全 文 ：新疆梨 PsSFBB基因克隆及其生物信息学分析
徐胜利1，2，陈小青1，2，林敏娟1，2，王江波1，2，包建平1，2，梁郸娜1，2，王晶晶1，2，田贝贝1，2 (1．塔里木大学园艺研
究所园艺植物遗传改良实验室，新疆阿拉尔 843300;2．塔里木大学科技部省部共建果树资源与遗传育种实验室，新疆阿拉尔 843300)
摘要 ［目的］对新疆梨 PsSFBB基因进行克隆，并对其进行生物信息学分析。［方法］以新疆梨品种棋盘梨的花药为材料，利用 RT-PCR
和 RACE 技术对其 PsSFBB基因进行克隆，并对克隆出的基因进行生物信息学分析。［结果］试验克隆到了一个全长为 1 231 bp 的 PsS-
FBB-α基因(Genbank 登录号为 EU909687)，命名为 PsSFBB6-α。该基因编码378 个氨基酸，在 N末端含有一个约50个氨基酸组成的 F-
box 基序。经生物信息学分析，推测 PsSFBB6-α蛋白的分子式为 C2000H3034N517O558S23，相对分子质量为44 987． 5，等电点为6． 02，二级结构
以 α 螺旋为主;理论推导半衰期大约为 30 h，不稳定参数为 55． 21，属于不稳定蛋白;并且推测此蛋白为亲水性、非分泌型蛋白，在基质内
起裂合酶的作用，特异性的识别底物，正好吻合了 F-box 蛋白的作用。［结论］为进一步研究 SFBB蛋白和自交不亲和机理奠定了基础，
也为新疆梨自交亲和品种的选育和生产中科学配置授粉树以提高产量和品质提供理论了依据。
关键词 棋盘梨;自交不亲和;SFBB6-α基因;生物信息学
中图分类号 S661． 2 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2012)03 －01296 －04
Cloning and Bioinformatics Analysis of PsSFBB Gene in Xinjiang Pear
XU Sheng-li et al (Laboratory of Horticultural Plant Genetic Improvement，Horticultural Research Institute，Tarim University，Alar，843300)
Abstract ［Objective］This study aimed to clone the PsSFBB gene from Xinjiang pear for bioinformatics analysis． ［Method］PsSFBB gene
was cloned from anthers of Qipan pear by using RT-PCR and RACE technologies for bioinformatics analysis． ［Result］A SFBB gene with a
full-length of 1 231 bp was cloned and named PsSFBB6-α (Genbank accession number:EU909685)． PsSFBB6-α gene encoded a protein of
378 amino acids，with an F-box motif composed of about 50 amino acids in the N-terminal． According to the bioinformatics analysis，the mo-
lecular formula of PsSFBB6-α protein was C2000H3034N517O558 S23，with relative molecular mass of 43 987． 5 and isoelectric point of 6． 02，and
the secondary structure was dominated by α-helices;theoretically，the half life period was 30 h and the instability parameter was 55． 21，so
PsSFBB6-α protein was an instable protein;in addition，it was predicted that PsSFBB6-α protein was a hydrophilicity and non-secretory pro-
tein with lyases activity and specifically recognized substrates，which was consistent with the function of F-box protein． ［Conclusion］ This
