全 文 ：盐胁迫对菘蓝基因组 DNA甲基化的影响
杨 飞1，聂 浩1，徐延浩2*
(1. 长江大学医学院，湖北 荆州 434025;2. 长江大学农学院长江中游湿地农业教育部工程研究中心，湖北
荆州 434025)
摘要 目的:分析盐胁迫对菘蓝基因组 DNA甲基化模式的影响。方法:采用甲基化敏感扩增多态性(methyla-
tion sensitive amplification polymorphism，MSAP)方法。结果:使用 15 对 MSAP选择性引物对盐胁迫前后菘蓝基因组
进行甲基化敏感多态性扩增，共得到 632 条清晰的带纹。共检测到菘蓝基因组 44(6. 9%)个 CCGG 位点在盐胁迫
后发生了甲基化状态的改变，其中 31(4. 9%)个位点发生了超甲基化，13(2. 0%)个位点发生了去甲基化。结论:
盐胁迫能引发菘蓝基因组 CCGG位点甲基化模式的改变。
关键词 菘蓝;盐胁迫;DNA甲基化;甲基化敏感扩增多态性
中图分类号:Ｒ282. 6 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2013)04-0515-04
Effect of Salt Stress on DNA Methylation in Isatis indigotica
YANG Fei1，NIE Hao1，XU Yan-hao2
(1. College of Medicine，Yangtze University，Jingzhou 434025，China;2. Engineering Ｒesearch Center of the MOE for Wetland Agricul-
ture in the Middle Ｒeaches of the Yangtze Ｒiver，College of Agriculture，Yangtze University，Jingzhou 434025，China)
Abstract Objective:To investigate the effect of salt stress on DNA methylation in Isatis indigotica. Methods:Methylation sensitive
amplification polymorphism(MSAP)approach was used in this study. Ｒesults:By using 15 pairs of selective primers combinations，a to-
tal of 632 MSAP bands were obtained in Isatis indigotica genome under salt stress. In all，44(6. 9%)CCGG sites displayed cytosine
methylation changes under salt stress. Among these sites，31(4. 9%)CCGG sites underwent hypermethylation changes and 13(2. 0%)
CCGG sites underwent demethylation changes. Conclusion:This result provides evidence for DNA methylation remodeling occurring im-
mediately after salt stress affects Isatis indigotica.
Key words Isatis indigotica Fort.;Salt stress;DNA methylation;Methylation sensitive amplification polymorphism(MSAP)
收稿日期:2012-10-15
基金项目:教育部高等学校博士学科点专项科研基金(20114220120003，20114220120005);湖北省自然科学基金(2012FFB00104);湖北省
教育厅科研项目(Q20111307)
作者简介:杨飞(1980-)，女，博士，讲师，研究方向:药用植物分子生物学;Tel:0716-8488255，E-mail:yfwhu@ 163. com。
* 通讯作者:徐延浩，Tel:0716-8066652，E-mail:xyh09@ yangtzeu. edu. cn。
板蓝根是常用的清热解毒类中药，其主要来源
为十字花科植物菘蓝 Isatis indigotica Fort. 的干燥
根，在全国范围内每年药材消耗量一直居于前几
位〔1〕。药材的品质是中药疗效的基础，中药材品质
