全 文 ：第 4 期 杨 华，等:GaCl3 催化胺与碳二亚胺的加成反应合成胍的研究
第 27 卷第 4 期
2015 年 4 月
化 学 研 究 与 应 用
Chemical Ｒesearch and Application
Vol． 27，No． 4
Apr．，2015
文章编号:1004-1656(2015)04-0435-06
聚酰胺 -大孔树脂纯化海棠花中总黄酮及
其抗肿瘤活性研究
卫 强* ，徐 飞，邱 镇，纪小影
(安徽新华学院药学院，安徽 合肥 230088)
摘要:采用聚酰胺-大孔树脂联用技术纯化海棠花总黄酮成分，检测总黄酮对小鼠 S-180 肉瘤的抑制作用。选
择提取液-聚酰胺(g /g，1∶ 1)拌匀，低温烘干，加入 NKA-9 大孔树脂柱，树脂-提取液(g /g，10∶ 2)上柱(柱径高
比 1∶ 10) ，以水洗脱至无色，再以 60%乙醇洗脱，洗脱液收集量为 10BV，总黄酮纯度达 85. 96%。海棠花总黄
酮体外抗肿瘤活性显示，当剂量为 50mg·kg －1时，抑瘤率达 44. 28%，并可显著提高小鼠的胸腺指数和脾脏指
数。
关键词:海棠花;SFE-CO2 萃取总黄酮;聚酰胺-大孔树脂联用;抗肿瘤
中图分类号:Ｒ284 文献标志码:A
Study on purifying total flavones from malus halliana koehne with
polyamide and macroporous resin and their antitumor activities
WEI Qiang* ，XU Fei，QIU Zhen，JI Xiao-ying
(Pharmacology college，Anhui XinHua University，Hefei China，230088)
Abstract:Purification process of total flavones from malus halliana with polyamide and macroporous resin was studied and their an-
titumor activities were inspected. The results indicated that the optimal technology was as follows:taking 1∶ 1 of extract solution to
polyamide ratio(g /g)to be evenly blended，drying it at low temperature and adding the polyamide at the top of a NKA-9 macro-
porous resin glass column with 1∶ 10 of diameter and height ratio，taking 10∶ 2 of extract solution to resin ratio(g /g)as the resin dos-
age，eluting it with distilled water to colorless，then eluting by 60% ethanol，collecting 10BV as the eluent volume. The results indi-
cated the percentage content of flavones in the purified sample reached 85. 96%. The antitumor activity of flavones in vitro showed
tumor inhibition rate of median dose group of(50mg·kg －1)flavones reached 44. 28% . Flavones improved significantly the thymus
and spleen indexes in mice with sarcoma-180 during the course of inhibiting the growth of tumor.
