全 文 ：北方园艺２０１６（１４）：９７～１０２ ·生物技术·
第一作者简介：刘小微（１９８８－），女，河北廊坊人，硕士研究生，研究
方向为植物分子生物学。Ｅ－ｍａｉｌ：１０３０７４２９６５＠ｑｑ．ｃｏｍ．
责任作者：李厚华（１９７３－），男，山东济宁人，博士，副教授，硕士生
导师，现主要从事植物基因工程和类黄酮次生代谢等研究工作。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｈｏｕｈｕａ７３＠１６３．ｃｏｍ．
基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｋ３０５０２１５１３０）；中央财政
林业推广资助项目（［２０１４］１５）。
收稿日期：２０１６－０３－１４
ＤＯＩ：１０．１１９３７／ｂｆｙｙ．２０１６１４０２４
ＡｍＡＳ１与Ａｍ４’ＣＧＴ基因双价载体
构建及在海棠花中的瞬时表达
刘 小 微１，李 厚 华１，王 冰 洁２，费 昭 雪２，阙 　 怡３
（１．西北农林科技大学 风景园林艺术学院，陕西 杨凌７１２１００；２．西北农林科技大学 林学院，陕西 杨凌７１２１００；
３．重庆大学 城市科技学院，重庆４０２１６７）
　　摘　要：以黄色金鱼草（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ　ｍａｊｕｓ）、“雪球”海棠（Ｍａｌｕｓ‘Ｓｎｏｗ　ｄｒｉｆｔ’）为试材，采用农
杆菌介导法，将构建的金鱼草素合酶基因（ａｕｒｅｕｓｉｄｉｎ　ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＡｍＡＳ１）和查尔酮４’－Ｏ－葡萄糖苷
转移酶基因（ｃｈａｌｃｏｎｅ　４’－Ｏ－ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，Ａｍ４’ＣＧＴ）双价表达载体在“雪球”活体花瓣上进
行瞬时表达，并通过高效液相色谱分析和基因表达分析对瞬时表达效果进行鉴定。结果表明：成
功构建双价表达载体ＣＧＴ－ＡＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２，农杆菌侵染“雪球”花苞后，花苞呈现淡黄色，表明目
的基因已在花瓣内转录并表达。高效液相色谱分析发现，侵染后的花苞出现新的吸收峰，进一步
确定花瓣内有橙酮物质的合成。
关键词：海棠；橙酮；双价载体；瞬时表达
中图分类号：Ｓ　６８１．９０３．６　文献标识码：Ａ　文章编号：１００１－０００９（２０１６）１４－００９７－０６
　　海棠在中国有悠久的栽培历史，是中国传统名花，
因其花色娇艳、婀娜多姿而著称，素有“花贵妃”“国艳”的
美称，深受人们的喜爱与重视［１］。但正如碧桃、樱花等
观赏花木一样，观赏海棠仅有白色系和红色系，缺少其
它花色，培育新花色来提高其观赏价值是当今研究的趋
势。目前草本植物主要采用杂交育种，通过杂交后多次
回交的方法获得优良品种，而木本植物运用传统杂交育
种周期过长［２］；另外其它花色植物并无与观赏海棠亲缘
关系较近的种类，因此传统杂交无法解决观赏海棠色系
单一的问题。而通过基因工程将外源色素合成相关基
因导入海棠植株内并高效表达，可以从根本上解决海棠
花色单一的问题。由于木本植物转基因稳定表达需要
的周期长，该试验采用外源基因在花器官中瞬时表达的
方法，不仅可以快速检验转基因效果，并能直接观察到
花色改变状况，以期为木本植物花色育种的快速检验提
供理论参考。
黄色花令人感觉温暖，充满能量，广受人们的喜爱。
近年来育种工作者为培育出新的黄色花品种，对黄色花
的形成机制进行了不断探索，为实现黄色花分子育种提
供了有益的借鉴。类胡萝卜素以及类黄酮中的查尔酮
和橙酮是黄色花色素的主要组成成分［３］，并且近年来对
这２类色素的相关酶和基因的研究也比较深入，其生物
合成途径已基本明确［４］。
金鱼草素合酶基因（ａｕｒｅｕｓｉｄｉｎ　ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＡｍＡＳ１）
和查尔酮４’－Ｏ－葡萄糖苷转移酶基因（ｃｈａｌｃｏｎｅ　４’－Ｏ－
ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，Ａｍ４’ＣＧＴ）是从金鱼草中克隆得到
的与黄色花色素－金鱼草素（橙酮类物质）合成相关的
２个关键基因［５－７］。有研究表明，在基因水平上对植物类
黄酮合成途径进行调控，将Ａｍ４’ＣＧＴ和ＡｍＡＳ基因转
入蓝色花夏堇并过量表达，同时结合ＲＮＡ干扰技术抑
制花青素合成，使夏堇开出明亮的黄色花成为可能［８］。
通过橙酮生物合成途径培育黄色花的育种技术可应用
到海棠花色育种上来。现用农杆菌介导法将这２个基
因转入白色花观赏海棠品种“雪球”中，使其诱导“雪球”
海棠中橙酮的合成，验证橙酮合成基因在海棠花中表达
的可行性，以期为后期的转基因试验及橙酮合成基因在
海棠花中的稳定表达奠定基础。
１　材料与方法
１．１　试验材料
供试黄色金鱼草（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ　ｍａｊｕｓ）鲜切花，购于
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·生物技术· 北方园艺２０１６（１４）：９７～１０２
杨凌阳光花卉公司；“雪球”海棠白色花苞采自西北农林
科技大学海棠园。
植物表达载体ＰＢＩ１２１、ｐＣａｍｂｉａ　１３０２、大肠杆菌
Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｔｏｐ１０、农杆菌ＥＨＡ１０５均为课题组培养并保存。
