全 文 ：第 38 卷 增刊
2014 年 9 月
南京林业大学学报(自然科学版)
Journal of Nanjing Forestry University (Natural Sciences Edition)
Vol． 38，Suppl．
Sept．，2014
doi:10． 3969 / j． issn． 1000 － 2006． 2014． S1． 004
收稿日期:2014 － 09 － 10
基金项目:江苏省科技支撑计划(BE2012346) ;江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)
第一作者:李祯，硕士生* 通信作者:王贤荣，教授，博士。E-mail:wangxianrong66@ njfu． edu． cn。
引文格式:李祯，伊贤贵，顾宇，等． 山樱花基因组大小的测定［J］． 南京林业大学学报:自然科学版，2014，38(S1):17 － 19．
山樱花基因组大小的测定
李 祯，伊贤贵，顾 宇，王贤荣*
(南京林业大学生物与环境学院，江苏 南京 210037)
摘要:为了测定山樱花基因组的大小，获得适合山樱花裂解的流式细胞术的最适裂解液，优化了樱属植物流式细
胞术流程。结果显示，在所对比的 6 种裂解液中，LB01 最适合樱属植物细胞裂解。以大豆(Glycine max (L．)
Merrill)为内标，比较待测样品和内参峰值，计算得出山樱花基因组大小为 366. 67 Mb，C 值为 0. 375 pg。可用于
樱属植物的倍性鉴定。
关键词:山樱花;流式细胞仪;基因组大小
中图分类号:S685 文献标志码:A 文章编号:1000 － 2006(2014)S1 － 0017 － 03
The genome size determination of Cerasus serrulata
LI Zhen，YI Xiangui，GU Yu，WANG Xianrong*
(College of Biology and the Environment，Nanjing Forestry University，Nanjing 210037，China)
Abstract:The present study optimized the process of flow cytometry (FCM)for Cerasus with the purpose of determining
the genome size of Cerasus serrulata and obtaining optimal buffer for its FCM process． The results showed that the LB01
was the best buffer for C． serrulata among the six analyzed buffers． This paper used Clycine max (L．)Merrill was the
internal standard to test the genome size of C． serrulata，which was 366． 67 Mb with C value 0． 375 pg． That present re-
sults would lay foundations for ploidy identification of Cerasus serrulata．
Key words:Cerasus serrulata;FCM;genome size
流式细胞术(FCM)是一种生物学技术，用于
对悬浮于流体中的微小颗粒进行计数和分选［1］。
这种技术可用来对流过光学或电子检测器的细胞
进行分类收集，能高速分析上万个细胞，并同时从
一个细胞中测得多个细胞特征参数，进行定性或定
量分析，具有速度快、精度高、准确性好等特点。目
前在基因组大小的测定研究中被广泛运用。基因
组大小(C 值)是指生物体的单倍体基因组所含
DNA总量［2］。基因组大小的度量单位通常是 pg
(10 －12g)或是核苷酸碱基对的数量表示，单位以百
万计，写成 Mb 或 Mbp，1 pg 大约为 978 Mb［3］。C
值在许多研究领域都是不可缺少的数据，不仅可以
估测物种的 DNA 含量，还对该物种的分子遗传与
细胞遗传等研究具有重要意义，而且也为植物的基
因组及其他研究提供基础资料。另外，C 值的测
定还可以为生态学和细胞生物学提供重要的
参考［4］。
山樱花［Cerasus serrulata (Lindl．)G． Don ex
London］属 于 蔷 薇 科 (Ｒosaceae)，李 亚 科
(Prunoidea)樱属(Cerasus)植物，是我国暖温带森
林林缘常见种类，是优良的野生观赏樱花资源，分
布于东亚地区北亚热带至温带(102 ～ 141°E、23 ～
40°N) ，海拔范围在 300 ～ 1 800 m 之间［5］。陈瑞
阳［6］统计过山樱花［C． serrulata (Lindl．)G． Don
ex London］等若干种类的染色体数目并给出了核
型公式。在国外，Oginuma［7 － 8］较早地对广义李属植
物做了染色体计数和核型研究，其中包含有部分樱
属植物。相比之下，有关山樱花基因组大小的研究
未见报道。笔者以大豆(Glycine max (L．)Merrill)
为内标，用流式细胞术对山樱花的基因组大小进行
了测定分析，旨在为今后开展樱属植物的基因组测
序、基因组文库建立研究等工作提供参考数据。
1 材料与方法
1. 1 细胞核悬液的制备
用于流式细胞仪分析的山樱花来自沙藏种子
南 京 林 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 第 38 卷
萌发长成的幼苗嫩叶;作为内标的大豆(G． max
(L．)Merrill)由南京林业大学分析中心林峰老师
提供种子萌发所得幼苗嫩叶。
选取 0. 2 g 去除中脉和叶缘锯齿后的山樱花
