全 文 ：分子植物育种，2006年，第4卷，第5期，第721-725页
MolecularPlantBreeding,2006,Vol.4,No.5,721-725
新思路、新技术、新方法
NovelThinking&Technology
紫叶李叶片总RNA提取方法的改进与比较
史宝胜 1,2* 卓丽环 1
1东北林业大学园林学院,哈尔滨,150040;2河北农业大学园林与旅游学院,保定,071001
*通讯作者,baoshengshi@163.com
摘 要 从紫叶李叶片中提取高质量RNA是研究叶色相关基因表达调控的必要前提。实验室常用的RNA
提取方法和RNA提取试剂盒有很多种，每种方法只适合某些组织材料。对彩叶植物来说，组织中的次生代
谢物含量很高，叶片中的花色素苷、多糖更是高质量核酸提取过程中难以去除的干扰成分。本文利用CTAB
法、SDS法以及Trizol法从富含花青素类物质的彩叶植物紫叶李叶片中提取总RNA。电泳检测显示：CTAB
法提取的总RNA其28S、18S条带清晰，紫外光谱分析A260/A280比值为1.93，A260/A230比值为2.04，RNA产量
可达141μg·g-1·FW-1；而且通过RT-PCR扩增出了目的基因的cDNA片段，说明利用此法分离的RNA纯度
和浓度符合反转录PCR的要求，而且能去除色素分子的干扰。SDS法提取的总RNA产量较低，且纯度不
高。而Trizol法很难从紫叶李中提出完整的RNA。因此CTAB法是一种从富含花青苷的紫叶李叶片中有效
提取高质量总RNA的方法。
关键词 紫叶李,花青素,总RNA,CTAB
ModificationandComparationofTotalRNAExtractionMethodsfrom
PrunuscerasiferaLeaves
ShiBaosheng1,2* ZhuoLihuan1
1ColegeofLandscapeArchitecture,NortheastForestryUniversity,Harbin,150040;2ColegeofLandscapeArchitectureofAgriculturalUniversityof
Hebei,Baoding,071001
*Corespondingauthor,baoshengshi@163.com
Abstract HighqualityRNAisolatedfromPrunuscerasiferaleavesisaprerequisitetothestudyofgeneexpres-
sion.TherearemanyprotocolsandkitsfortheextractionofRNAinlaboratory.Eachmethodisonlysuitablefor
certainorganizationsandmaterials.Totheleave-coloredplants,itisverydificulttoeliminatetheinterferentof
thehighlevelsofthesecondarycompounds—theanthocyaninandpolysaccharidesintheleaves.TotalRNAwas
isolatedfromPrunuscerasiferaleavesbythemethodsofCTAB,SDSandTrizol,respectively.Theresultsof1%
agarosegelelectrophoresisandUV-spectroscopicanalysisshowedthatthetotalRNAofPrunuscerasiferaextract-
edusingtheCTABmethodhadnoobviousdegradation,anditsbrandsof28Sand18Swerealclearinthepic-
ture,thevalueofA260/A280,A260/A230was1.93,2.04,andtheRNAyieldreached141μg·g-1·FW-1,respectively.Tar-
getgenewasamplifiedfromisolatedtotalRNAbyRT-PCR,whichsuggestedthepurityandconcentrationoftotal
RNAcouldmeetthedemandforRT-PCR,andeficientlyeliminatetheinterferentofanthocyanin.ThetotalRNA
wasverylowbySDSmethodandthepuritywasnothigh.ItwasverydificulttoextractintegrityRNAfrom
PrunuscerasiferabyTrizolmethod.ThemethodofCTABcouldbeaneficientmethodforextractionthehigh
qualityRNAfromPrunuscerasiferaleavesrichedinanthocyanin.