形成的分子基础是中药材现代化的关键课题之一。
对药材品质形成的遗传、居群结构分化及产地和生
境学等方面的研究表明，药材的表型是由自身基因
型与所处的环境相互作用(生境饰变)的产物〔2-4〕。
已有很多研究表明如土壤理化状态、无机元素、温
度、光照等环境生态因子对道地药材的形成起到了
重要的作用。郭兰萍等〔5，6〕研究发现，苍术道地药
材的形成中受到缺钾及高温胁迫。黄璐琦等〔3〕提
出了道地药材形成的逆境效应理论。
表观遗传是指在 DNA 序列不改变的情况下发
生的可遗传的基因表达改变，DNA 甲基化是表观遗
传修饰的一种方式。DNA 甲基化为中药材年龄测
定、栽培和野生型鉴定提供了重要依据〔7〕。已有很
多证据表明 DNA 甲基化参与了植物环境胁迫适应
性机制〔8〕。盐胁迫是否会引起菘蓝基因组表观遗
传的变化，笔者目前尚未见相关研究报道。
本研究利用甲基化敏感扩增多态性(methyla-
tion sensitive amplification polymorphism，MSAP)技
术，研究菘蓝全基因范围 CCGG 位点 DNA甲基化对
盐胁迫的应答，为中药材对逆境应答的分子基础研
究提供更多参考。
1 材料与仪器
1. 1 材料 菘蓝(Isatis indigotica Fort. ，2n = 14)
原种由第二军医大学张汉明教授鉴定为十字花科植
物菘蓝 Isatis indigotica Fort. 的干燥种子。用自来水
将种子冲洗干净，70%乙醇消毒 30 s，0. 1% HgCl2处
理 3 min，然后用蒸馏水洗 4 次;在蒸馏水中浸泡 5 h
后，置于培养皿湿润滤纸上，并在 24 ℃ 的恒温培养
箱中黑暗条件下萌发 5 d后进行光照培养。培养箱
温度设置 25 /20 ℃(白天 /晚上)，光照时间为 12 h，
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DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2013.04.005
使用 1 /8 Hoagland溶液作为培养液。材料培养 30 d
后，进行盐胁迫处理。盐胁迫处理为在 1 /8 Hoag-
land溶液中添加 100 mmol /L NaCl，其他培养条件不
变，胁迫处理 10 d。
1. 2 试剂 HpaⅡ、MspⅠ、EcoＲⅠ、T4 DNA 连接
酶购自 NEB公司;Taq 酶购自 Fermentas 公司;所用
引物及接头序列委托南京金斯瑞生物科技公司合
成;乙醇、冰乙酸、无水碳酸钠(均为分析纯)购自上
海国药集团;其他分子生物学试剂购自武汉生命技
术有限公司，为进口分装。
1. 3 仪器 台式冷冻离心机(德国 Eppendorf
5804Ｒ);垂直电泳槽(北京君意 JY-CX2B)。
2 方法
2. 1 基因组 DNA的提取 盐胁迫处理结束后，取
对照和盐胁迫菘蓝叶片，用 CTAB 法(2% CTAB
m/V，100 mmol /L Tris-HCl pH 8. 0，20 mmol /L EDTA
pH 8. 0，2. 8 mol /L NaCl)提取基因组 DNA。粗提的
DNA加入 ＲNAase A消化过夜，用酚-氯仿-异戊醇(25
∶ 24∶ 1)抽提后用氯仿-异戊醇(24∶ 1)抽提 1 ～ 2 次，用
无水乙醇沉淀 DNA。DNA干燥后溶于 TE溶液。
2. 2 MSAP的酶切与连接 双酶切反应体系总体
积 20 μL，其中 DNA 400 ng、10 × NEB buffer 2 μL、
HpaⅡ 20 U 或 MspⅠ 10 U、EcoＲⅠ 10 U、100 ×
BSA(10 mg /mL)0. 2 μL。37 ℃水浴 5 h，75 ℃ 10
min中止反应。双酶切反应体系中加入 EcoＲⅠ接
头 5 pmol、HpaⅡ /MspⅠ接头 50 pmol(表 1)、T4
DNA连接酶 1 μL(NEB)、ATP 1 mmol /L。14 ℃ 水
浴 12 h，75 ℃ 10 min中止反应。
2. 3 MSAP 的预扩增、选择性扩增和电泳 预扩
增使用 50 ng(3 μL)酶切连接产物作为模板，25 μL
PCＲ 反应体系含有 0. 2 μmol /L EcoＲⅠ和 HpaⅡ /
MspⅠ预扩增引物(EcoＲⅠ + 0，HpaⅡ /MspⅠ + 0)
(表 1)、1 × PCＲ buffer、1. 5 mmol /L MgCl2、0. 2
mmol /L dNTP、2 U Taq酶(Fermentas)。PCＲ 扩增程
序为 94 ℃ 3 min;然后 94 ℃ 30 s，56 ℃ 40 s，72 ℃
60 s共 23 个循环;72 ℃ 延伸 10 min。预扩产物用