study had laid the foundation for further research of SFBB proteins and the mechanism of self-incompatibility and provided a theoretical basis
for breeding of self-compatible cultivars of Xinjiang pear and scientific arrangement of pollination trees in production to increase the yield and
quality．
Key words Qipan pear;Self-incompatibility;SFBB6-α gene;Bioinformatics
基金项目 国家自然科学基金资助项目(30860172)。
作者简介 徐胜利(1966 － ) ，男，上海人，教授，博士，硕士生导师，从事
果树资源与遗传改良及果树逆境分子生物学研究，E-mail:
xusl0997@ 163． com。
收稿日期 2011-12-13
20世纪 50年代中期，俞德浚教授在考察新疆后把新疆
梨从别的梨种分离出来，并在《中国果树分类学》中确定新疆
梨的独立地位［1］。目前新疆原产梨(P． sinkiangensis Yu)品
种多数为自交不亲和品种，在生产上造成产量低而不稳定，
从而制约了新疆梨产业的发展。
梨的自交不亲和性被普遍认为属于 S-RNase 体系的配
子体自交不亲和系统，受一个具有复等位基因的 S-位点控
制，包括花柱 S-决定子和花粉 S-决定子［2］，花柱 S-决定子已
确定为 S-RNase 基因，并且已在许多植物上被成功克隆［3］。
花粉 S-决定子一般被认为应该具有在花粉中特异表达、与 S-
RNase 基因紧密连锁、在基因序列上存在与 S-RNase 基因高
变区相对应的多态性和与 S-RNase 基因具有特异识别作用
等特点，现在已基本判定在花粉中特异表达的 F-box 基因就
是花粉 S-决定子［4］，命名为 SFB(Shaplotype-specific F-box
protein)基因，并已在中国梨［5 －7］等物种中克隆得到。但是还
缺乏与新疆梨相关的文献报道。
生物信息学(Bioinformatics)是现代生命科学与信息科
学、计算机科学、数学、统计学、物理学、化学等学科相结合的
交叉学科，它的发展为新蛋白的发现提供一条捷径。随着多
种模式植物基因组计划的完成，应用生物信息学技术对已知
的核酸和蛋白质序列进行比对、分析、建立计算模型，进而对
蛋白质组结构与功能进行预测，已成为后基因组时代的重要
任务［8 －9］。笔者以新疆梨本地品种棋盘梨为材料，利用 RT-
PCR和 RACE(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技术
克隆 SFBB基因，并对其进行生物信息学分析，旨在为进一
步研究 SFBB蛋白和自交不亲和机理奠定基础，也为新疆梨
自交亲和品种的选育和生产中科学配置授粉树以提高产量
和品质提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 材料 供试材料为棋盘梨蕾期花药，2011 年 4 月上旬
采自喀什叶城园艺场，液氮中保存备用。试验所用研钵、金
属和玻璃器皿均在烘箱中经 180 ℃烘 8 h，塑料物品经 0． 1%
DEPC(BBI)水 37 ℃处理 24 h，并经 121 ℃高压蒸汽灭菌
30 min。仪器设备均用 70%酒精和 1∶ 20 的强力 RNase 灭活
剂(天泽基因工程有限公司)擦拭。所用引物由上海生工生
物工程技术服务有限公司合成。
1． 2 方法
1． 2． 1 花药总 RNA 的提取及 cDNA 的合成。花药总 RNA
的提取。方法参照 TianGen RNAplant Reagent 说明书操作，
用 DNaseI(Takara)去除 DNA 的污染，利用 SMARTTM RACE
cDNA Amplification Kit(BD)合成双链 cDNA。
1． 2． 2 基因全长的克隆。根据 GenBank 登录的 21 个李属
责任编辑 朱琼琼 责任校对 卢瑶安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2012，40(3):1296 － 1299，1320
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2012.03.203
(Prunus)SFB 和梨属(Pyrus)SFBB 基因保守区设计简并引
物 SFBB-P1 和 SFBB-P2，以花药 cDNA 为模板，PCR 扩增目
标基因片段，以 actin基因为参照［10］，引物序列为 actin-F1 和