总ＲＮＡ提取试剂盒，为ＯＭＥＧＡ公司生产的Ｅ．Ｚ．Ｎ．
Ａ．Ｐｌａｎｔ　ＲＮＡ　Ｋｉｔ试剂盒。
１．２　试验方法
１．２．１　金鱼草Ａｍ４’ＣＧＴ和ＡｍＡＳ１基因克隆　选用
黄色花金鱼草呈现黄绿色的新鲜花苞，于液氮中研磨，
使用试剂盒提取总ＲＮＡ，并使用反转录试剂盒进行反转
录。参照ＧｅｎＢａｎｋ中金鱼草（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ　ｍａｊｕｓ）Ａｍ４’
ＣＧＴ（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ＮＯ．ＡＢ１９８６６５）和 ＡｍＡＳ１
（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ＮＯ．ＡＢ０４４８８４）基因编码区序列，设
计引物（表１）并进行ＰＣＲ扩增。将扩增产物分别连接
ｐＭＤ１９－Ｔ载体中，送测序公司进行测序，并对其基因序
列进行对比。
表１　 ＡｍＡＳ１和Ａｍ４’ＣＧＴ基因
全长引物序列
　　Ｔａｂｌｅ　１　Ｔｈｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｆｏｒ　ＡｍＡＳ１ａｎｄ
Ａｍ４’ＣＧＴａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ
引物名称
Ｐｒｉｍｅｒ
ｎａｍｅ
引物序列（下划线为引入酶切位点）
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｉｍｅｒｓ
（５′→３′）
ＰＣＲ产物全长
Ｔｈｅ　ｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ　ＰＣＲ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ／ｂｐ
ＣＧＴＦ
ＣＧＴＲ
ＣＧＴＧＧＡＴＣＣＴＡＴＧＧＧＡＧＡＡＧＡＡＴＡＣＡＡＧ （ＢａｍＨⅠ）
ＣＣＧＡＧＣＴＣＴＴＡＡＣＧＡＧＴＧＡＣＣＧＡＧＴ（ＳａｃⅠ）
１　３９２
ＡＳＦ
ＡＳＲ
ＧＧＡＡＧＡＴＣＴＡＡＴＧＴＴＣＡＡＡＡＡＴＣＣＴＡＡＴＡＴＣＣＧＣ （ＢｇｌⅡ）
ＣＧＧＧＴＡＡＣＣＧＣＡＴＴＡＧＣＣＡＴＣＡＡＧＣ （ＢｓｔＥⅡ）
１　７１４
１．２．２　Ａｍ４’ＣＧＴ 和ＡｍＡＳ１双价表达载体构建　
首先在ｐＣａｍｂｉａ　１３０２的多克隆位点上加入ｐＢＩ１２１
中携带３５Ｓ启动子和ＮＯＳ终止子的ＧＵＳ片段，得到
ＧＵＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２重组载体，再将 Ａｍ４’ＣＧＴ 和
ＡｍＡＳ１基因进行替换，构建ＣＧＴ－ＡＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２双
价表达载体（图１）。
注：Ａ．ＧＵＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２重组载体；Ｂ．Ａｍ４’ＣＧＴ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２重组载体；Ｃ．ＣＧＴ－ＡＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２重组载体。
Ｎｏｔｅ：Ａ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｖｅｃｔｏｒ　ＧＵＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２；Ｂ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｖｅｃｔｏｒ　Ａｍ４’ＣＧＴ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２；Ｃ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｖｅｃｔｏｒ　ＣＧＴ－ＡＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２
图１　ＣＧＴ－ＡＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２双价载体的构建
Ｆｉｇ．１　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｖｅｃｔｏｒ　ＣＧＴ－ＡＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２
１．２．３　瞬时表达系统检测　基因瞬时表达系统在
ＫＡＰＩＬＡ等［９］的农杆菌介导法瞬时表达的基础进行优
化。将ＧＵＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２重组质粒通过电击法转入农
杆菌ＥＨＡ１０５中，用于检测基因瞬时表达系统。将含重
组质粒的菌液过夜培养，吸取１００μＬ菌液于２０ｍＬ不
含抗生素的Ｙｅｐ液体培养基中活化２～４ｈ，温度２８℃，
转速为２００ｒ·ｍｉｎ－１，至ＯＤ６００值介于０．６～０．８。选择完
全变成白色的“雪球”花苞（小花苞带有粉色），先用吸满
活化菌液的注射器针头在花瓣表皮轻轻扎３～５个点，
将菌液慢慢涂于花瓣表面，然后再用经菌液浸湿的滤纸
覆在其表面，用一次性手套封住，２ｄ后回收花瓣。ＧＵＳ
染液检测：将回收的花瓣在ＧＵＳ染液中浸泡过夜，２５～
３７℃保温，观察花瓣是否变蓝。
１．２．４　目的基因的瞬时表达　通过电击法将ＣＧＴ－ＡＳ－
ｐＣａｍｂｉａ　１３０２转入农杆菌ＥＨＡ１０５中用于基因的表达，
ＡＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２、ＧＵＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２重组质粒作为对
照。该试验于“雪球”海棠初花期进行，选择完全变白的
大花苞。挑选３株花苞长势良好的“雪球”海棠，每株海
棠随机选择９簇“雪球”花苞，分为３组，分别用含ＣＧＴ－
ＡＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２、ＧＵＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２、ＡＳ－ｐＣａｍｂｉａ
１３０２的菌液进行侵染。侵染方法同１．２．３，重复３次。
瞬时表达２ｄ后收回花瓣，将表达样品放入冰箱保存，
用于后期检测。ＣＧＴ－ＡＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２－ＥＨＡ１０５和
ＡＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２－ＥＨＡ１０５菌液侵染的花瓣可用目测法
和ＰＣＲ进行检测，目测浸染后的“雪球”花瓣是否有黄色
显现。
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北方园艺２０１６（１４）：９７～１０２ ·生物技术·
１．３　项目测定
１．３．１　金鱼草素合成检测　随机选取３组经过瞬时
表达处理的“雪球”海棠花苞，从每组花苞中随机称取
花瓣０．５ｇ，加入液氮研磨，加入１．８ｍＬ酚提取液（甲
醇∶水∶甲酸＝７０∶２８∶２，４℃保存），充分混匀，２０℃
１　３００ｒ·ｍｉｎ－１离心１５ｍｉｎ，吸取上清液１ｍＬ经０．２２μｍ
滤膜过滤后，用高效液相色谱仪检测提取液在４０４ｎｍ
下的吸收峰出现时间，并与标样对比，检测是否有金鱼
草素合成。所用金鱼草标样由课题组提取制备，检测方
法借鉴ＺＨＡＮＧ等［１０］并稍作修改。
１．３．２　基因表达检测　分别取瞬时表达试验的不同处
理，用１．２．１中方法提取ＲＮＡ并反转录。利用Ａｍ４’ＣＧＴ
和ＡｍＡＳ１基因片段的特异性引物（表２）进行ＰＣＲ检
测，检测目的基因在花瓣中的表达情况。
表２ 基因表达检测的特异性引物序列
　　Ｔａｂｌｅ　２ Ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｆｏｒ
ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
引物名称
Ｐｒｉｍｅｒ　ｎａｍｅ
引物序列
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｉｍｅｒｓ（５′→３′）
ＰＣＲ产物全长
Ｔｈｅ　ｌｅｎｇｔｈ　ｏｆ　ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ／ｂｐ
ＡＳＰ１Ｆ
ＡＳＰ１Ｒ
ＣＣＧＡＣＡＡＴＡＣＣＡＣＴＡＣＴＣＣＴＧＡＡＧ
ＧＣＣＡＣＧＧＡＡＴＣＴＣＣＡＣＡＴＣＴ
４６２
ＣＧＴＰＦ
ＣＧＴＰＲ
ＡＣＡＣＣＡＡＡＣＴＧＴＴＣＧＴＧＧＡＧＡＣ
ＣＡＡＧＣＣＡＴＧＡＴＡＧＧＣＡＴＴＣＧ
３２９
２　结果与分析
２．１　金鱼草Ａｍ４’ＣＧＴ和ＡｍＡＳ１基因克隆
由图２可知，经ＰＣＲ扩增分别得到约１　３００ｂｐ和
１　７００ｂｐ的目的片段，将得到的目的片段分别连入
ｐＭＤ１９－Ｔ载体中进行测序。测序结果表明，２个基因的
序列与ＧｅｎＢａｎｋ中相对应已知序列完全匹配，表明基因
克隆成功，且得到克隆载体ＡＳ１－Ｔ和４’ＣＧＴ－Ｔ。
　　注：Ｍ．ＤＬ　２　０００Ｍａｒｋｅｒ；１．ＡｍＡＳ１基因ＰＣＲ产物；２．Ａｍ４’ＣＧＴ基因
ＰＣＲ产物。
Ｎｏｔｅ：Ｍ．ＤＬ　２　０００Ｍａｒｋｅｒ；１．Ｔｈｅ　ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＡｍＡＳ１；２．Ｔｈｅ
ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｍ４’ＣＧＴ．
图２　Ａｍ４’ＣＧＴ和ＡｍＡＳ１基因ＰＣＲ产物
Ｆｉｇ．２　ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ａｍ４’ＣＧＴａｎｄ　ＡｍＡＳ１
２．２　Ａｍ４’ＣＧＴ和ＡｍＡＳ１双价表达载体构建与鉴定
将ＧＵＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２和ＣＧＴ－Ｔ进行双酶切，选
择限制性内切酶为ＢａｍＨⅠ和ＳａｃⅠ。割胶回收ＧＵＳ－
ｐＣａｍｂｉａ　１３０２的１１　５００ｂｐ左右片段和ＣＧＴ－Ｔ的１　４００ｂｐ
左右片段，将所得基因片段过夜连接并转化大肠杆菌，
得到ＣＧＴ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２重组载体。
将ＣＧＴ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２和ＡＳ－Ｔ进行双酶切，选择限
制性内切酶为ＢｇｌⅡ和ＢｓｔＥⅡ。割胶回收ＣＧＴ－ｐＣａｍｂｉａ
１３０２的１２　０００ｂｐ左右长片段和ＡＳ－Ｔ的１　７００ｂｐ左右
短片段，将所得到的基因片段过夜连接，转入Ｔｏｐ１０感
受态细胞，得到ＣＧＴ－ＡＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２双价表达载体。
对转化载体分别用ＡＳ及ＣＧＴ的全长引物进行菌
