anti-fibrosis Biotherapy，Mudanjiang Medical College，
Mudanjiang 157011，China)
Abstract:Purpose To study the effect of oleanolic acid(OA)in the Herba Duchesnese indicae on
SMMC-7721 cells line．Methods Culture mode in vitro was established with SMMC-7721 cells line． The
effect of OA on survivor of SMMC-7721 cells was observed by MTT assay． Results Compared with control
收稿日期:2010-12-28
基金项目:黑龙江省卫生厅项目(2007-006)
作者简介:吴英俊，男，从事药学研究;袁晓环，女，通信作者，
教授，从事药物分析及天然药物开发研究工作，Tel:0453-6582647，
Email:yuanxiaohuan1969@ 163． com。
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group，the OA group has the inhibition effect on SMMC-7721 cells in 24 h(P ＜ 0． 05) ，and play a role of
inhibition proliferation obviously in 48 h，with the inhibition rate rising with OA increasing．
Conclusion We observed dose-dependent inhibition and time-dependent inhibition of SMMC-7721 cells
by OA． It is shown that OA has a good anti-cancer activity in vitro．
Key words:oleanolic acid;Duchesnese indicae;SMMC-7721 cells;anti-cancer activity
蛇莓［Duchesnea indicae(Andr)Focke］为蔷薇科
蛇莓属植物，在我国绝大部分区域包括东部、中部、
南部和西南都有广泛分布［1］。具有清热解毒、消肿
散瘀，收敛止血、凉血之功效，现代药理研究表明蛇
莓具有较强的抗癌活性［2-3］，已从蛇莓中分离得到的
化合物主要有三萜及其苷类、香豆素类、黄酮类、甾
醇类等［4-5］，其中的齐墩果酸(oleanolic，OA)为五环
三萜类天然化合物，其毒性很低，具有抗病毒、消炎、
双向调节、抑制血小板凝集、降血脂、降血糖、保肝、
护肾和抗艾滋病病毒等作用。临床上 OA主要用于
治疗急性黄疸型和慢性中毒型肝炎，并作为抗癌辅
助药物［6］。但其作用机制还不清楚。本实验用四
甲基偶氮唑盐(MTT)法检测 OA 对人肝癌 SMMC-
7721 细胞的抑制作用，为揭示蛇莓中 OA 的抗肿瘤
作用提供依据。
1 材 料
人肝癌 SMMC-7721 细胞，哈尔滨医科大学赠
送;中药蛇莓饮片(090307 /05) ，哈尔滨市盛泰中药
饮片加工厂;OA对照品(110709-200905) ，中国药品
生物制品检定所;胎牛血清，杭州四季青公司;MTT、
二甲基亚砜(DMSO) ，Sigma 公司;RPMI 1640 培养
基，Gibco公司。
Bio-Rad 550 酶标仪，美国 Bio-Rad 公司;MCO-
15AC二氧化碳培养箱，三洋公司;KQ-500DE 超声
波清洗器，昆山市超声仪器公司;IX70-142 倒置式
生物显微镜，日本奥林巴斯。
2 方法与结果
2． 1 SMMC-7721 细胞培养
采用 RPMI 1640 培养基，含有 10%胎牛血清，
100 u /mL 青霉素，100 u /mL 链霉素，常规细胞培
养，隔天换液，每周传代 1 次。取对数生长期的
SMMC-7721 细胞，计数后以 1 × 105 的密度接种于
96 孔板，每孔 100 μL，培养 24 h 后用于实验。试验
设 3 次重复，每组 4 孔。
2． 2 药物配制
取蛇莓干燥全草 600 g粉碎，按一定料液比，加
入 95%的乙醇溶液，浸泡过夜，过滤，然后用等体积
石油醚萃取 3 次，萃取后的原料液水浴加热浓缩至
干，得 OA提取物 0． 58 g，4 ℃冰箱保存备用。高效
液相色谱法［7］测得提取物 OA含量为 94． 5%。
用含有 10%胎牛血清，100 u /mL 青霉素，100
u /mL链霉素的 RPMI 1640 培养液溶解 OA提取物，
配制成浓度为 80 μg /mL 的原液，－ 20 ℃储存。使
用时用含 10%胎牛血清的 RPMI 1640 培养基稀释，
配制成终浓度为 20，40，80 μg /mL的使用液。
2． 3 OA提取液对 SMMC-7721 细胞增值抑制作用
的形态学观察
实验设对照组、OA对照品组(40 μg /mL)和低、
中、高 3 个剂量(20，40，80 μg /mL)OA 提取液组。
各组细胞培养液中 RPMI 1640 的终浓度约为
0． 05%。取对数期的人肝癌 SMMC-7721 细胞株用
磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗 3 遍后，每瓶用 0． 25%胰
酶溶液 500 μL 消化，用含 10%胎牛血清的 RPMI
1640 培养液制成单细胞悬液，计数调节细胞为 3． 5