Keywords Prunuscerasifera,Anthocyanin,TotalRNA,CTAB
从分子生物学角度研究彩叶形成过程中基因变
化，进行叶色基因调控和定向分子育种，繁殖和培育
出丰富多彩的彩叶植物，将成为今后彩叶植物研究
的重要内容，也是将彩叶植物广泛应用于园林及城
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
市绿化的基础工作之一。
核糖核酸(RNA)是分子生物学研究的重要材料
之一，是进行Northern杂交分析，RT-PCR，cDNA文
库构建，差示PCR分析及体外转译等实验的必要前
提。实验室常用的RNA提取方法和RNA提取试剂
盒有很多种，每种方法只适合某些组织材料。对彩叶
植物来说，组织中的次生代谢物含量很高，叶片中的
花色素苷、多糖更是提取高质量核酸过程中难以去
除的干扰成分(ZengandYang,2002)。为解决这一难
题，我们在常规提取RNA方法的基础上进行优化和
改进，成功地在紫叶李的叶片中提取出了高质量的
RNA，可用于目的基因的克隆和基因的表达研究。
1材料和方法
1.1实验材料
取健康幼嫩的紫叶李 (PrunuscerasiferaEhrh.f.
atropurpurea(Jacq.)Rehd)叶片，在液氮中速冻，保存
于-70℃超低温冰箱中待用。
1.2仪器
电热恒温水浴锅(北京光明仪器厂)，台式冷冻高
速离心机(Sigma公司)，漩涡振器，BiometraPCR仪
(German)，电泳仪(北京)，电泳槽及Uvitec凝胶成像
系统(Japan)，双光束紫外可见光光度计(Japan)。
1.3RNA提取试剂及操作
无 RNase的水和 LiCl溶液配好后加入 0.1%
DEPC，充分摇匀，室温放置过夜或在37℃下放置3h
以上，121℃灭菌20min。提取所用的塑料、玻璃器皿
均进行去除RNase处理。各种RNA操作参照分子克
隆实验指南(Sambrooketal.,2002)进行。
1.4RNA提取方法
1.4.1改良CTAB法
本实验在孟丽等(2006)研究方法基础上做了部
分改进。称取0.2g新鲜或-70℃保存的紫叶李叶片
置于预冷的研钵中，加入0.2gPVPP，加入液氮充分
研磨成细粉末状，研磨中不断缓慢倒入液氮防止材
料解冻；将研磨碎的材料快速移入预冷的1.5ml离心
管中，加入600μl经65℃预热的CTAB提取缓冲液
(2%CTAB，0.1mol/LTris-Cl(pH=8.0)，0.01mol/LNa-
Cl，25mmol/LEDTA(pH=8.0)，使用前加入2%β-巯
基乙醇)，立即用力上下颠倒并漩涡震荡30s，使材料
均匀分散于溶液中，于65℃水浴锅中温浴5min，其
间剧烈震荡3次；稍冷却后加入等体积的氯仿/异戊
醇漩涡震荡1min使之充分混匀，室温10000r/min
离心15min；取上清，重复氯仿/异戊醇抽提一次。转
移上清液至另一离心管中，加入 0.5倍体积的
5mol/LLiCl，使终浓度为2mol/L，混匀，4℃沉淀过
夜；然后 4℃ 12000r/min离心 15min，去上清，用
100μl70%乙醇洗涤沉淀；沉淀微干后加入 500μl
SSTE缓冲液 (0.5%SDS，1mmol/LEDTA(pH=8.0)，
1mol/LNaCl，10mmol/LTris-Cl(pH=8.0)溶解沉淀，
加入等体积氯仿/异戊醇再抽提2次；转移上清后加
入0.25倍体积的异丙醇和0.25倍的RNA沉淀剂，
充分混匀后，于室温放置10min；4℃12000r/min离
心10min，收集沉淀，用 70%乙醇漂洗两次，重复上
述离心；用一次性使用的吸头吸尽残存的乙醇；将打
开管盖的离心管放在实验台上几分钟，使残余的乙
醇挥发掉，不要让RNA干透；加50μlDEPC处理过
的水，将RNA溶液储存于-70℃。
1.4.2改良SDS法
本实验根据杨卫东等 (2005)的方法适当修改而
成。0.2g紫叶李叶片，液氮研磨成粉末，移入2ml离
心管中，加入1ml提取缓冲液 (0.1mol/LTris-HCL
(pH7.4)，0.5mol/LNaCl，25mol/LEDTA(pH8.0)，20g/L
SDS，20g/LPVPP和20g/Lβ-巯基乙醇使用前加入)，
室温下摇动10min；加入1/3体积5mol/L醋酸钾(pH
6.0)，冰上沉淀30min，4℃10000r/min离心15min；