液ＰＣＲ鉴定，所得条带与预期条带一致（图３）。将重组
质粒送公司测序，测序结果与预期一致，双价表达载体
ＣＧＴ－ＡＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２构建成功。
　　注：Ｍ．ＤＬ　２　０００Ｍａｒｋｅｒ；１．菌液ＰＣＲ　ＡｍＡＳ１产物；２．菌液ＰＣＲ
Ａｍ４’ＣＧＴ产物。
Ｎｏｔｅ：Ｍ．ＤＬ　２　０００Ｍａｒｋｅｒ；１．ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｆｒｏｍ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ
ＡｍＡＳ１；２．ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｆｒｏｍ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｍ４’ＣＧＴ．
图３　重组载体ＣＧＴ－ＡＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２菌液ＰＣＲ鉴定
Ｆｉｇ．３　ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｆｒｏｍ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｖｅｃｔｏｒ　ＣＧＴ－ＡＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２
２．３　瞬时表达系统检测
对ＧＵＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２－ＥＨＡ１０５菌液浸染的花瓣进
行ＧＵＳ染色试验，在ＧＵＳ染液中花瓣有蓝色显现（图
４），表明ＧＵＳ基因已成功转入花瓣细胞并表达。
图４　ＧＵＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２－ＥＨＡ１０５菌液
侵染花瓣ＧＵＳ染色结果
Ｆｉｇ．４　ＧＵＳ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｒｅｓｕｌｔ　ｉｎ　ｐｅｔａｌｓ
ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　ｔｈｅ　ＧＵＳｇｅｎｅ
２．４　Ａｍ４’ＣＧＴ和ＡｍＡＳ１的瞬时表达结果
用ＧＵＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２－ＥＨＡ１０５３、ＡＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２－
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·生物技术· 北方园艺２０１６（１４）：９７～１０２
ＥＨＡ１０５、ＣＧＴ－ＡＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２－ＥＨＡ１０５侵染“雪球”花
苞，进行瞬时表达，２ｄ后回收侵染花苞。通过目测观
察，自然生长的花苞、经过ＧＵＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２－ＥＨＡ１０５
和ＡＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２－ＥＨＡ１０５侵染的“雪球”花苞，花瓣
未出现颜色变化，而由ＣＧＴ－ＡＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２－ＥＨＡ１０５
菌液浸染的花瓣有浅黄色显现（图５）。
　　注：Ａ－１．正常生长花苞；Ａ－２．ＧＵＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２－ＥＨＡ１０５侵染花苞；Ａ－３．ＡＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２－ＥＨＡ１０５侵染花苞；Ａ－４．ＣＧＴ－ＡＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２－ＥＨＡ１０５
侵染花苞．Ｂ．低温处理３ｄ后，Ｂ－１．正常生长花苞，Ｂ－２．ＣＧＴ－ＡＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２－ＥＨＡ１０５侵染花苞。
Ｎｏｔｅ：Ａ－１．Ｔｈｅ　ｎｏｒｍａｌ　ｆｌｏｗｅｒ；Ａ－２．Ｔｈｅ　ｓａｍｐｌｅ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＧＵＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２－ＥＨＡ１０５；Ａ－３．Ｔｈｅ　ｓａｍｐｌｅ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＡＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２－ＥＨＡ１０５；Ａ－４．
Ｔｈｅ　ｓａｍｐｌｅ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＣＧＴ－ＡＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２－ＥＨＡ１０５．Ｂ－１．Ｔｈｅ　ｎｏｒｍａｌ　ｆｌｏｗｅｒ　ａｆｔｅｒ　３ｄａｙｓ　ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ；Ｂ－２．Ｔｈｅ　ｓａｍｐｌｅ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＣＧＴ－ＡＳ－ｐＣａｍｂｉａ