× 105 /mL，于 96 孔培养板中，每孔加入单细胞悬液
300 μL。2 h后，细胞贴壁后将培养基吸出，对照组
加入含 10%胎牛血清的 RPMI 1640 培养液 270 μL，
低、中、高剂量组加入浓度分别为 20，40，80 μg /mL的
OA提取液 270 μL /孔。每组均设 3个复孔，放入 CO2
培养箱中培养分别培养 24 h。观察细胞增殖情况。
OA对 SMMC-7721 细胞增值抑制作用见图 1。
与对照组人肝癌 SMMC-7721，细胞膜完整，细胞轮
廓清楚，形态饱满，细胞核大且呈深色，近似圆形透
亮。药物组，细胞呈不规则形状，并有尖端突起，细
胞核呈深褐色，可见白色圆形凋亡细胞，漂浮于培养
基表面，且随着药物浓度的增加，活细胞数量减少。
2． 4 OA提取液对 SMMC-7721 细胞增值抑制作用
的浓度依赖性实验
按 2． 3 项下方法培养细胞和分组，每组均设 3
个复孔，放入 CO2 培养箱中培养分别培养 24 h。每
孔加入 5 mg /mL MTT 溶液 30 μL，放回 CO2 培养
箱，2 h后将孔内液体吸走，每孔再加入 DMSO 150
μL，振荡 10 min。用酶标仪在波长 450 nm 处测定
吸光度(A)值。细胞抑制率 = 1 － (A加药 /A对照)×
100%，实验重复 2 次。测定 OA 对人肝癌 SMMC-
7721 细胞的增值抑制率。结果见表 1。
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A．对照组;B ～ D．分别为 OA提取液 20，40，80 μg /mL组;E． OA对照品组
A． Control group;B-D． OA 20，40，80 μg /mL group respectively;E． OA standard group
图 1 蛇莓中齐墩果酸对人肝癌 SMMC-7721 细胞的影响作用
Fig． 1 Effects of OA in Duchesnea indicae act on SMMC-7721 cells
表 1 24 h OA对人肝癌 SMMC-7721 细胞抑制作用(x ± s，n
= 3)
Tab． 1 Inhibitory effect of OA on SMMC-7721 cells prolifera-
tion in 24 h(x ± s，n = 3)
组 别
剂量
/(μg /mL)
A450
抑制率
/%
对照组 － 0． 789 ± 0． 008 －
OA对照品组 40 0． 245 ± 0． 0071 68． 95
OA提取液组 20 0． 659 ± 0． 008 16． 48
40
80
0． 395 ± 0． 0051
0． 087 ± 0． 0022
50． 06
88． 97
与对照组比较:1P ＜ 0． 05，2P ＜ 0． 01
Compared with control group:1P ＜ 0． 05，2P ＜ 0． 01
2． 5 OA提取液对 SMMC-7721 细胞增值抑制作用
的时间依赖性实验
按 2． 3 项下方法培养细胞，选择中剂量药物组，
设 3 个复孔，放入 CO2 培养箱中分别培养 12，24，48
h。每孔加入 5 mg /mL MTT 溶液 30 μL，放回 CO2
培养箱，2 h后将孔内液体吸走，每孔再加入 DMSO
150 μL，振荡 10 min。用酶标仪在波长 450 nm处测
定 A值，并计算抑制率，结果见表 2。
表 2 OA不同时间对人肝癌 SMMC-7721 细胞抑制作用(x
± s，n = 3)
Tab． 2 Inhibitory effect of OA act on SMMC-7721 cells prolif-
eration in different period(x ± s，n = 3)
组 别
时间
/h
剂量
/(μg /mL)
A450
抑制率
/%
对照组 12 － 0． 223 ± 0． 001 －
24 － 0． 789 ± 0． 008 －
48 － 1． 132 ± 0． 013 －
OA组 12 40 0． 402 ± 0． 005 － 80． 27
24 40 0． 395 ± 0． 0051 50． 06
48 40 0． 104 ± 0． 0082 90． 81
与对照组比较:1P ＜ 0． 05，2P ＜ 0． 01
Compared with control group:1P ＜ 0． 05，2P ＜ 0． 01
3 讨 论
OA提取液对 SMMC-7721 细胞增值抑制作用的
形态学观察试验中，实验各组加药后，我们分别用台
盼蓝染色，混匀后镜下观察，没有发现细胞变蓝，细
胞膜完整，细胞为正常细胞或凋亡细胞，说明 OA提
取液对 SMMC-7721 细胞没有细胞毒作用，而是抑制
作用。但其抑制作用机制不甚清楚，有待进一步
研究。
在作用 24 h时，OA对人肝癌 SMMC-7721 细胞
的抑制作用随着 OA 浓度的增加而增加，20 μg /mL
时对人肝癌 SMMC-7721 细胞有抑制作用，但不明
显，40 和 80 μg /mL时有明显的抑制作用，80 μg /mL
时细胞的存活率很低。OA对人肝癌 SMMC-7721 细
胞抑制作用具有时间依赖性，40 μg /mL 在 12 h 时
没有表现抑制作用，细胞还是表现为增殖，可能是时
间较短，药物作用没有发挥出来，具体原因需要进一
步探讨，24 h时抑制率达到 50%，48 h 存活率很低，
说明蛇莓中 OA 对人肝癌 SMMC-7721 细胞增殖有
明显的抑制作用。
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