Key words:malus halliana koehne;total flavones extracted by SFE-CO2;combination macroporous resin with polyamide;antitumor
黄酮类化合物泛指两个苯环通过中央三碳原
子相互连接而成的一系列化合物［1］。现代研究表
明，黄酮对多种肿瘤细胞具有抑制作用，如毛地黄
黄酮、香泽兰叶中黄酮可分别抑制肝癌细胞
HepG2、HL-60 细胞的增殖［2-4］。芹黄素、荛花根总
黄酮可分别抑制 B16-BL6 小鼠黑色素瘤、C57BL6
收稿日期:2014-07-15;修回日期:2015-01-05
基金项目:国家大学生创新创业训练项目(201412216008，201412216009)资助;安徽省大学生创新创业训练项目(AH201412216010)
资助
联系人简介:卫强(1977-) ，男，副教授，主要从事天然活性产物研究。E-mail:weiqiang509@ sina. com
化 学 研 究 与 应 用 第 27 卷
小鼠肺癌细胞的生长和转移［5-6］。黄芩中黄酮提
取物可使荷瘤小鼠肿瘤体积能减小 66%［7］。黄芩
素-7-O-葡萄糖苷可明显延长艾氏腹水癌荷瘤小鼠
的生存期［8］。
垂丝海棠(Malus halliana koehne)在我国广泛
分布于我国华东、西南地区，其花入药能调经和
药，治崩漏［9］。超临界二氧化碳(Supercritical Flu-
id Extraction-CO2，SFE-CO2)萃取技术是近年来发
展起来的新型提取分离技术，具有能耗小、效率
高、无污染、温度低、易控制等优点［10-12］，适用于不
稳定产物和活性物质的精制与分离。本文对海棠
花 SFE-CO2 萃取液中总黄酮类成分进行聚酰胺-
大孔树脂联用纯化工艺研究，并对其总黄酮成分
抗肿瘤活性进行初步研究，以期发现新的抗癌活
性部位。
1 实验部分
1. 1 材料与仪器
HA221-50-01 型超临界二氧化碳萃取设备(江
苏南通华安超临界有限公司)，UV-2600 型紫外-可
见分光光度仪(UNICO 上海有限公司) ，DY-BTW
型电子天平(上海东圆实业有限公司) ;海棠花采
自合肥市大蜀山地区，经安徽新华学院刘金旗副
教授鉴定为蔷薇科苹果属垂丝海棠(Malus halli-
ana koehne)的干燥花;芦丁标准品(中国药品生物
制品检定所，批号 100080-200707)，所用试剂均为
分析纯，水为蒸馏水。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 对照品溶液的制备和标准曲线的绘制
精密称定经 65℃干燥至恒重的芦丁标准品 20mg，
溶解后以甲醇定容于 50mL 容量瓶中。精密移取
芦丁标准品溶液 0. 5mL、1mL、2mL、3mL、4mL、
5mL，各自置于 25mL 容量瓶中，分别加蒸馏水至
6mL，加 1mL 5% NaNO2 溶液，摇匀，放置 5min，加
1mL 10%Al(NO3)3 溶液，摇匀，放置 5min，加 2%
NaOH溶液 10mL，加水至刻度，摇匀，放置 15min。
按照以上操作，以相应空白试剂配置参比溶液，在
波长 510nm处经紫外-可见分光光度计测定吸光
度，以吸收度(A)为纵坐标，浓度(C)为横坐标，得
线性回归方程为 A = 0. 010 23C + 0. 009 18，γ =
0. 999 2，线性范围为 8. 0 － 80. 0μg·mL －1。
1. 2. 2 供试品溶液的提取及含量测定 精密称
取海棠花粗粉 20g三份，一份以 SFE-CO2 萃取，设
定萃取温度为 35℃，萃取压力为 20MPa，CO2 流量
为 20kg·h －1，加入夹带剂为 80%乙醇 400mL 萃取
120min，收集萃取液。一份加入 80%乙醇 150mL
回流提取 3 次，每次 60min，抽滤，合并滤液。一份
加入 80%乙醇 150mL超声提取 3 次，每次 40min，
抽滤，合并滤液。将上述三种提取液浓缩至
150mL，精密量取 5mL，水浴蒸干，以 50mL 水溶