１３０２－ＥＨＡ１０５ａｆｔｅｒ　３ｄａｙｓ　ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．
图５　瞬时表达结果
Ｆｉｇ．５　Ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
　　注：Ａ．瞬时表达显淡黄色花苞提取液；Ｂ．正常生长花苞提取液。
Ｎｏｔｅ：Ａ．Ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｅｓｔ　ｓａｍｐｌｅ　ｗｈｉｃｈ　ｓｈｏｗｅｄ　ｆａｉｎｔ
ｙｅｌｏｗ；Ｂ．Ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｏｒｍａｌ　ｆｌｏｗｅｒｓ．
图６　瞬时表达ＨＰＬＣ色素分析
Ｆｉｇ．６　ＨＰＬＣ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
２．５　色素分析
取瞬时表达不同处理的花瓣以及自然生长未处理
的“雪球”花瓣提取液，经 ＨＰＬＣ检测的结果表明，在
４０４ｎｍ下，双价载体侵染显淡黄色的花瓣的提取液在
１７ｍｉｎ左右有明显的吸收峰，与标样出峰时间基本一
致，而在其它对照处理的花瓣和未经瞬时表达处理的花
瓣提取液中，均不存在这个吸收峰（图６）。推测该吸收
峰所代表的物质为橙酮类物质，说明Ａｍ４’ＣＧＴ 和
ＡｍＡＳ１　２个基因已经成功在海棠花中瞬时表达，并可能
诱导了橙酮类物质的合成。
　　注：Ｍ．ＤＬ　２　０００Ｍａｒｋｅｒ；１．模板Ｙ１用ＡＳＰ１Ｆ／ＡＳＰ１Ｒ引物扩增的
ＰＣＲ产物；２．模板Ｙ１用ＣＧＴＰＦ／ＣＧＴＰＲ引物扩增的ＰＣＲ产物；３．模板
Ｙ２用ＡＳＰ１Ｆ／ＡＳＰ１Ｒ引物扩增的ＰＣＲ产物；４．模板Ｙ２用ＣＧＴＰＦ／ＣＧＴＰＲ
引物扩增的ＰＣＲ产物；５．模板Ｙ３用ＡＳＰ１Ｆ／ＡＳＰ１Ｒ引物扩增的ＰＣＲ产
物；６．模板Ｙ３用ＣＧＴＰＦ／ＣＧＴＰＲ引物扩增的ＰＣＲ产物。
Ｎｏｔｅ：Ｍ．ＤＬ　２　０００ Ｍａｒｋｅｒ；１．ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｏｆ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　Ｙ１ｕｓｉｎｇ
ＡＳＰ１Ｆ／ＡＳＰ１Ｒｐｒｉｍｅｒｓ；２．ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｏｆ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　Ｙ１ｕｓｉｎｇ　ＣＧＴＰＦ／
ＣＧＴＰＲ　ｐｒｉｍｅｒｓ；３．ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｏｆ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　Ｙ２ｕｓｉｎｇ　ＡＳＰ１Ｆ／ＡＳＰ１Ｒｐｒｉｍｅｒｓ；
４．ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｏｆ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　Ｙ２ｕｓｉｎｇ　ＣＧＴＰＦ／ＣＧＴＰＲ　ｐｒｉｍｅｒｓ；５．ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ
ｏｆ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　Ｙ３ｕｓｉｎｇ　ＡＳＰ１Ｆ／ＡＳＰ１Ｒｐｒｉｍｅｒｓ；６．ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｏｆ　ｔｅｍｐｌａｔｅ　Ｙ３
ｕｓｉｎｇ　ＣＧＴＰＦ／ＣＧＴＰＲ　ｐｒｉｍｅｒｓ．
图７　瞬时表达ＰＣＲ结果
Ｆｉｇ．７　ＰＣＲ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ
２．６　基因表达分析
取瞬时表达处理后的花瓣，提取总ｍＲＮＡ并反转
录。利用ＡｍＡＳ１和Ａｍ４’ＣＧＴ基因片段的特异引物分
别对各处理的ｃＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增检测。由图７可
知，ＧＵＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２－ＥＨＡ１０５（模板 Ｙ１）无目标条
带，ＣＧＴ－ＡＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２－ＥＨＡ１０５（模板Ｙ２）菌液浸染
００１
北方园艺２０１６（１４）：９７～１０２ ·生物技术·
的花瓣中有ＡｍＡＳ１和Ａｍ４’ＣＧＴ２个基因的条带，ＡＳ－
ｐＣａｍｂｉａ　１３０２－ＥＨＡ１０５（模板Ｙ３）菌液浸染的花瓣中有
ＡｍＡＳ１基因的片段条带，说明２个基因已经在花瓣中
成功瞬时表达。
３　讨论
农杆菌渗入法介导的基因瞬时表达技术与农杆菌
浸染叶盘法的稳定遗传转化相比具有操作简便、周期短
等优点［１１－１２］。对于木本植物，其生长周期长，很难在短
时间内做到稳定表达并看到花色表现，而瞬时表达则是
一个简单高效的检测方法。试验中用ＧＵＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２－