actin-R1(表 1)。PCR 扩增体系［11］为 25 μl，包含 ddH2O
15． 5 μl，10 × PCR buffer 2． 5 μl，模板 cDNA 2 μl，正向引物 P1
(20 μmol /L)2 μl，反向引物 P2(20 μmol /L)2 μl，dNTPs
(10 μmol /L)0． 5 μl，Taq DNA 聚合酶(2． 5 U /μl)0． 5 μl。
PCR反应程序为 94 ℃预变性 4 min;94 ℃ 30 s，50 ℃ 30
s，72 ℃ 60 s，40 个循环;72 ℃延伸 7 min，4 ℃保存。1. 5%琼
脂糖凝胶电泳分离 PCR 产物，离心柱型琼脂糖凝胶 DNA回
收试剂盒(TianGen)回收 PCR 产物，连接到 pMD19-T(Taka-
ra)载体上，16 ℃连接 8 h;把连接液转移到大肠杆菌 DH5α
感受态细胞(TianGen)中，LB(含 Amp)平板培养基中 37 ℃
培养 16 h，挑取白斑，LB(含 Amp)液体培养基中培养，用通
用引物 M13-47 /RV-M(表 1)进行菌液 PCR 以验证转化情
况，把阳性克隆子送上海生工生物工程技术服务有限公司测
序。根据测序结果分别设计 2 个扩增片段的 3-RACE 上游
特异性引物 3gsp1 和 3gsp2，和 5-RACE 下游引物 5gsp1 和
5gsp2(表1) ，SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit配备的
引物和酶扩增 2个基因的 3和 5末端序列，按试剂盒说明具体
操作。测序后，把获得的片段用 DNAMAN 进行连接并设计引
物 mk-f1和 mk-r1，以 cDNA 为模板扩增获得全长基因。
1． 2． 3 棋盘梨 PsSFBB-α基因生物信息学分析。将获得的
棋盘梨全长 PsSFBB-α基因在 NCBI 网站上 BLAST 比对，用
ORF Finder 寻找开放阅读框，并对 F-box 区域进行分析。用
Protparam 分析 PsSFBB6-α编码蛋白的氨基酸序列组成、相
对分子质量、等电点等理化性质(http:/ /au． expasy． org / tools /
protparam． html) ;利用 DNASTAR 软件预测棋盘梨 PsSFBB6-
α蛋白二级结构和亲水性情况;利用 TMHMM Server v． 2． 0
软件进行蛋白质跨膜区段预测(http:/ /genome． cbs． dtu． dk /
services /TMHMM/) ;利用 Signal P 程序分析 N-末端的信号
肽序列(http:/ /genome． cbs． dtu． dk /services /SignalP /) ;用
ProtFun 分析预测 PsSFBB6-α 蛋白的功能(http:/ /www． cbs．
dtu． dk /services /ProtFun /)。
表 1 试验所用引物
引物名称 引物序列(5-3) 备注
SFBB-P1 TTCGNTTTCTNTNTACNTGCAAGTC 中间序列
SFBB-P2 TTCCAYNKTTTTTCNTGCAGAACC 中间序列
actin-F1 TGGCTGGGACCTGACTGACTA 基因参照
actin-R1 AGGGCGGTGATCTCCTTCTGC 基因参照
3gsp1 GGAACCCGTCTGTTAGGAAAT 3-RACE
3gsp2 TCATGCGTACCAACAAAGG 3-RACE
5gsp1 GTACGCATGATCCTTACAGC 5-RACE
5gsp2 CTGTGCTTTCTAAGGGATGG 5-RACE
mk-f1 ATGGCATTCATACGACGTAAG 全长引物
mk-r1 TTAATGATTATTGAATAAAACC 全长引物
M13-47 CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 通用引物
RV-M GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 通用引物
注:N = A/T /C /G;K = G/T;R = A/G;Y = C /T。
2 结果与分析
2． 1 PsSFBB 基因的克隆和序列分析 以简并引物 SFBB-
P1 和 SFBB-P2为引物，棋盘梨花药 cDNA 为模板，PCR 扩增
目标基因片段，获得了 800 bp左右的片段(图 1A)。测序结
果在 NCBI网站上 BLAST 比对，结果显示为 PsSFBB6-α基因
的部分片段。以获得的中间序列为模板，根据 SMARTTM-
RACE cDNA Amplification Kit 的说明设计 3-和 5-RACE 引
物，扩增获得了 PsSFBB6-α基因的 3和 5端(图 1B和 C) ，用
DNAMAN 进行连接获得了1 183 bp的片段。设计引物mk-f1