解，加入石油醚 50mL 萃取 3 次，合并水液，取
0. 5mL置 25mL容量瓶中，按照 1. 2. 1 项下测定含
量。
1. 2. 3 大孔树脂预处理 取 X-5、D101、AB-8、
HPD100、NKA-9 型大孔树脂适量，以 95%乙醇浸
泡 24h，以 95%乙醇洗脱至洗脱液与水(1∶ 5)没有
浑浊，洗脱好的大孔树脂中应继续加入蒸馏水洗
脱，直至流出液澄清且不再有乙醇的味道即可。
低温干燥至恒重，备用。
1. 2. 4 聚酰胺乙醇洗脱浓度选择 精密吸取
SFE-CO2 提取液 2g，加入 2g 聚酰胺拌匀，低温烘
干，移入玻璃柱(2cm × 20cm)中，依次以水，20%，
40%，60%，80%，100%乙醇洗脱，分别收集洗脱
液 200mL，测定含量，低温烘干至恒重，计算总黄
酮纯度和收率［8］。
1. 2. 5 聚酰胺量的选择 精密量取 SFE-CO2 萃
取液 0. 25g、0. 5g、1 g、2g、3g、4g，分别加入 2g 聚酰
胺，拌匀，低温烘干，移入玻璃柱(2cm × 20cm)中，
以 500mL 水洗脱后，再以 60% 乙醇洗脱洗脱至
200mL，测定含量，低温烘干至恒重，计算总黄酮纯
度和收率。
1. 2. 6 树脂型号筛选 精密称定 X-5、D101、AB-
8、HPD100、NKA-9 型大孔树脂各 10 g，分别以蒸
馏水装柱(2cm × 30cm)。精密吸取 SFE-CO2 萃取
液 2 g，加入 2g 聚酰胺拌匀，低温烘干，以水洗脱
至无色，再置于前面树脂柱上端。以水洗脱，再以
60%乙醇洗脱至 200mL，测定含量，低温烘干至恒
重，计算总黄酮纯度和收率。
1. 2. 7 树脂洗脱剂浓度的选择 精密称定经预
处理的 NKA-9 型树脂 10g 以蒸馏水装柱(2cm ×
30cm)。精密吸取 SFE-CO2 萃取液 2g，加入 2g 聚
酰胺拌匀，低温烘干，以水洗脱至无色，置于前面
树脂柱上端。以水洗脱，再以 20%、40%、60%、
80%、100%乙醇洗脱至 200mL，测定含量，低温烘
干至恒重，计算总黄酮纯度和收率。
634
第 4 期 卫 强，等:聚酰胺-大孔树脂纯化海棠花中总黄酮及其抗肿瘤活性研究
1. 2. 8 总黄酮纯化工艺正交试验设计 以提取
液-聚酰胺(g /g，1∶ 1)吸附，低温烘干后，上柱。以
NKA-9 型树脂，选择树脂-提取液比例、柱径高比、
洗脱液收集量 3 个因素，设置 3 个水平，按照 L9
(34)设计因素水平进行正交试验。计算总黄酮纯
度。
1. 2. 9 对小鼠 S-180 肉瘤的抑制作用［13］ 选择
接种后 7d 健康的 S180 种鼠，颈椎脱臼，固定于蜡
板上，腹部皮肤消毒后，剪开并剥去腹部皮肤，用
空针穿过腹部肌肉，无菌获取的腹水，以生理盐水
稀释成肿瘤细胞悬液(浓度 106 个 /L)。在每鼠右
后背部接种 0. 1mL，24h后将小鼠随机分成阴性对
照组、环磷酰胺阳性对照组(25mg·kg －1)、海棠花
总黄酮三个剂量(100、50、25mg·kg －1)组，共 5 组，
每组 10 只。每日称重后，按 0. 1mL /10g 腹腔注
射，每天给药 1 次。14d 后脱颈椎处死小鼠，根据
瘤块计算抑瘤率，根据胸腺和脾脏计算脏器指数。
计算公式如下:
脏器指数 =脏器重量 /体重
肿瘤抑瘤率 =(1-给药组平均瘤重 /对照组平
均瘤重)× 100%
用 SPSS18. 0 统计软件统计数据，组间比较采
用 Cochran＆Cox 近似 t 检验。P ＜ 0. 01 表示有显
著性差异，P ＜ 0. 05 表示有显著性差异。
2 结果与分析
2. 1 供试品溶液的制备及含量测定
海棠花中总黄酮超声波法、回流法和 SFE-
CO2 提取工艺结果见表 1。
表 1 不同提取方法下的海棠花中总黄酮含量比较(n = 3)
Table 1 Comparison of total flavones yield in
three extracting methods(n = 3)for malus halliana
由表 1 可知，SFE-CO2 提取工艺下的海棠花
总黄酮含量最高(92. 4mg·g －1)，且溶剂用量、提取