ＥＨＡ１０５菌液侵染活体花瓣对瞬时表达系统进行检测，
ＧＵＳ染色结果表明所有花瓣均转化成功，说明该系统适
用于基因在“雪球”海棠花中的瞬时表达分析。
据ＯＮＯ等［８］的研究，植物体内橙酮合成需要２个
基因同时发挥作用，且Ａｍ４’ＣＧＴ和ＡｍＡＳ１基因在植
物细胞中的表达具有时空差异性。该试验对不同处理
样品中目的基因表达检测结果表明，单个ＡｍＡＳ１基因
转化或者将Ａｍ４’ＣＧＴＴ和ＡｍＡＳ１基因同时转化的处
理都已经将目的基因转入花瓣中并表达。ＨＰＬＣ检测
表明，当没有ＡｍＡＳ１和Ａｍ４’ＣＧＴ基因表达，或只有
ＡｍＡＳ１基因表达时，均未检测到橙酮类物质；只有在
４’ＣＧＴ和ＡｍＡＳ１基因同时表达时才诱导了橙酮类物质
的合成。不同处理花瓣颜色变化表明，橙酮积累导致花
瓣颜色变黄。而花瓣颜色变化不明显的原因可能是目
的基因在短时间内表达量过低，色素积累量较少，所以
肉眼观察到的黄色较浅。
另外，该试验在活体花苞上进行，由于春季温度、农
杆菌以及机械损伤的多重作用的影响，不允许试验处理
时间太长，否则花瓣会腐烂。所以在瞬时表达２ｄ后将
试验花苞取回，放在－８０℃冰箱低温保存。然而在低温
保存的过程中，发现低温保存３ｄ后用ＣＧＴ－ｐＣａｍｂｉａ
１３０２－ＥＨＡ１０５菌液浸染的花瓣和未处理花瓣对比，处理
花瓣黄色加深，这可能是由于在较低的温度下，依旧存
在基因表达和色素积累，而且低温下更容易诱导植物内
花色素苷的合成［１４］。
北方春季常见观花小乔木中缺乏黄色花品种，如樱
花、碧桃、梅花等。该试验在“雪球”海棠花中成功瞬时
表达出橙酮类物质，为下一步橙酮合成基因在海棠体内
的稳定表达及获得黄色花海棠奠定了基础，同时也可为
其它木本花卉的黄色花新品种培育提供借鉴。
参考文献
［１］　李厚华，赵冰，李鹏民．中国海棠［Ｍ］．北京：中国林业出版社，２０１４：１－１３．
［２］　高立旦，童再康，曹件生，等．彩叶木本植物育种研究进展［Ｊ］．浙江林
业科技，２００６，２６（４）：７７－８２．
［３］　ＴＡＮＡＫＡ　Ｙ，ＳＡＳＡＫＩ　Ｎ，ＯＨＭＩＹＡ　Ａ．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｐｉｇ－
ｍｅｎｔｓ：ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎｓ，ｂｅｔａｌａｉｎｓ　ａｎｄ　ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ［Ｊ］．Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ，２００８，
５４：７３３－７４９．
［４］　周琳，王雁，彭镇华．黄色花形成机制及基因工程研究进展［Ｊ］．林业
科学，２００９，４５（２）：１１１－１１９．
［５］　ＴＡＮＡＫＡ　Ｙ，ＯＮＯ　Ｅ，ＮＡＫＡＭＵＲＡ　Ｎ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
ｙｅｌｏｗ　ｆｌｏｗｅｒ　ｂｙ　ｃｏｎｔｒｏｌｉｎｇ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｐａｔｈｗａｙ：ＵＳ　７７５０２０９Ｂ２
［Ｐ］．Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｆｌｏｗｅｒ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　Ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ　Ｌｉｍｉｔｅｄ．
［６］　ＮＡＫＡＹＡＭＡ　Ｅ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ａｕｒｏｎｅ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉ－
ｏｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００２，９４（６）：４８７－４９１．
［７］　ＮＡＫＡＹＡＭＡ　Ｔ，ＳＡＴＯ　Ｔ，ＦＵＫＵＩ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ
ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ａｕｒｏｎｅ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｃａｔａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ａｕｒｅｕｓｉｄｉｎ　ｓｙｎｔｈａｓｅ，ａｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ
ｏｘｉｄａｓｅ　ｈｏｍｏｌｏｇ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ　ｆｏｒ　ｆｌｏｗｅｒ　ｃｏｌｏｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００１，４９９
（１－２）：１０７－１１１．
［８］　ＯＮＯ　Ｅ，ＦＵＫＵＣＨＩ－ＭＩＺＵＴＡＮＩ　Ｍ，ＮＡＫＡＭＵＲＡ　Ｎ，ｅｔ　ａｌ．Ｙｅｌｏｗ
ｆｌｏｗｅｒｓ　ｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｂｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｕｒｏｎｅ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｐａｔｈｗａｙ［Ｊ］．
Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ
Ａｍｅｒｉｃａ，２００６，１０３（２９）：１１０７５－１１０８０．
［９］　ＫＡＰＩＬＡ　Ｊ，ＲＹＣＫＥ　Ｒ　Ｄ，ＭＯＮＴＡＧＵ　Ｍ　Ｖ，ｅｔ　ａｌ．Ａｎ　ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｉｎｔａｃｔ　ｌｅａｖｅｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，
１９９７，１２２：１０１－１０８．
［１０］ＺＨＡＮＧ　Ｙ　Ｚ，ＬＩ　Ｐ　Ｍ，ＣＨＥＮＧ　Ｌ　Ｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｃａｒｂｏ－
ｈｙｄｒａｔｅｓ，ｏｒｇａｎｉｃ　ａｃｉｄｓ，ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ，ａｎｄ　ｐｈｅｎｏｌｉｃ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　ｉｎ‘Ｈｏｎｅｙｃｒｉｓｐ’
ａｐｐｌｅ　ｆｌｅｓｈ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１０，１２３：１０１３－１０１８．
［１１］宋建，刘仲齐．农杆菌介导的基因瞬时表达技术及其应用［Ｊ］．天津农
业科学，２００８，１４（１）：２０－２２．
［１２］邱礽，陶刚，李奇科，等．农杆菌渗入法介导的基因瞬时表达技术及
应用［Ｊ］．分子植物育种，２００９，７（５）：１０３２－１０３９．
［１３］ＮＡＫＡＹＡＭＡ　Ｔ，ＹＯＮＥＫＵＲＡ－ＳＡＫＡＫＩＢＡＲＡ　Ｋ，ＳＡＴＯ　Ｔ，ｅｔ　ａｌ．
Ａｕｒｅｕｓｉｄｉｎ　ｓｙｎｔｈａｓｅ：Ａ　ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ　ｏｘｉｄａｓｅ　ｈｏｍｏｌｏｇ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ　ｆｏｒ　ｆｌｏｗｅｒ
ｃｏｌｏｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，２９０（５４９４）：１１６３－１１６６．
［１４］ＯＲＥＮ　Ｓ　Ｍ，ＬＥＶＩ　Ｎ　Ａ．Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｅｆｅｃｔ　ｏｎ　ｌｅａｆ　ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ
Ｃｏｔｉｎｕｓ　ｃｏｇｇｙｇｒｉ‘Ｒｏｙａｌ　Ｐｕｒｐｌｅ’［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，
７２：４２５－４３２．
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｖｅｃｔｏｒ　ｏｆ　ＡｍＡＳ１　ａｎｄ　Ａｍ４’ＣＧＴＧｅｎｅｓ　ａｎｄ
ｔｈｅ　Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｍａｌｕｓ　Ｆｌｏｗｅｒｓ
ＬＩＵ　Ｘｉａｏｗｅｉ　１，ＬＩ　Ｈｏｕｈｕａ１，ＷＡＮＧ　Ｂｉｎｇｊｉｅ２，ＦＥＩ　Ｚｈａｏｘｕｅ２，ＱＵＥ　Ｙｉ　３
（１．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌａｎｄｓｃａｐｅ　Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ａｒｔｓ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ　７１２１００；２．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ
Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ　７１２１００；３．Ｃｉｔｙ　Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ　４０２１６７）
１０１
·生物技术· 北方园艺２０１６（１４）：１０２～１０５
第一作者简介：李景蕻（１９６７－），男，博士，副教授，研究方向为药用
植物学与园艺学。Ｅ－ｍａｉｌ：１５５２７６０８２６７＠１６３．ｃｏｍ．
基金项目：湖北第二师范学院建设资助项目。
收稿日期：２０１６－０３－２６
ＤＯＩ：１０．１１９３７／ｂｆｙｙ．２０１６１４０２５
不同处理对三种药用植物外植体生长发育的影响
李 景 蕻，叶 春 宇，马 维 波，王 春 云
（湖北第二师范学院 化学与生命科学学院，湖北 武汉４３０２０５）
　　摘　要：以红豆杉、无花果、大叶黄杨的植物茎段为外植体，研究了不同浓度琼脂与不同灭菌
时间处理对３种药用植物外植体褐化、污染及发芽情况的影响。结果表明：随着琼脂浓度的升
高，褐化率、褐化等级、污染率和发芽率均呈下降趋势；综合各项指标分析，以琼脂浓度１０ｇ·Ｌ－１
效果较好。随灭菌时间增加，褐化率、褐化等级上升，但污染率、发芽率均急剧下降，综合各项指
标分析，以灭菌时间５～１０ｍｉｎ的处理效果较好。
关键词：琼脂浓度；灭菌时间；外植体；褐化；污染率；发芽率
中图分类号：Ｒ　２８２．７１　文献标识码：Ａ　文章编号：１００１－０００９（２０１６）１４－０１０２－０４