上清夜转移到新离心管中，等体积酚/氯仿抽取，4℃
10000r/min离心15min，重复此步；再用等体积氯仿
抽取水相，4℃12000r/min离心15min；水相转移到
新离心管中，加入等体积异丙醇-20℃沉淀2h；4℃
12000r/min离心25min；DEPC水溶解沉淀；等体积的
酚/氯仿、氯仿抽取，用等体积异丙醇和1/30体积
3mol/L醋酸钠(pH5.2)于-20℃沉淀2h；4℃12000r/min
离心25min；收集沉淀，用70%乙醇洗涤沉淀2次，沉淀
溶解于50μlDEPC水。
1.4.3Trizol法
具体步骤按照Trizol试剂盒(Invitrogen公司)说
明进行，但在研磨时加入0.2gPVPP。
1.5RNA纯度及完整性检测
分别取改良CTAB法和改良SDS法提取的5μl
RNA溶液，在1%非变性琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙
锭染色，而后在凝胶成像系统下观察并拍照。
722
紫叶李叶片总RNA提取方法的改进与比较
ModificationandComparationofTotalRNAExtractionMethodsfromPrunuscerasiferaLeaves
取3μlRNA溶液稀释至3ml，用紫外可见分光
光度计测量A230，A260，A280，并计算 A260/A230，A260/A280
的比值，确定其纯度，再计算回收率。
RNA回收率 (μg·g-1·FW-1)= (A260×40×稀释倍
数×原液体积)/提取样品质量(g)
1.6RT-PCR分析
cDNA第一链的合成按反转录酶说明指导书进
行，-20℃保存备用。
实验所用的目的基因为花色素苷代谢中的关键
基因——查尔酮合成酶基因(chs)，其引物序列为：
CHS52:5-CCTYCGYATCACMAABAGYGAGCAC-3
CHS32:5-CAAAYCCRAAWAGSACWCCCCAC-3
PCR反应体系 (25μl)：cDNA2μl，10×Bufer
2.5μl，10mmol/LdNTP2μl，25mmol/LMgCl2 2μl，
上、下游引物各2μl，TaqDNA聚合酶0.5μl(5U/μl)，
ddH2O12μl。 反应条件为 94℃ 3min预变性；94℃
1min，62℃1min，72℃1min，共30个循环；72℃延伸
10min。所得PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检
测有无适当大小的目的条带。
2结果与分析
2.1RNA样品质量检测
将提取的RNA在1%非变性琼脂糖凝胶电泳检
测，利用CTAB法提取的总RNA，28S和18S两条带
带型清楚，且28SrRNA无论在质量还是在亮度上均
为18SrRNA的二倍，两条带之间无弥散现象(图1)，
说明 RNA在提取过程中结构完整，基本排除了
RNase的污染，未发生明显降解。利用SDS法提取的
总RNA也出现28S和18S两条带，但质量不高。而
利用Trizol试剂却不能从紫叶李叶片中提取出完整
的总RNA，这可能是由于色素分子的干扰造成的。
因为在沉淀RNA之前，尽管氯仿 /异戊醇多次抽
提，但上清液仍显现粉红色，加入异丙醇和RNA沉
淀剂后，几乎看不到沉淀。
2.2RNA样品纯度和得率
取3μlRNA样品用DEPC水稀释到3ml后，用
紫外分析法检测RNA浓度，测得RNA紫外光吸收
值，每个波长重复测定3次取平均值。用CTAB法提
取的总RNA的A260/A230与A260/A280的值分别为2.04
和1.93，得率是每克叶片能够分离到大约141μg总
RNA(表1)。说明采用该方法提取的RNA基本排除
了色素、多糖、多酚和蛋白质等物质的污染，纯度较
高，获得的RNA产量也较高。而利用SDS法提取的
总 RNAA260/A230与 A260/A280的值分别为 1.76和
1.89，得率仅为53μg·g-1·FW-1。因此，采用CTAB法
提取的总RNA为模板进行反转录。
2.3RT-PCR扩增结果
以CTAB法提取的总RNA的反转录产物为模
板进行PCR扩增。PCR所用引物是通过下载的多条
CHS基因序列进行比对设计出的简并引物。PCR产
物用1%琼脂糖凝胶电泳进行分离鉴定，结果出现一
图1紫叶李的总RNA电泳图
注:泳道1为CTAB法提取;泳道2为SDS法提取;泳道3为