时间、提取次数最低，故选择 SFE-CO2 萃取液作为
纯化工艺研究对象。
2. 2 聚酰胺乙醇洗脱浓度考察
聚酰胺对海棠花 SFE-CO2 萃取液中总黄酮的
纯化工艺中乙醇浓度的考察结果见表 2。
表 2 聚酰胺乙醇洗脱浓度考察
Table 2 Effects of ethanol concentration in polyamide purifying craft
由表 2 可知，水和 100%乙醇洗脱液中总黄酮
收率较低，说明杂质含量高，黄酮含量低;20% -
80%乙醇洗脱液中总黄酮纯度和收率之和分别为
32. 87%、92. 55%;水和 100%乙醇洗脱液总黄酮
纯度和收率之和分别为 0. 83%、2. 68%。可见，
20% -80%乙醇洗脱液总黄酮富集作用显著。综合
考虑干浸膏得率和总黄酮收率显著性，选择 60%
乙醇洗脱较好。
2. 3 聚酰胺用量的选择
利用不同比例提取液-聚酰胺(g /g)装柱后，
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化 学 研 究 与 应 用 第 27 卷
测定固体量、总黄酮量、总黄酮纯度，结果见表 3。
表 3 聚酰胺纯化中聚酰胺用量选择
Table 3 Effects of polyamide dosage in
polyamide purifying craft
由表 5 可知，随着提取液体积的增加，干浸膏
和总黄酮量逐步增加，而总黄酮纯度却出现先增
加后降低的趋势，当提取液-聚酰胺(g /g，1∶ 1)时，
总黄酮纯度达到最高的 63. 71%。这种结果可能
是提取液体积过小，吸附量大，吸附紧密，不易被
洗脱下来。随着提取液体积增加，扣除死体积后，
洗脱效果明显增强。但当提取液量过大时，超过
聚酰胺吸附能力，出现渗漏，洗脱效果降低。
2. 4 树脂型号筛选
比较了 X-5、D101、AB-8、HPD100、NKA-9 型
大孔树脂对海棠花 SFE-CO2 萃取液中总黄酮的纯
化工艺，结果见表 4。
表 4 树脂筛选结果
Table 4 Ｒesults of resin selection
由表 4 可知，5 种不同型号树脂中以 NKA-9
型与 HPD-100 树脂分别在总黄酮量和总黄酮收率
方面差别不大，但考虑到 NKA-9 型树脂总黄酮纯
度较高，有利于富集成分，可以作为进一步纯化工
艺优选对象。
2. 5 树脂中乙醇洗脱浓度的选择
以 NKA-9 型树脂为研究对象，以 20%、40%、
60%、80%、100%乙醇为洗脱剂，测定总黄酮量、
总黄酮纯度和总黄酮收率，结果见表 5。
表 5 树脂中乙醇洗脱浓度的选择
Table 5 Effects of ethanol concentration in resin purifying craft
由表 4 可知，从 20% -100%乙醇对 NKA-9 型
树脂的总黄酮洗脱效果来说，40% -80%乙醇总黄
酮量、纯度和收率酮洗脱效果较好，总黄酮纯度和
收率之和分别为 77. 23%、85. 95%。结合聚酰胺
纯化工艺中乙醇洗脱浓度考察结果，最后选定
60%乙醇作为洗脱剂。
2. 6 总黄酮纯化工艺正交试验及工艺验证
正交试验设计见表 6，结果见表 7，工艺方差
分析见表 8。
表 6 总黄酮纯化工艺正交试验因素水平
Table 6 Factors and levels in orthogonal test
of total flavones purifying craft
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第 4 期 卫 强，等:聚酰胺-大孔树脂纯化海棠花中总黄酮及其抗肿瘤活性研究
表 7 总黄酮纯化工艺正交试验结果
Table 7 Experimental design and results in orthogonal
test of total flavones purifying craft
表 8 总黄酮纯化工艺正交试验方差分析(a = 0. 1)
Table 8 Variance analysis in orthogonal test