　　红豆杉（Ｔａｘｕｓ　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ（Ｐｉｌｇｅｒ）Ｒｅｈｄ．）属红豆杉
属植物，又名紫杉，是濒临灭绝的古老孑遗树种。用红
豆杉植物中提取的紫杉醇（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）制备的抗癌药物
Ｔａｘｏｌ，是治疗肺癌、卵巢癌、乳腺癌的一线临床用药，且
对恶性黑色素瘤、头颈部肿瘤、白血病、结肠癌等也有明
显疗效［１－３］。红豆杉是世界公认的天然珍稀抗癌植物，
应用人工繁殖方法是解决红豆杉资源短缺、加快红豆杉
药用林建设最有效的途径之一［４］。红豆杉组培具有可
以人为控制、生长周期短、繁殖率高、方便管理、便于自
动化操作等优点［５－６］。大叶黄杨（Ｅｕｏｎｙｍｕｓ　ｊａｐｏｎｚｃｕｓ
Ｔｈｕｎｂ．）属卫矛科，为南方常见栽培植物，既可观赏又可
入药，民间常以茎皮及枝叶采收晒干备用。据《中华本
草》记载，性味苦、辛、微温；具有祛风温、强筋骨、活血止
血之功效。利用组织培养技术，可分批分期进行扩大繁
殖，缓解苗木供求紧张状况，以保证苗木的周年供应，可
在短期内获得大量的脱毒优质苗［７］。通过组织培养建
立大叶黄杨无性繁殖体系是获得高产高质最有效的途
　　　　　　
径。无花果（Ｆｉｃｕｓ　ｃａｒｉｃａ　Ｌ．）属桑科榕树属落叶灌木或
小乔木，现代药理研究发现，其果实具有健胃清肠、消肿
解毒、抗肿瘤、降压、轻泻、催乳、助消化等药用价值。植
物组织培养是快速繁殖、加大栽培规模的重要方法，但
是外植体出现褐化及污染是导致组培失败的最主要原
因，故防止外植体褐化及污染显得尤其重要［８－９］。
现以红豆杉、无花果、大叶黄杨的茎段为外植体，在
不同琼脂浓度、不同灭菌时间处理下进行外植体褐化、
污染及发芽情况的研究，以期为药用植物优质种苗生产
提供技术支撑。
１　材料与方法
１．１　试验材料
供试材料为湖北第二师范学院校园及苗圃内种植
的红豆杉、无花果、大叶黄杨的植物茎段。将选取的外
植体剪去叶片、保留叶柄，用自来水冲洗干净后，在超净
工作台上将其剪成１０ｃｍ长带腋芽的茎段，放入经高温
灭菌的瓶中，加入７５％的酒精浸摇３０ｓ，倒出酒精，然后
用０．１％的升汞溶液消毒８～１０ｍｉｎ，用无菌水冲洗５次，
待接种。诱导芽分化，以 ＭＳ为基本培养基，加入激素
６－ＢＡ　１ｍｇ·Ｌ－１＋ＮＡＡ　０．２ｍｇ·Ｌ－１，再向其中加入蔗糖
２０ｇ，制成固体培养基，用圆形培养瓶分装，每瓶３０ｍＬ，
灭菌后备用

。
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔａｋｉｎｇ　Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ　ｍａｊｕｓ　ａｎｄ　Ｍａｌｕｓ‘Ｓｎｏｗ　ｄｒｉｆｔ’ａｓ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ，ｕｓｉｎｇ　ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｖｅｃｔｏｒ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ａｍ４’ＣＧＴａｎｄ　ＡｍＡＳ１ｗａｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　Ｍａｌｕｓ　ｆｌｏｗｅｒｓ，ｔｈｅ　ｉｎｓｔａｎｔａｎｅｏｕｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｅｆｅｃｔ　ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ＨＰＬＣ　ａｎｄ　ＰＣＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｖｅｃｔｏｒ　ＣＧＴ－ＡＳ－ｐＣａｍｂｉａ　１３０２
ｗａｓ　ｂｕｉｌｔ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙ，ａｆｔｅｒ　ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＥＨＡ１０５，ｔｈｅ　Ｍａｌｕｓｆｌｏｗｅｒｓ　ａｐｐｅａｒｅｄ　ｔｏ　ｂｅ　ｌｉｇｈｔ　ｙｅｌｏｗ，ａｎｄ　ｉｔ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ
ｔａｒｇｅｔ　ｇｅｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　Ｍａｌｕｓ　ｆｌｏｗｅｒｓ．Ａ　ｎｅｗ　ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｐｅａｋ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｂｙ　ＨＰＬＣ　ａｎａｌｙｓｉｓ，ｔｈｅ
ｒｅｓｕｌｔ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ａｕｒｏｎｅｓ　ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｃｒａｂａｐｐｌｅ；ａｕｒｏｎｅｓ；ｂｉｖａｌｅｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ；ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
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