嫩叶置于塑料培养皿内，加入有 1 mL 预冷的裂解
液，用锋利的刀片迅速将其切碎，裂解液配方见表
1。用孔径为 37 μm 的尼龙网过滤，得滤液至 1. 5
mL棕色指形管内。4 ℃，800 r /min离心 5 min。弃
上清液，获得细胞核悬液。整个过程在冰上完成。
山樱花待测样品与大豆叶片等质量叶片组织混合，
以同样的方法制备细胞核悬液，留作备用。
表 1 6 种细胞核裂解液的配方
Table 1 Component of six nuclear lysis buffer
裂解液
lysis buffer
配方
component
参考文献
reference
Galbraith’s
20 mmol /L MOPS，45 mmol /L
MgCl2·6H2O，30 mmol /L 柠檬
酸钠，0. 1% Triton X － 100，pH
= 7. 0
［9］
Chopping
MgCl2，20 mmol /L MOPS，30
mmol /L柠檬酸钠，0. 1% Triton
X － 100;pH = 7. 0
［9］
LB01
15 mmol /L Tris， 2 mmol /L
Na2EDTA，0. 5 mmol /L 四盐酸
精胺，80 mmol /L KCl，20 mmol /
L NaCl，0. 1% Triton X － 100，
15 mmol /L β － 巯基乙醇;pH
= 7. 5
［10］
GPB
0. 5 mmol /L 四盐酸精胺，30
mmol /L 柠檬酸钠，20 mmol /L
MOPS， 80 mmol /L KCl， 20
mmol /L NaCl，0. 5% Triton X －
100;pH = 7. 0
［11］
Tris． MgCl2
200 mmol /L Tris， 45 mmol /L
MgCl2·6H2O，0. 5% Triton X －
100;pH = 7. 5
［9］
WPB
0. 2 mmol /L Tris-HCl，4 mmol /L
MgCl2 · 6H2O， 2 mmol /L
Na2EDTA·2H2O， 86 mmol /L
NaCl，10 mmol /L 焦亚硫酸钠，
1% PVP － 10， 1% Triton
X － 100;pH = 7. 5
［11］
1. 2 DNA特异染色
向细胞核悬液内依次加入 ＲNA酶、PI染料，有
效质量浓度为 50 μg /mL。用 200 μL 移液枪头轻
轻吹打溶液，使集聚成絮状或团状的细胞核分开，
切忌用力震荡、摇晃以免破坏核膜。避光冰浴染色
2 h。
1. 3 流式细胞仪检测
流式细胞仪采用的美国 BD公司的 Influx流式
细胞仪，通道 670 /30，采用 488 nm 蓝光激发，检测
PI的发射荧光强度。每个待测样品收集 2 万个细
胞。每个样品重复 3 次。测定所得的图像和数据
由流式细胞仪自带软件进行处理分析。
2 结果与分析
首先对比分析待测样品山樱花与大豆各自单
独测定的结果，确定山樱花与内标大豆的基因组测
定峰无重叠，保证了用大豆作为内标的可靠性。大
豆基因组大小为 1. 1 Gb［10］。以大豆为内标的检测
图像如图 1 所示，测定结果经分析表明，山樱花的
基因组大小为 0. 375 pg。
图 1 山樱花与大豆混合样品流式仪检测结果
Fig． 1 FCM detection image for mixed sample of
Cerasus serrulata and G． max (L．)Merrill
3 讨 论
在选择内标时，早期以流式细胞术进行基因组
大小的测定中通常采用鸡血红细胞、人淋巴细胞
等。但研究表明，植物和鸡的细胞核水解速率不一
样，当两者混合制样时可能导致 DNA 特异染色不
均等，因而在进行植物基因组大小的测定时，应该
采用植物的基因组作为内标［11］。笔者采用基因大
小已知的大豆品种(G． max (L．)Merrill)作为内
标。在研究比较后确定了大豆(G． max (L．)Mer-
rill)作为内标来测定樱花 C 值。大豆(G． max
(L．)Merrill)是一个非常合适的标准植物，其基因
组全序列已经测序完成，C值数据较为可信，同时它
是广泛采用的实验室研究植物，具有一定的典型性。
由山樱花和大豆基因组单独检测的结果可知，大豆
基因组大小测定峰与山樱花基因组大小测定峰无重
叠，表明测定的混合样品区分度良好，保证了用已知
基因组大小的大豆品种 G． max (L．)Merrill作为内
标计算山樱花基因组大小结果的准确性。
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2014 年 9 月 李 祯，等:山樱花基因组大小的测定
实验中为了减少实验误差，所用材料都是沙藏
种子萌发的幼苗。选取新鲜幼嫩叶片，当天采集不
经过低温贮藏等环节，取材后立即制样保证了样品
的鲜活，可获得较好的峰。所用内标(大豆)均为
同一植株上的叶片。
流式细胞术中，裂解液的选择至关重要，合适
的裂解液能使样品的分析更加准确、可靠。笔者比
较了 6 种裂解液的效果，发现 Tris． MgCl2 效果最
差，其中 Galbraiths 和 LB01 的效果最好。这可能
是因为樱属植物的细胞中含有大量的糖类、酚类等
黏性物质，而在 Galbraiths 和 LB01 含有的高容量
0. 1%(体积分数)去垢剂 Triton X － 100 能使叶绿
体细胞溶解，减少杂质数量，从而降低杂质信号的
干扰。另外经过多次摸索得出在低温 4 ℃下离心
转速为 800 r /min，离心 5 min;染色时间 2 h效果最
佳。
变异系数 CV 值是流式细胞术中检验精准度
的一个标准。CV值越小，说明细胞核完整性越好，
碎片越少，变异系数也越低。此次实验中每个样品
重复检测 3 次，上机检测每次收集 20 000 个细胞。
变异系数控制在 7%之内，这些措施进一步保证了
实验数据的可靠性。
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