和 mk-r1，以 cDNA 为模板扩增获得了目的片段(图 1D)。测
序结果显示棋盘梨 PsSFBB-α基因全长1 231 bp，编码378 个
氨基酸，终止子为 TAA(图 2) ，与拼接片段一致。全长基因
在 NCBI 网站上 BLAST 比对，结果显示其和棋盘梨的 PsSF-
BB-α(登录号 AM746968)最大同源性为 99%，但它只是部分
片段，而笔者获得的是基因的全长，根据已公布片段可知本
注:A．中间片段扩增;B． 3RACE;C;5RACE;D．全长扩增;M． DNA Marker DL2000;A1． actin对照;A2．中间序列结果;B1． 3gsp1 扩增;B2． 3gsp2
扩增;C1． 5gsp1 扩增;C2． 5gsp2 扩增;D1．全长引物扩增。
图 1 PsSFBB6-α基因克隆的电泳结果
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基因的单元型为 S6，所以将此基因命名为 PsSFBB6-α(Gen-
bank 登录号 EU909687)。PsSFBB6-α与大部分已公布 SFBB
基因的同源性为 87% ～ 93%，蛋白的同源性为 68% ～ 83%，
显示了 PsSFBB6-α基因的多态性。对 PsSFBB6-α 蛋白进行
分析可发现在 N 末端含有一个大约 50 个氨基酸组成的 F-
box 基序，并且含有 2 个高变区 Hva 和 Hvb(图 3)。
图 2 PsSFBB6-α基因 cDNA 及推测的氨基酸序列
图 3 PsSFBB6-α基因具有的 F-box基序及高变区 Hva 和 Hvb
2． 2 PsSFBB6-α蛋白的理化性质分析 用 Protparam 预测
棋盘梨 PsSFBB-α 蛋白的理化性质，推测该蛋白的分子式为
C2000H3034N517 O558 S23，相对分子质量为 43 987． 5，等电点为
6. 02;理论推导半衰期约为 30 h，不稳定参数为 55． 21，属不
稳定蛋白(标准 40 以下为稳定蛋白) ，可能该蛋白是个不成
熟多肽，还需要经过翻译后加工才能形成稳定蛋白［12］。该
蛋白中相对含量较多的氨基酸是 Ile(33 个，8． 8%)、Leu(33
个，8． 8%)和 Ser(30个，8． 0%) ;含量较少的氨基酸是 Met(8
个，2． 1%)、Trp(9 个，2． 4%)和 Gln(10 个，2． 7%)。蛋白中
总的带负电荷的残基(Asp + Glu)为 47;总的带正电荷的残
基(Arg + Lys)为 40。其亲水性平均数为 － 0． 153，预测该蛋
白为亲水性蛋白，可能与含较多的 Ile 和 Leu有关，且其脂肪
指数为 87． 87。
2． 3 PsSFBB-α 蛋白的疏水性 /亲水性的预测和分析 由
ProtScale 在线工具对棋盘梨 PsSFBB-α 氨基酸序列的疏水
性 /亲水性进行预测(图 4)。预测结果表明，多肽链第 42 位
8921 安徽农业科学 2012年
谷氨酸(Glu)具有最低分值 － 3． 033，亲水性最强;第 239 位
苏氨酸(Thr)具有最高分值 1． 800，疏水性最强，亲水区域明
显大于疏水区域。因此，整个多肽链表现为亲水性［13］。
图 4 棋盘梨 PsSFBB6-α蛋白的疏水性 /亲水性的预测和分析
2． 4 PsSFBB 蛋白的 DNASTAR 预测和分析 利用 DNAS-
TAR 的 Garnier-Robson和 Chou-Fasman 方法预测棋盘梨 PsS-
FBB6-α蛋白二级结构，结果如图 5 所示，可以看出 Garnier-
Robson 法预测的 PsSFBB6-α蛋白二级结构是以 α螺旋和 β
转角为主，但 Chou-Fasman 方法预测则显示以 α 螺旋和 β片
层为主，缺乏无规则卷曲的结构，所以针对于未知蛋白的预
测最好是将多种方法相结合，以增加可信度。Kyte-Doolittle
法亲水性分析和 Emini 法膜表面分析结果显示，此蛋白为亲
水性蛋白(与“2． 2”结果相同)且主要在膜的表面［12］。
注:h． α-螺旋;e． β-折叠延伸链;t． β-转角;c．无规则卷曲。
图 5 棋盘梨 PsSFBB6-α蛋白二级结构的预测
2． 5 PsSFBB 蛋白跨膜结构区分析 利用 TMHMM Server
v． 2． 0 软件对 PsSFBB6-α蛋白进行蛋白质跨膜区段预测，结
果如图 6 所示，棋盘梨 PsSFBB6-α蛋白整条肽链都位于细胞
膜外，说明棋盘梨 PsSFBB6-α 蛋白不存在跨膜结构域，验证
了“2． 2”的预测结果。
2． 6 PsSFBB 蛋白的信号肽分析 利用 Signal P 程序分析
PsSFBB6-α蛋白 N-末端序列，发现该蛋白可能存在一段信号
肽序列，信号肽切除位点位于第 22 和 23 氨基酸之间即 AK-