0. 1 × TE溶液稀 20 倍，取 1 μL作为选择扩增的模
板 DNA。选择性扩增引物对采用 EcoＲⅠ + 3 个选
择性碱基和 HpaⅡ /MspⅠ + 3 个选择性碱基组成
(表 1)。选择性扩增 PCＲ 反应体系和预扩增 PCＲ
反应体系相同。PCＲ 扩增程序为 94 ℃ 60 s，接下
来94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，每个循环退火
温度降低 0. 7 ℃，执行 12 个循环;接着在 94 ℃ 30
s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s 扩增 23 个循环;最后 72 ℃
延伸 10 min。选择性扩增产物加入等体积甲酰胺变
性加样液(98%甲酰胺，10 mmol /L EDTA，0. 025%
m/V 溴酚蓝和二甲苯青-FF)95 ℃变性 5 min，迅速
置于冰上。变性的 PCＲ产物用 6%的变性聚丙烯酰
胺凝胶(含 7. 5 mol /L尿素)65 W 恒功率电泳 2 h。
PAGE胶的银染程序参照文献〔9〕的方法。
表 1 MSAP分析所用接头、引物序列及选择性引物组合
接头 /引物 序列(5-3)/ 选择性引物组合
EcoＲⅠ接头Ⅰ CTCGTAGACTGCGTACC
EcoＲⅡ接头Ⅱ AATTGGTACGCATAC
HpaⅡ /MspⅠ接头Ⅰ GATCATGAGTCCTGCT
HpaⅡ /MspⅠ接头Ⅱ CGAGCAGGACTCATGA
预扩引物(EcoＲⅠ + 0，HpaⅡ /MspⅠ + 0)EcoＲⅠ预扩引物 GACTGCGTACCAATTC
HpaⅡ /MspⅠ预扩引物 ATCATGAGTCCTGCTCGG
选择性引物组合(EcoＲⅠ + 3，HpaⅡ /MspⅠ + 3)
HpaⅡ /MspⅠ + ATC EcoＲⅠ + TAC，EcoＲⅠ + TAG，EcoＲⅠ + TCA，EcoＲⅠ + TCT，EcoＲⅠ + TGT
HpaⅡ /MspⅠ + ACT EcoＲⅠ + TAC，EcoＲⅠ + TAG，EcoＲⅠ + TCA，EcoＲⅠ + TCT，EcoＲⅠ + TGT
HpaⅡ /MspⅠ + CTT EcoＲⅠ + TAC，EcoＲⅠ + TAG，EcoＲⅠ + TCA，EcoＲⅠ + TCT，EcoＲⅠ + TGT
2. 4 MSAP 数据统计 为保证结果的真实可靠，
每个样本进行 2 次重复实验。重复实验从 DNA 样
品双酶切开始，然后进行预扩增-选择性扩增-PAGE
胶电泳-条带统计。只选取重复试验一致性强的引
物组合所扩增的条带进行统计分析。每次实验都设
置无 DNA模板的阴性对照，避免样品的污染或引物
二聚体扩增而得到的假条带。仅选择 PAGE胶中部
分辨率高的条带统计，对于顶部和底部分辨率低的
条带不进行统计。按照 PAGE胶上同一水平位置上
条带的有无进行统计，有条带的记为“1”，无条带的
·615· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 4 期 2013 年 4 月
记为“0”，获得原始“0-1”矩阵。对“0-1”矩阵进行
分析，得出盐胁迫前后基因组 DNA甲基化状态的差
异。
3 结果与分析
菘蓝 MSAP带纹模式见图 1。根据 MSAP 带纹
模式在盐胁迫前后的对应关系，MSAP 带纹模式可
以分为 2 个大类(见表 2)。第 1 类是没有发生 DNA
甲基化改变的，这一类带纹可以进一步分为未甲基
化位点，单链外侧甲基化位点和双链内侧甲基化位
点 3 个类型(A1 ～ A3)。第 2 类是盐胁迫前后带纹
模式发生改变，即 DNA 甲基化状态发生改变，DNA
甲基化状态改变的类群又可以进一步分为发生超甲
基化(Hypermethyation)的位点(H1 ～ H4)和发生去
甲基化(Demethylation)的位点(D1 ～ D4)。15 对
MSAP选择性引物组合共扩增得到 632 条清晰的条
带(表 2)，其中 454 个 CCGG 位点未发生甲基化的
修饰(A1)，27 个位点发生了单链外侧甲基化(A2)，
107 个位点发生了双链内侧甲基化(A3)，这些位点
在盐胁迫前后 DNA 甲基化状态没有发生改变。共
检测到 44(6. 9%)个 CCGG位点在盐胁迫后发生了
甲基化状态的改变，其中 31(4. 9%)个位点发生了
超甲基化(H1 ～ H4)，13(2. 0%)个位点发生了去甲
基化(D1 ～ D4)。H1 类群是发生 DNA 超甲基化改
变的主要类群，占到了超甲基化改变的 87. 1%。去
甲基化改变的主要类群是 D3，占到了去甲基化改变
的 46. 2%。此外，共检测到 5 个 CCGG 位点发生双