Trizol法提取
Figure1ElectrophoresisoftotalRNAfromPrunuscerasifera
Note:Lane1:TotalRNApreparatedbythemethodofCTAB;
Lane2:TotalRNApreparatedbythemethodofSDS;Lane3:
TotalRNApreparatedbythemethodofTrizol
提取方法
Methods
CTAB法
CTABmethod
SDS法
SDSmethod
A230
0.0069
0.0030
A260
0.0141
0.0053
A280
0.0073
0.0028
吸光度比值
Absorbanceratios
A260/A280 A260/A230
1.93 2.04
1.89 1.76
RNA回收率(μg.g-1.FW-1)
Yield
141
53
表1RNA样品的纯度和得率
Table1TheyieldandqualityofRNAsample
723
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
条约1.0kb的条带，与预期的片段大小一致(图2)。将
目的DNA片段回收后与载体pMD-18T载体连接、
转化筛选，对筛出的阳性克隆进行测序。测定结果获
得1001bp的cDNA片段。将该片段序列在Genbank
中Blast，结果发现与已报道的CHS序列有较高的同
源性，说明已经正确分离到紫叶李CHS基因片断，基
因的登录号为DQ856583。这进一步说明该方法提取
的RNA质量较高，可以满足在分子水平上对紫叶李
开展的进一步研究。
李的叶片中提取出高质量的RNA，这可能是因为紫
叶李的叶片中富含花色素苷物质、碳水化合物和其
它一些次生代谢物质。这些物质可与RNA相互作
用，形成不溶于水相的复杂混合物，在抽提过程中
RNA可与这些物质共聚合而损耗，从而影响RNA
的提取量和质量。可见尽可能早的去除色素、多糖等
物质的干扰是提取紫叶李总RNA的关键。
本实验采用的改良CTAB法建立了两次沉淀，
先用LiCl4℃过夜选择性沉淀RNA，这时色素分子
基本被去除，降低了其对RNA的干扰，同时也去除
了部分多糖、蛋白质，这是紫叶李叶片提取RNA的
关键步骤之一；然后SSTE回溶沉淀，沉淀有点粘，说
明仍有多糖存在。高浓度醋酸钾和低浓度无水乙醇
可用来沉淀多糖，但去除多糖的过程中也增加了
RNA的损失。正如本实验的改良SDS法中采用高浓
度醋酸钾冰浴 30min来沉淀多糖，这可能是导致
RNA获得率较低的原因之一。而改良CTAB法中利
用异丙醇和 RNA沉淀剂在室温下短时间内沉淀
RNA，成功地将多糖分子留在上清液中，与RNA完
全分离，最终获得的RNA纯度和完整性都较高。这
种两步沉淀法比较适合于富含花色素苷物质的材料
提取RNA，这一点在瓜叶菊、车矢菊等花卉植物上有
类似的报道(孟丽等,2006)。另外，为防止酚类氧化，
在提取过程中加入抗氧化剂，β-巯基乙醇和聚乙烯
吡咯烷酮(PVPP)，β-巯基乙醇是强的还原剂，它提
供还原条件使得多酚类物质不易氧化，PVPP作为多
酚化合物的鳌合剂具有很强的结合酚的能力，在液
氮研磨时加入PVPP，有效的抑制了细胞破碎时酚类
物质的氧化。
本研究利用的几种 RNA提取方法中，改良
CTAB法实验成本较低，试剂配制简单，更突出的是
操作简便，获取的RNA质量高，可为其它多酚、多糖
和次生物质含量高的植物总RNA提取提供参考。
致谢
本研究由河北农业大学校基金及河北省林业局
项目(0209218)资助。
参考文献
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明姝,戴思兰,2006,一种有效的花瓣总 RNA的提取方
法,生物技术,16:38-40)
3讨论
制备完整的、纯度高的RNA是合成高质量cD-
NA的关键因素。因此总RNA的提取是实验顺利开
展的基础步骤，好的方法至关重要。一般说来，当
RNase的活性受到抑制时才能从植物组织中提取到
高质量的RNA。但是RNase广泛存在且非常稳定，
因此，提取RNA要比提取DNA困难得多。已报道的
植物RNA提取方法众多，如异硫氰酸胍一步法、苯
酚法、Trizol法、SDS法及CTAB法等等。但不同植
物或同一植物的不同品种往往因种质的差异、材料