of total flavones purifying craft
由表 7 可知，树脂对总黄酮纯化最佳工艺条
件为:树脂-提取液(g /g，10 ∶ 2) ，色谱柱径高比 1 ∶
10，洗脱液收集量为 20BV。从纯化效果、节约溶
剂、降低成本三个方面考虑，A2B1C2 具有最大总黄
酮纯度为 84. 89%，其洗脱液收集量为 10BV，故选
择洗脱液收集量为 10BV。由极差 Ｒ 可知，影响提
取的因素大小是 B ＞ A ＞ C，即色谱柱径高比影响
较大，树脂-提取液(g /g)、洗脱液收集量比例次
之。由表 8 可知，色谱柱径高比在纯化工艺中有
较显著差别(P ＜ 0. 1)。
以上述优化条件，连续纯化 3 批海棠花 SFE-
CO2 提取液中总黄酮，得到 3 批总黄酮纯度分别
为 86. 20%，85. 62%，86. 05%，X = 85. 96%(ＲSD
= 0. 35%)。表明本工艺稳定性良好。
2. 7 海棠花总黄酮对小鼠 S-180 肉瘤的抑制作用
连续给药 14d 后，各组荷瘤鼠的瘤重、抑制率
见表 9。
表 9 海棠花总黄酮对小鼠 S-180 肉瘤生长及免疫器官指数的影响(x ± s，n = 10)
Table 9 Effects of total flavones on tumor growth rate and immune organs in sarcoma-180 mice(x ± x，n = 10)
注:与阴性对照组相比，aP ＜ 0. 05，bP ＜ 0. 01;与环磷酰胺组比较，△△P ＜ 0. 01
由表 9 可知，海棠花总黄酮 3 个剂量组对小
鼠肉瘤 S-180 抑制效果不同，以中剂量(50mg·
kg －1)组抑瘤效应最高，可达 44. 28%(P ＜ 0. 01)。
三个剂量组在体重增加值上与环磷酰胺组比较均
有极显著性差异(P ＜ 0. 01)。与阴性对照组相比，
环磷酰胺组使荷瘤鼠胸腺指数和脾脏指数显著降
低(P ＜ 0. 01)。与环磷酰胺相比，海棠花总黄酮 3
个剂量组使荷瘤鼠胸腺指数和脾脏指数显著增
加，增加值与药物剂量成正相关。当达到最大剂
量(100mg·kg －1)时，脾脏指数明显高于阴性对照
组(P ＜ 0. 05)。
3 结 论
本实验比较了超声波法、回流法和 SFE-CO2 萃
取三种不同方法提取海棠花总黄酮的效果，结果
SFE-CO2 萃取的总黄酮含量为 92. 4mg·g
－1，高于回
流和超声波提取的总黄酮含量(分别为 51. 8mg·g －1
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化 学 研 究 与 应 用 第 27 卷
和 62. 2 mg·g －1)，且溶剂用量少，提取时间短，提取
次数少。
聚酰胺对黄酮的吸附作用原理为氢键吸附，
聚酰胺对叶绿素及其他脂溶性成分吸附性弱，而
对极性较强的化合物呈现强吸附性，可借此除去
一部分杂质，减轻对大孔树脂的污染;大孔树脂吸
附的原理为分子筛和吸附作用，经过聚酰胺初分
后的成分再经大孔树脂分离可显著提高黄酮的纯
度［14］。聚酰胺-大孔树脂联用对海棠花 SFE-CO2
萃取液中总黄酮的最佳纯化工艺为:选择提取液-
聚酰胺(g /g，1∶ 1)吸附，低温烘干，上柱，以水洗脱
至无色，再置于 NKA-9 型树脂柱上端，树脂-提取
液(g /g，10∶ 2)上柱(柱径高比 1 ∶ 10)，以水洗脱，
再以 60%乙醇洗脱，洗脱液收集量为 10BV，总黄
酮纯度达 85. 96%。通过海棠花 SFE-CO2 萃取液
中总黄酮纯化后抗肿瘤活性实验研究，三个剂量
(100、50、25mg·kg －1)组均具有抑瘤活性，其中中
剂量(50mg·kg －1)组抑瘤效应最高，达 44. 28%。
三个剂量组均可使荷瘤鼠胸腺指数和脾脏指数显
著增加，显示海棠花总黄酮抑瘤同时，没有免疫抑
制副作用。
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(责任编辑 罗 娟)
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