链内侧甲基化(H2 和 D1)的改变，1 个 CCGG 位点
发生单链外侧甲基化(D2)变化的位点。由此可见，
盐胁迫能引发菘蓝基因组 DNA甲基化模式的改变，
且存在着主要的 DNA甲基化模式的改变类型。
图 1 菘蓝MSAP带纹模式图
表 2 盐胁迫前后菘蓝基因组 DNA甲基化模式比较
类型
MSAP带型
对照
HpaⅡ MspⅠ
盐胁迫
HpaⅡ MspⅠ
甲基化改变
甲基化无变化 A1 + + + + 454
A2 + － + － 27
A3 － + － + 107
甲基化改变 H1 + + － － 27 Hyper-
H2 + + － + 2 Hyper-
H3 － + － － 1 Hyper-
H4 + － － － 1 Hyper-
D1 － + + + 3 De-
D2 + － + + 1 De-
D3 － － + + 6 De-
D4 － － + － 3 De-
注:“ +”代表有带，“ －”代表无带;“HpaⅡ”代表 EcoＲⅠ-HpaⅡ酶切;“MspⅠ”代表 EcoＲⅠ-MspⅠ酶切;“Hyper-”代表超甲基化;“De-”代
表去甲基化
4 讨论
4. 1 DNA甲基化修饰是调控基因表达的一种重
要方式〔10〕。研究发现，各种环境胁迫都能导致植物
基因组发生 DNA甲基化模式、组蛋白共价修饰的改
变，调节一些基因的转录。表观遗传能赋予基因组
一定的“可塑性”，是生物体对环境应答的基础，特
别是在植物逆境胁迫适应性机制中，表观遗传调控
机制具有重要意义。研究表明，生物和非生物胁迫
能导致植物基因组发生 DNA 甲基化模式发生改
变〔8-10〕。这说明 DNA甲基化使植物在 DNA 水平缓
·715·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 4 期 2013 年 4 月
冲了环境变化对他们的影响，而基因组的超甲基化
可能是植物适应非生物胁迫机制的一部分。
4. 2 目前，环境生态因子是通过什么途径影响基
因表达的网络调控系统和中药材药效成分生成和积
累尚不清楚。本研究虽然发现盐胁迫能改变菘蓝基
因组 CCGG位点 DNA甲基化的状态，但对于盐胁迫
下菘蓝基因 DNA 甲基化的变化究竟影响了哪些基
因的表达还需要进一步的研究。随着高通量测序技
术的进步，后续可以利用 ChIP-Seq 和亚硫酸盐测序
法，在全基因组水平上对盐胁迫后菘蓝基因组 DNA
甲基化改变的位点进行测序和转录分析，确定他们
的生物学功能。同时，结合代谢组学的数据，深入比
较盐胁迫对板蓝根品质的影响，才能进一步探讨表
观遗传修饰是如何参与了道地药材形成的逆境效应
理论。
参 考 文 献
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绶草栽培繁殖试验探索
黄明远1，范 晶1，刘晓捷1，刘忠和1，祝世杰2
(1. 乐山师范学院生命科学学院，四川 乐山 614000;2. 成都中医药大学峨嵋学院，四川 峨嵋 614004)
摘要 目的:探索濒临灭绝植物绶草适宜的繁殖途径。方法:观察发现乐山地区绶草繁殖生长与早熟禾、狗牙
根、狗尾草等植物具亲和伴生关系，应用于栽培试验。结果:在 6 670 m2 人工栽培草坪上繁殖出大量半野生长势良
好的绶草植株，在 300 m2 试验地栽培出生长健壮的绶草植株。结论:草坪半野生栽培方式繁殖绶草是切实可行的，
家种绶草 2 年可达到商品规格。
关键词 绶草;濒临灭绝;半野生;家种;繁殖
中图分类号:Ｒ282. 2 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2013)04-0518-04
收稿日期:2012-08-28
基金项目:乐山师范学院峨眉山动植物资源保护与利用重点实验室项目(11S03)
作者简介:黄明远(1956-)，男，高级实验师，研究方向:药用植物栽培及植保;Tel:15884379092，E-mail:huangmy@ lsnu. edu. cn。
绶草 Spiranthes sinensis(Pers. )Ames 为兰科绶
草属多年生植物，在原国家林业部颁布的《野生植
物保护名录》中，被列为国家二级保护植物，又被列
为国际濒危植物〔1〕。绶草具滋阴凉血、益气生津、
补气助阳、清热解毒、消肿散结之功效。临床上用于
病后身体虚弱、气血亏损、眩晕虚脱、阴虚内热、疮疡
肿毒、神经衰弱、肾虚腰痛、遗精早泄等。还用于糖
尿病等疾病的治疗〔2〕。现代药理研究表明，绶草对
S180肉瘤有较明显的抑制作用
〔3〕，对肝癌细胞等有一
定毒性〔4〕，具良好的抗癌开发前景。
·815· Journal of Chinese Medicinal Materials 第 36 卷第 4 期 2013 年 4 月