内含物组分及含量有很大的不同，而需要采用不同
的RNA提取方法(张玉进等,2001;夏海武等,2006)。
不论使用哪种方法，都要设法抑制RNase的活性，尽
可能减少RNA的降解，以提取高质量的RNA。然
而，从试验中发现使用Trizol法、SDS法很难从紫叶
图2CHS的3RT-PCR产物及重组质粒酶切产物的琼脂唐凝
胶电泳
注:泳道1为DNAMarkerDL2000;2为PCR产物(a)及质粒
的酶切产物(b);(a)RT-PCR产物,(b)酶切结果
Figure2AgarosegelelectrophoresisofproductfromRT-PCR
andrecombinantplasmidbyrestrictionenzyme
Note:Lane1DNAMarkerDL2000;Lane2productfromRT-PCR
(a)andproductrecombinantplasmidbyrestrictionenzyme(b);(a)
ProductfromRT-PCR,(b)Productrecombinantplasmidbyrestric-
tionenzyme
724
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紫叶李叶片总RNA提取方法的改进与比较
ModificationandComparationofTotalRNAExtractionMethodsfromPrunuscerasiferaLeaves
(上接第720页)
RayWu,ProfessorofMolecularBiology
RobertoTuberosa,Prof.ofBiotechnology
SukhpalSingh,PlantBreedingScientist
SusanMcCouch,AssociateProfessor,PlantGenomics
Wanggen,Zhang,SeniorScientist
XingwangDeng,PrincipalInvestigator,
YulinJia,ResearchPlantPathologist
中国组委会成员
李平博士，李杨瑞博士，刘耀光博士，柳参奎博士，罗
达博士，马正强博士，钱前博士，施季森教授，万建民
博士，吴为人博士，薛红卫博士，张爱民博士，张桂权
博士，朱玉贤博士，朱祯教授
组委会执行委员
方宣钧博士，黎志康博士
7主题组织者及特邀报告
(一)应用植物基因组学：从基因组走向大田
Organizer:R.TuberosaandQifaZhang
Speakers:HenryNgyen;ChristianJung
(二)分子标记与植物育种：一种整合
Organizer:ZhikangLi,CAAS&IRRI
Speakers:JMRibaut;M.Yano;SusanMcCouch
(三)植物育种中新型的分子工具和技术
Organizer:Wu,Kunsheng,MonsantoCo.
(四)转基因新技术、产品及其市场
Organizer:Dr.Zhang,Wanggen,MonsantoCo.
Speakers:RayWu
(五)设计育种：基因发现和性状改良的连接
Organizer:Dr.MarkJ.vanHaaren,KeygeneN.V.
(六)转基因植物中知识产权的问题
Organizer:DrXingwangDeng
8大会语言为英语
9会议时间、地点
2007年3月23日 报到
2007年3月24-26日 会议
2007年3月27日 离会
10会议论文及其摘要
会议论文全文和摘要提交方法及会议论文集收录
具体方法请登陆本届会议网站：www.icpmb.org
11联系方式
会务组联系方式(北京)：
联系地址：北京市海淀区知春路49号希格玛公寓B1601
邮 编：100080
电 话：010-62556198，传 真：010-88099388
E-mail：mpbhn@vip.sina.com，联系人：李迪女士
会务组联系方式(海南)：
联系地址：海南省海口市海秀中路107号北岸青年
公寓507室，邮 编：570206
电 话：0898-68966415，传 真：0898-68958180
E-mail：icpmb2007@hitar.org，联系人：吴海兰女士
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