SLV 存在酶切位点。隐马尔可夫模型显示此蛋白是一种非
分泌性蛋白(图 7)。综合“2． 4”的结果可看出，PsSFBB6-α
蛋白在细胞质基质中合成后，不经蛋白转运，直接锚定于细
胞质基质中的特定部位行使催化功能［14］。
2． 7 PsSFBB6-α蛋白的功能预测 ProtFun 预测 PsSFBB6-α
蛋白的主要功能有能量代谢和生物合成辅助因子等，并认为
图 6 棋盘梨 PsSFBB6-α蛋白的跨膜区预测
图 7 棋盘梨 PsSFBB6-α信号肽预测
PsSFBB6-α蛋白可能起裂合酶的作用。以上的预测正好符
合了 PsSFBB6-α 蛋白跨膜结构预测的 F-box 蛋白质通过参
与 SCF 复合体的形成介导了泛素化蛋白底物的特异性识别，
在其降解过程中发挥关键作用的机理［15］。
3 结论与讨论
近年来，国内外学者已对配子体自交不亲和的机制研究
做了大量的工作，并且提出了 3 个自交不亲和的模型:膜受
体模型、胞内抑制子模型和修正的抑制子模型［16］。但是其
表达产物至今未分离出来，要确认 SFB基因是否是自交不亲
和中的花粉 S-决定子，只有通过转基因技术或者花粉部分突
变的方法才能真正确认。近期的研究已在 P． persica、P． avi-
um 和 P． mume中通过花粉突变的方式确认了 SFB基因就是
花粉 S-决定子［17 －18］。
该研究表明，PsSFBB6-α 基因编码 378 个氨基酸，基因
的同源性在 87% ～ 93%，蛋白的同源性在 68% ～ 83%，与
Sassa 等［19］在日本梨中获得的 PpSFBB 序列比较，其核苷酸
最大同源性为 88%，蛋白同源性为 79%，显示了 SFBB 基因
的多态性;PsSFBB6-α蛋白具有 F-box 蛋白的基本结构，即在
蛋白的 N 端有一段由约 50 个氨基酸组成的 F-box 基序，具
有较高的保守性，并且含有 2 个高变区 Hva 和 Hvb，被认为
是与自交不亲和相关，为与 S-RNase相互识别的位点［20］。预
测 PsSFBB6-α蛋白二级结构含有大量的 α 螺旋结构，和 F-
box 区域紧密结合，共同组成弯曲的结构，紧紧的与 Skp1 连
接到 SCF 复合体上，SCF 复合体促进底物和泛素结合酶
(E2)之间的相互作用，E2 将泛素共价转移到底物上，泛素化
的底物随后经过 26S 蛋白酶体的作用被降解［21］。同时该研
究预测到 PsSFBB6-α蛋白具有裂合酶的性质，可能在花粉中
(下转第 1320页)
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境胁迫中起重要作用［11］。OsWRKY17 是水稻 WRKY 转录因
子基因，水稻在缺铁情况下发生的衰老过程中 OsWRKY17 表
达水平被上调［4］，并且该基因在高盐、干旱、冷害、高温等 4
种逆境因子胁迫中不同程度地被诱导［4］。该研究成功构建
了 OsWRKY17 基因与 GFP 融合的植物表达载体 pBin-GFP /
OsWRKY17，通过农杆菌介导的转化方法将 OsWRKY17 基因
导入拟南芥，经抗生素 Kan筛选获得了抗性植株。PCR分子
检测结果表明，OsWRKY17基因已经整合到拟南芥的基因组
中，这为研究该基因的生理生化特性奠定了基础。
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491 －498．
(上接第 1299页)
起到酶的作用即识别受体，能够对底物特异性的识别。推测
当 S-RNase自由进出花粉管时，与花粉 S 蛋白发生相互作
用，花粉 S蛋白选择性地识别不同等位基因的 S-RNase，并使
其快速泛素化，从而使 S-RNase 活性丧失，保留相同等位基
因的 S-RNase 活性，降解花粉管的 rRNA，使花粉管的生长受
到抑制，这正好也证明了胞内抑制子模型的可靠性。预测结
果还显示此蛋白是亲水性、非分泌型蛋白，在基质中合成之
后直接起催化作用;结果也验证了花粉 S蛋白是细胞质溶性
的特点，而不是和细胞膜或细胞壁结合，又给抑制子模型提
供了部分理论证据。
综上所述，该研究利用 RT-PCR 和 RACE 技术，从新疆
棋盘梨栽培种麻壳花药中克隆到了一个全长为 1 231 bp 的
SFB基因(Genbank 登录号为:EU909687) ，命名为 PsSFBB6-
α。比较分析出 PsSFBB6-α基因具有多态性，发现 PsSFBB6-
α蛋白在 N末端含有一个约50 个氨基酸组成的 F-box基序。
通过生物信息学分析，推测 PsSFBB6-α 蛋白为不稳定、亲水
性、非分泌型蛋白，在基质内起裂合酶的作用，特异性的识别
底物，吻合了 F-box 蛋白的作用。
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0231 安徽农业科学 2012 年